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Artículo de método

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

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DOI:

10.3791/59696

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5 de julio de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Michigan, 3Rogel Cancer Center, School of Medicine, University of Michigan, 4Macromolecular Science and Engineering, University of Michigan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la enfermedad.

Resumen

En este protocolo, delineamos el procedimiento para la generación de esferoides tumorales dentro de gotas colgantes de 384 pozos para permitir la detección de alto rendimiento de las terapias contra el cáncer en un microambiente fisiológicamente representativo. Delineamos la formación de esferoides de células madre de cáncer derivados del paciente, así como la manipulación de estos esferoides para un análisis exhaustivo después del tratamiento farmacológico. Específicamente, describimos la recopilación de morfología esferoide, proliferación, viabilidad, toxicidad de fármacos, fenotipo celular y datos de localización celular. Este protocolo se centra en gran medida en las técnicas de análisis que se implementan fácilmente utilizando la plataforma de caída colgante de 384 pozos, por lo que es ideal para la detección de drogas de alto rendimiento. Si bien enfatizamos la importancia de este modelo en los estudios de cáncer de ovario y la investigación de células madre del cáncer, la plataforma de 384 pozos es susceptible a la investigación de otros tipos de cáncer y modelos de enfermedades, extendiendo la utilidad de la plataforma a muchos campos. Al mejorar la velocidad del cribado personalizado de drogas y la calidad de los resultados de cribado a través de cultivos 3D fisiológicamente representativos de fácil implementación, se prevé que esta plataforma ayude al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de tratamiento, y por lo tanto tienen un amplio impacto clínico.

Introducción

La mortalidad mundial relacionada con el cáncer alcanzó unpeaje de 9,8 millones de muertes en 2018 1, lo que puso de relieve la necesidad de mejorar la terapia. Desafortunadamente, el costo del desarrollo de medicamentos contra el cáncer está aumentando, y el desarrollo de un solo medicamento cuesta aproximadamente 650 millones de dólares,lo que indica la necesidad de mejorar las estrategias para desarrollar nuevos medicamentos contra el cáncer. Se cree que las células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por un aumento de la quimiorresistencia3,la capacidad de auto-renovarse y la capacidad de sembrar nuevos tumores4 son responsables de la recurrencia tumoral4, la metástasis5y quimiorresistencia4,6, que todos contribuyen a la capacidad maligna del tumor y por lo tanto el alto número de muertes. En el cáncer de ovario, estas células se encuentran enriquecidas en el líquido de ascitis maligna en la cavidad peritoneal, una condición asociada con resultados clínicos deficientes1. Como resultado de las capacidades malignas de las CSC, se ha producido un impulso para desarrollar nuevos fármacos dirigidos a la CSC para su uso en combinación con las quimioterapias tradicionales. Existen varios desafíos que acompañan al desarrollo de medicamentos dirigidos a la CSC, entre ellos: 1) dificultad para ampliar y mantener las CSC in vitro; 2) escasez de muestras de pacientes; 3) relevancia fisiológica de la plataforma de cultivo; y 4) heterogeneidad en la sensibilidad a los medicamentos entre los pacientes. Este protocolo describe la implementación de una plataforma de cultivo 3D de alto rendimiento que puede superar cada uno de estos desafíos. En particular, este sistema permite un cribado rápido de fármacos utilizando un pequeño número de CI de ovario derivados del paciente, y es altamente susceptible a las técnicas de análisis aguas abajo. Si bien es ideal para estudiar el cáncer de ovario y los CSC, nuestra plataforma también es valiosa para estudiar otros tipos de cáncer y células diferenciadas en entornos 3D complejos.

Los modelos tridimensionales complejos (3D) son fundamentales en el estudio del microambiente tumoral (TME), que es un nicho 3Dcompuesto por células cancerosas, células que no son compatibles con el cáncer y proteínas de matriz extracelular (ECM) 4. Este entorno 3D da como resultado morfología celular única, interacciones de células celulares y matrices celulares, diferenciacióncelular, migración celular, densidad celular y gradientes de difusión en comparación con el cultivo celular 2D tradicional in vitro 4. Todos estos factores culminan en la respuesta diferencial a los fármacos dentro de los cultivos 3D, exhibiendo una mayor resistencia a los medicamentos y relevancia fisiológica7,8. Debido al papel del TME 3D en la diferenciación y quimiorresistencia de CSC, es vital detectar fármacos dirigidos a CSC en microambientes fisiológicos. Mejorar la relevancia fisiológica de las plataformas de detección de fármacos de CSC tiene el potencial de mejorar la detección de medicamentos específicos para los pacientes, el desarrollo de fármacos, la formulación de estrategias de tratamiento y, en última instancia, los resultados clínicos. Es igualmente importante que la plataforma utilizada para la detección de fármacos sea de alto rendimiento y compatible con los métodos de análisis posteriores para minimizar el costo, el tiempo y el tiempo de traducción clínica de los medicamentos prometedores9.

