Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.
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Artículo de método
Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos
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Resumen
Resumen
Nuestro laboratorio y muchos otros han explotado el alto poder resolutivo de la microscopía electrónica de transmisión para estudiar la morfología y la organización espacial de las vesículas sinápticas. Con el fin de obtener micrografías electrónicas de alta calidad que pueden producir el grado de detalle morfológico necesario para el análisis cuantitativo de la distribución de las vesículas presinápticas, la preparación óptima de la muestra es fundamental. La fijación química es el primer paso en el proceso de preparación de la muestra, y de máxima importancia para preservar la ultraestructura fina. La fijación vascular con una solución de glutaraldehído-formaldehído, seguida por el tratamiento de las muestras seccionadas por vibratome con tetroóxido de osmio, estabiliza el número máximo de moléculas, especialmente las proteínas y los lípidos, y resulta en una conservación superior de ultrestructure. A continuación, el tejido se procesa con antimanchas, deshidratación secuencial e incrustación de resina. La tinción en bloque con acetato de uranil (es decir, tinción de tejido seccionado con vibratome antes de la incrustación de resina) mejora el contraste endógeno y estabiliza los componentes celulares contra la extracción durante el procesamiento de muestras. El contraste se puede aumentar aún más aplicando el acetato de uranil como un post-mancha en las secciones ultrafinas. La doble tinción de secciones ultrafinas con citrato de plomo después del tratamiento con acetato de uranil también mejora la resolución de la imagen, intensificando la opacidad del electrón de las estructuras que contienen ácido nucleico mediante la Unión selectiva del plomo al acetato de uranil. La microscopía electrónica de transmisión es una poderosa herramienta para la caracterización de los detalles morfológicos de las vesículas sinápticas y la cuantificación de su tamaño y organización espacial en el Bouton terminal. Sin embargo, debido a que utiliza tejido fijo, la microscopía electrónica de transmisión solo puede proporcionar información indirecta con respecto a los procesos vivos o en evolución. Por lo tanto, deben tenerse en cuenta otras técnicas cuando el objetivo principal es estudiar aspectos dinámicos o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis.
Introducción
Describimos métodos para la preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta calidad para el análisis morfolométrico en profundidad de la distribución espacial de las vesículas sinápticas en las terminales nerviosas1,2. Los micrográficos de alto contraste que se pueden obtener mediante el procesamiento de especímenes siguiendo estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología detallada de una serie de componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales3,4.
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Protocolo
Todos los estudios fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en la Universidad de Virginia (Charlottesville, VA) y llevados a cabo de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud.
1. fijación por perfusión vascular
Nota: Una descripción general del método para la perfusión vascular cerebral de rata ya se ha detallado en esta revista13 y está fuera del alcance de este protocolo. Sin embargo, los siguientes pasos son específicos para la preparación de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de....
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Resultados
Se han establecido criterios generales que se aceptan en su mayoría como indicativos de preservación satisfactoria o defectuosa de la muestra para TEM. Estos criterios se ejemplifican en cuatro micrografías electrónicas seleccionadas (dos ejemplos de preparación óptima, dos ejemplos de preparación defectuosa) que se obtuvieron al tratar el tejido cerebral de rata joven siguiendo los métodos descritos en este protocolo.
En general, una micrografía electrónica de buena calidad aparece como una i.......
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Discusión
El manejo de las secciones de tejido durante la preparación de la muestra para TEM requiere un grado considerable de delicadeza, concentración y paciencia. Cuando se utiliza una micropipeta para añadir y eliminar soluciones, las muestras se pueden succionar en la punta de la Piera por tensión superficial, por lo que se debe tener un gran cuidado para evitar daños tisulares por la picuta. Además, ciertos pasos de la secuencia de deshidratación pueden ser tan rápidos como 1 minuto, por lo tanto, el operador debe trabajar c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este manuscrito fue apoyado por NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) y por fondos del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Virginia. Los autores desean agradecer a Alev Erisir (Departamento de biología, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA) por su excelente formación y asistencia técnica con TEM, y por su inestimable crítica manuscrita. Los autores también agradecen la instalación de microscopía electrónica avanzada en la Universidad de Virginia para obtener asistencia técnica con la sección de muestras y post-tinción.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tetróxido de osmio al 4% | Electrónica Microscopy Sciences | 19170 | acuoso |
| 50% Glutaraldehído | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 16310 | EM grado, acuoso |
| Aclar 33 C película de inclusión Electron | Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil de espesor, tamaño 8"x10" |
| Soporte de cápsula BEEM | Electron Microscopy Sciences | 69916 | sostiene tamaño "00" cápsulas |
| cápsulas de inclusión BEEM | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 70021 | "tamaño 00, plano (parte inferior cortada)" |
| Recortadora de bloques Butler | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 69945-01 | |
| Pincel de pelo de camello | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 65576-01 | |
| Punzón de disco | Ciencias de la Microscopía Electrónica 77850-09 | ||
| Kit Embed 812 | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 14120 | |
| Acetato | de plomo Ciencias de la Microscopía Electrónica | 17600 | |
| Citrato de plomo | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 17800 | |
| Nitrato de plomo | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 17900 | |
| Leica UC7 micrótomo ultracut | Leica | ||
| Micro escala | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 62091-23 | |
| Paraformaldehído | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19208 | Grado EM, granular |
| Precisión Horno de laboratorio Thelco Thelco | 51221159 | ||
| Azida sódica | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| Pluma StatMark | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72109-01 | |
| Solución Tyrode | Ciencias de la microscopía electrónica | 11760-05 | |
| Acetato de uranilo | Ciencias de la microscopía electrónica | 22400 | polvo |
Referencias
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
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Reimpresiones y permisos
