Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC). Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.
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Artículo de método
Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica
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Resumen
Resumen
La preparación de secciones oculares de ratón de alta calidad para la inmunohistoquímica (IHC) es fundamental para evaluar la estructura y la función de la retina y para determinar los mecanismos subyacentes a las enfermedades de la retina. Mantener la integridad estructural en toda la preparación del tejido es vital para obtener datos reproducibles de IHC de la retina, pero puede ser difícil debido a la fragilidad y complejidad de la citoarquitectura de la retina. Los fijadores fuertes como el 10% de la formalina o la solución de Bouin preservan de manera óptima la estructura de la retina, a menudo impiden el análisis de IHC al mejorar la fluorescencia de fondo y/o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, un proceso conocido como enmascaramiento de epítopos. Los fijadores más leves, por otro lado, como el 4% de paraformaldehído, reducen la fluorescencia de fondo y el enmascaramiento de epítopos, se deben utilizar técnicas de disección meticulosas para preservar la estructura de la retina. En este artículo, presentamos un método integral para preparar vasos posteriores oculares de ratón para IHC que es suficiente para preservar la mayoría de las interacciones entre anticuerpos y epítopos sin pérdida de integridad estructural de la retina. Incluimos IHC representativo con anticuerpos a varios marcadores de tipo célula de la retina para ilustrar la preservación y orientación del tejido en condiciones óptimas y subóptimas. Nuestro objetivo es optimizar los estudios IHC de la retina proporcionando un protocolo completo de la disección ocular posterior de la copa a IHC.
Introducción
La inmunohistoquímica (IHC) es una poderosa técnica para localizar proteínasespecíficas y estructuras celulares en tejidos in situ 1,2,3. Los métodos de fijación inapropiados y la sección subóptima de tejidos complejos pueden alterar la estructura tisular, generar manchas de fondo alto o disminuir las interacciones entre anticuerpos y epítopos, lo que resulta en artefactos de tinción y la consiguiente interpretación errónea de Datos IHC4. Como la retina vertebrada es un órgano neural complejo y altamente organizado compuesto por estratos de fotorreceptores interconectados, interneuronas y células ganglionares, es muy frágil y puede ser fácilmente interrumpida durante la disección y seccionamiento. Un protocolo detallado, estandarizado y validado desde la disección de ojos del ratón y la orientación hasta la inmunomancha ayudará a reducir significativamente los artefactos IHC, aumentando así la fiabilidad de los resultados y permitiendo datos comparativos más precisos Análisis.
Hay muchos protocolos para la preparación de tejidos para IHC, sin embargo, no todos son adecuados para el tejido de la retina. Fijadores fuertes como 10% de formalina o solución de Bouin preservan la estructura de la retina durante la disección y seccionamiento5. Desafortunadamente, los fijadores fuertes a menudo conducen a la fluorescencia de fondo mejoraday el enmascaramiento de epítopos debido a la modificación química de los epítopos 6. Por otro lado, fijadores más suaves, como 4% paraformaldehído (PFA) pueden aliviar algunos de estos artefactos, pero requieren disección meticulosa y seccionamiento para preservar la estructura óptima de la retina. La PFA penetra rápidamente en el tejido, pero relatifica las proteínas muy lentamente, reduciendo el riesgo de enmascaramiento de epítopos. Dado que la incubación de PFA de poco tiempo es una fijación relativamente leve, los tejidos a menudo requieren una congelación rápida para preservar los antígenos. Es importante evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación de tejidos, ya que distorsionan y dañan la integridad de las células y tejidos7.
Aquí describimos protocolos detallados y estandarizados para la disección, fijación y crioprotección de copas posteriores oculares de ratón que producen datos De IHC consistentes y confiables.
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio proporcionada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.
Todas las herramientas y equipos para los métodos se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de materiales.
