Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Taylor McFadden; Rishi  K. Devulapalli; Timothy J. Jarome

doi:10.3791/59695

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Artículo de método

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

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DOI:

10.3791/59695

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21 de mayo de 2019

Taylor McFadden¹ , Rishi K. Devulapalli² , Timothy J. Jarome¹^,²

¹Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, ²School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

En este artículo

Resumen

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Resumen

El sistema de ubiquitina-proteasoma es un regulador clave de la degradación de proteínas y una variedad de otros procesos celulares en eucariotas. En el cerebro, los aumentos en la actividad ubiquitina-proteasoma son críticos para la plasticidad sináptica y la formación de la memoria y los cambios aberrantes en este sistema se asocian con una variedad de trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos. Uno de los problemas en el estudio de la ubiquitina-proteosoma funcionamiento en el cerebro es que está presente en todos los compartimentos celulares, en el que las dianas de la proteína, el papel funcional y los mecanismos de regulación pueden variar ampliamente. Como resultado, la capacidad de comparar directamente la orientación a la proteína ubiquitina cerebral y la actividad catalítica proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares dentro del mismo animal es fundamental para comprender completamente cómo el SAI contribuye a la plasticidad sináptica, memoria y enfermedades. El método descrito aquí permite la recolección de fracciones sinápticas nucleares, citoflásmáticas y brutas del mismo cerebro de roedor (rata), seguida de la cuantificación simultánea de la actividad catalítica proteasome (indirectamente, proporcionando actividad del núcleo de proteasoma únicamente) y el etiquetado de proteína de ubiquitina específica para varillajes. Por lo tanto, el método se puede utilizar para comparar directamente los cambios subcelulares en la actividad ubiquitina-proteosoma en diferentes regiones cerebrales en el mismo animal durante la plasticidad sináptica, la formación de la memoria y diferentes estados de enfermedad. Este método también se puede utilizar para evaluar la distribución subcelular y la función de otras proteínas dentro del mismo animal.

Introducción

El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es una compleja red de estructuras y ligasas de proteínas interconectadas que controla la degradación de la mayoría de las proteínas de corta duración en las células¹. En este sistema, las proteínas se marcan para la degradación u otros procesos/fates celulares por el pequeño modificador ubiquitina. Una proteína diana puede adquirir 1-7 modificaciones de ubiquitina, que pueden unirse en uno de los siete sitios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48y K63) o la N-terminal metionina (M1; como se conoce como lineal) en la ubiquitina 2 anterior. Algunas de estas etiquetas de poliu....