1 . Enucleación del ojo del ratón, disección de la copa del ojo, y la incrustación
- Ratones eutanasiados con dióxido de carbono (CO2) seguidos de decapitación (ratones postnatales P0 - P11) o luxación cervical (adultos > ratones P11). Para ratones P0-P14, los ojos están cubiertos por la piel. Asegúrese de retirar la piel antes de los pasos posteriores.
- Marque la parte temporal del ojo (Figura2A)quemando ligeramente la córnea usando un cauterizador de cola. Evite quemar un agujero en la córnea tocando la córnea muy ligeramente y durante no más de una fracción de segundo con el cauterizador.
- Inmediatamente enuclea los ojos del ratón usando #5 Dumont curvado/45 fórceps. Incubar durante 15 minutos en un tubo criotubo de 1,5 ml con 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo.
- Después de 15 minutos en 4% pfa, transfiera el ojo fijo utilizando los fórceps curvos Dumont #5/45 a una placa de disección modificada de 35 mm (ver Tabla de Materiales y Figura 1C)llena de PBS y colóquela bajo el microscopio de disección.
- Hacer una pequeña incisión en la marca de quemadura, perpendicular y justo por encima del limbo (borde de la córnea) usando el micro cuchillo.
- Inserte las tijeras curvas en la incisión y realice un corte circunferencial de la córnea después del limbo (Figura 2B).
- Retire la córnea y extraiga la lente con un Dumont delgado #5 fórceps, (Figura2B)y levántela delicadamente de la parte posterior del ojo. El cuerpo vítreo, el gel transparente que llena el espacio entre la lente y la retina, saldrá con la lente (Figura2B)y la retina será visible como una superficie blanca que cubre el interior de la copa ocular posterior. Asegúrese de que no haya ningún daño visible a la retina, como agujeros o desgarros (Figura2C).
- Lave los vasos oculares dos veces en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Cryoprotect los vasos oculares equilibrando en una solución de 15% de sacarosa en PBS durante la noche a 4oC hasta que el ocular se hunda
- Transfiera los vasos oculares a una sacarosa del 30% en PBS durante 2-3 h hasta que la copa del ojo se hunda.
- Incruste los oculares en OCT en criomoldes de 10 x 10 mm (Figura3A). Usando un microscopio de disección, oriente el ojo en el criomold a lo largo de su eje dorsal-ventral (Figura2D, Figura 3A) girando el ojo hasta que la marca de quemadura esté en la parte superior, el nervio óptico esté a la izquierda y la parte recortada del molde se dirija hacia la derecha ( Figura 2D). Tenga cuidado de evitar burbujas cerca del tejido.
NOTA: Para manipular la copa del ojo, utilice una sonda de titanio hecha de un alambre de titanio unido a una punta de pipeta. - Para congelar a presión el tejido de la retina, sumerja el criomold durante al menos 5 minutos en un vaso de precipitados metálicos que contenga isopentano y coloque el vaso de precipitados en nitrógeno líquido o en el baño de etanol seco/100% (hasta 1/3 de la altura del vaso de precipitados metálicos).
NOTA: El criomold debe sumergirse en isopentano a más de la mitad de su altura, pero no tiene que estar completamente sumergido. - Retire el bloque congelado y envuélvalo en papel de aluminio.
- Conservar a -80oC.
- Marque el bloque congelado con un lápiz o un punzón para registrar la orientación del bloque (Figura3B).
2 . Seccionamiento con un criostato
- Después de ajustar la temperatura del criostato (entre -20 y -25 oC), permita que los moldes que contienen los vasos oculares incrustados se equilibren a la temperatura del criostato durante 1 h.
- Instale el bloque con orientación dorso-ventral (Figura3C)y corte secciones seriales de 10 m de espesor. Coloque cuidadosamente las secciones de la retina en diapositivas de microscopio anotadas y numeradas.
- Almacene las diapositivas en cajas deslizantes a -20 oC o -80 oC hasta los procedimientos de IHC.
3 . Inmunomanchado de fluorescencia con el rack deslizante
NOTA: El sistema Slide Rack (p. ej., Sequenza) sostiene las guías del microscopio de vidrio con una placa de cubierta, creando un espacio capilar de 100 l entre la corredera y la placa.
- Descongelar las criosecciones a temperatura ambiente (RT) durante 2 h a 4 h para permitir que se sequen y se adhieran a los portaobjetos del microscopio.
NOTA: También es posible secarlos a 30-37 oC durante 30 min a 1 h. - Coloque los portaobjetos en el portaobjetos y lave las secciones de la retina dos veces en 100-200 l de PBS durante 2 min.
- Permeabilizar las secciones de la retina incubando en 0.25% Tritón-X / 0.05% NaN3en PBS durante 5 min a RT.
- Añadir 100 sl de solución de bloqueo a las diapositivas.
- Añadir 100 s de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a las diapositivas.
- Incubar secciones de retina durante la noche a 4 oC.
NOTA: Durante este tiempo, cubra el portaobjetos para evitar la desecación de las secciones. - Lavar las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 200 s de PBS.
NOTA: La adición de 0.001- 0.002% Triton-X100 a PBS (PBS-T) permite un lavado más estricto, pero puede interrumpir algunas membranas y estructuras celulares. - Incubar secciones de retina en anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente durante 1 h a RT. A partir de ahora, protéjase de la luz.
- Lave las secciones de la retina 3 veces, cada una durante 15 minutos.
- Incubar las secciones de retina a RT durante 5 minutos con un marcador nuclear como Hoechst 33342 o solución DAPI.
- Lave las secciones de la retina 1 vez durante 15 min.
- Coloque una cubierta encima de una toalla de papel en el banco de laboratorio.
- Agregue 2 gotas de soporte de montaje antidecoloración al centro de la cubierta.
- Gire la diapositiva para tener la criosección de la retina hacia abajo.
- Monte con cuidado el cubreobjetos lentamente, en un ángulo de 45o, incline la corredera sobre el soporte de montaje.
NOTA: Evitar la formación de burbujas a medida que baja la diapositiva en su lugar. - Aplique una presión uniforme, utilizando un libro o catálogo pesado (ver más abajo), a la combinación de deslizamiento deslizante para eliminar el exceso de medios de montaje.
NOTA: Para garantizar la coherencia en la preparación de la muestra, utilice siempre el mismo objeto (es decir, el mismo libro o catálogo) para aplicar una presión uniforme al cubreobjetos durante el montaje de la diapositiva. - Manténgase plano y deje que se endurezca durante la noche en RT en la oscuridad. Almacene los portaobjetos planos a 4oC indefinidamente.
- Imagen mediante campo ancho o microscopía de fluorescencia confocal (Figura4).
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Resultados
Para ilustrar cómo estos protocolos, aseguran una preservación óptima de la retina para IHC, sondeamos secciones de retina de ratones P28 WT (C57BL/6N) con anticuerpos contra la rodopesina (un marcador de fotorreceptor)8, ácido glutámico descarboxilasa 65 (Gad65, una célula de amacrina 9, glutamina sintetasa (GS, un marcador de célula de M'ller)10, y calbindina (un marcador de celda horizontal)11
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Discusión
La disección de la retina del ratón es un proceso delicado debido al pequeño tamaño y forma de los ojos del ratón y la fragilidad del tejido de la retina. A pesar de que realizar disección de alta calidad es una cuestión de práctica, tener un protocolo detallado, proporcionar métodos y consejos eficientes es una necesidad para obtener secciones de retina e IHC. Además de los protocolos descritos aquí, hay varios consejos que permiten secciones de retina consistentes de alta calidad que son adecuadas para IHC reproducible...
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Divulgaciones
Sin revelaciones.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de NIH (RO1-GMO97327) y la University Research Foundation (UPenn). Agradecemos especialmente a Svetlana Savina por su ayuda en el desarrollo del protocolo de inmunohistoquímica, Gordon Ruthel (Universidad de Pensilvania) y Penn Vet Imaging Core por su ayuda con la microscopía y Leslie King, Ph.D. por la lectura crítica de este manuscrito .
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vaso de precipitados de acero inoxidable de 6 cuartos (185 x 218 mm) | Gilson | #MA-48 | Para nitrógeno líquido (Figura 1E) |
| Papel de aluminio | |||
| Cauterizador | Bovie | #AA01 | Para marcar la orientación de los ojos (Figura 1A) |
| Pinzas curvas, pinzas Dumont #5/45, dobladas 45 grados | Ciencias de la microscopía electrónica | # 72703-D | Para la enucleación y el mantenimiento del ojo del ratón (Figura 1A) |
| Tijeras curvas, tijeras de resorte Vannas - borde de corte de 2,5 mm | Herramientas de Bellas Ciencias | #15002-08 | Para cortar circunferencialmente la córnea (Figura 1B) |
| Plato | Para la disección de la copa del ojo (Figura 1C) | ||
| Microscopio de disección | Leica, Houston, Estados Unidos | MZ12.5 Micro cuchillos de microscopio estereoscópico | |
| - Mango de plástico | Herramientas de Bellas Ciencias | #10315-12 | Para hacer una pequeña incisión en la marca de la quemadura (Figura 1A) |
| Cera dental rosa | Ciencias de la Microscopía Electrónica | #72660 | Para recubrimiento de plato de disección |
| Slide Rack y cubierta | Ted Pella | #36107 | Para retinal IHC (Figura 1G) |
| Vaso de precipitados de acero inoxidable (89 x 114 mm) | Gilson | #MA-40 | Para baño de isopentano (Figura 1E)Caja |
| espuma de poliestireno | Para enfriador aislado | ||
| Pinzas delgadas Dumont # 5 | Herramientas de Bellas Ciencias | #11254-20 | Para extraer la córnea y extraer el cristalino (Figura 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Ciencias de la Miscroscopia Electrónica | #62534-10 | Molde para |
| < >tampones y re | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Solución | 2% Suero de caballo normal, 1,5% Gelatina de piel de pescado fría (al 40-50% en H2O, #G7765 de gato), 5% de albúmina sérica bovina (cat #AK1391-0100) en tampón de permeabilización. | ||
| Gelvatol (medio de montaje antidecoloración) | disuelva 0,337 g de DABCO (Sigma cat #D2522-25G) en 10 ml de Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Ajuste a pH 8-8.5 con 12N HCl (~ 5 gotas). Almacene en una botella de gota ámbar a 4 & grados; C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml en PBS (1000x). Alícuota y almacenamiento en la oscuridad, a 4° C hasta por 1 año o a -20 grados; C para almacenamiento a largo plazo. Preparar fresco a 1 ug/mL (1x) |
| Isopentano, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| (PFA) en ciencias de | microscopía electrónica PBS | #15710 | Preparado fresco 4% PFA a partir de 16% de stock de PFA. Almacene el 16% de PFA restante a 4 grados; C en la oscuridad. |
| de permeabilización | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Prepáralo fresco. | ||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4 , pH 7,4. Preparado a partir de 10x stock |
| Soluciones de sacarosa | Fisher Scientific | #S-5-500 | Disuelva la cantidad adecuada de sacarosa en 37 C PBS (tarda ~15 min en disolverse). Puede almacenarse durante unos días a 4&nb;C. |
| Compuesto Tissue-Tek OCT | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Número de catálogo | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | Para etiquetar células horinzotales |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Para etiquetar GABAcélulas amacrinas érgicas |
| anti-GS | BD Transduction 610517 | Para etiquetar Mü células ller | |
| anti-rodopsina | Millipore MAB5316 | Para etiquetar cañas |
Referencias
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- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
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