Actualmente, el complejo TME se mantiene mejor para aplicaciones de detección de fármacos a través de modelos in vivo como modelos de tumores singéneos murinos, xenoinjertos derivados de líneas celulares y modelos12de xenoinjertos derivados del paciente (PDX), ya que proporcionan modelos fisiológicos Condiciones. Sin embargo, la naturaleza de bajo rendimiento de estos modelos, así como el costo, el tiempo y los conjuntos de habilidades técnicas que requieren limita su utilidad en aplicaciones rápidas y de alto rendimiento de detección de medicamentos13. Como alternativas a estos modelos in vivo, muchos modelos 3D in vitro que utilizan hidrogeles8, cultivo dentro de dispositivos microfluídicos o dispositivos 'organ-on-a-chip'10,14,y cultivos no adherentes3,8 también se han desarrollado, debido a su baja barrera de entrada en términos de costo, tiempo y conjunto de habilidades requeridas.

Las plataformas de cultivo de hidrogel son ventajosas en el control fino que se ofrece sobre la composición de la matriz, las propiedades mecánicas y la estructura de la matriz15; sin embargo, pueden inhibir el cultivo celular de alta densidad14. Además, la recolección de células de hidrogeles puede complicar el análisis aguas abajo, debido a los efectos potencialmente nocivos de los métodos de cosecha15. Los dispositivos microfluídicos, por otro lado, son dispositivos de microescala que permiten la detección de salida dentro del mismo dispositivo y para el cultivo celular a escalas fisiológicamente relevantes con un consumo mínimo de reactivos, menor tiempo de reacción, rápida difusión14. Estas características las convierten en plataformas prometedoras para investigar la toxicidad, eficacia y farmacocinética de los medicamentos. Sin embargo, los desafíos del cultivo celular 3D eficiente, cuantificable, reproducible y fácil de usar, así como los sistemas de bombeo voluminosos y costosos han restringido las aplicaciones microfluídicas en la investigación de alto rendimiento10. Las configuraciones de detección eficientes y la implementación potencialmente difícil en todos los campos también han obstaculizado la adopción generalizada de sistemas microfluídicos10.

Por el contrario, los esferoides generados en condiciones no adherentes en mezcladores giratorios (nutators), placas de fijación ultrabajas y gotas colgantes no incluyen componentes de matriz definidos por el usuario. Estas metodologías son especialmente relevantes para el estudio del cáncer de ovario, ya que las condiciones no adherentes son representativas de las condiciones en las que los esferoides crecen dentro de la cavidad peritoneal5. Dentro de estos métodos de cultivo no adherentes, se ha demostrado que los esferoides de caóro de nuez y gota colgante exhiben una mayor compactación, remodelación y quimiorresistencia en comparación con los esferoides generados en placas de unión ultrabajas, lo que sugiere un aumento fisiológico relevancia16,17,18,19. Debido al aumento de la capacidad de cribado de alto rendimiento de tamaños de pozos más pequeños y números de celda mínimos requeridos, la generación de esferoides en placas colgantes es una plataforma ideal para la detección de drogas. Aquí, presentamos una plataforma fisiológica 3D ajustable en placas colgantes colgantes de 384 pocillos, que es fácil de implementar y altamente susceptible de análisis aguas abajo, por lo que es ideal para la detección de fármacos de alto rendimiento de cáncer de ovario y CSC ováricos.

Nuestra plataforma fisiológica 3D proporciona todas las ventajas del cultivo 3D, incluyendo contactos fisiológicos de células celulares, gradientes de difusión, densidades celulares y proteínas ECM producidas naturalmente, que pueden contribuir a respuestas realistas de drogas16, 17,18,19. Además, al generar estos esferoides con CI derivados del paciente, somos capaces de determinar las respuestas específicas del paciente a los medicamentos1 con muchas réplicas técnicas simultáneamente, para superar la heterogeneidad que se puede encontrar dentro del tumor del paciente muestras20. Además, se ha demostrado que el cultivo 3D mejora el mantenimiento de las poblaciones de CSC3,16 y, por lo tanto, es representativo de las poblaciones de CSC enriquecidas en la ascitis7. Esto combinado con un fácil análisis aguas abajo, incluyendo el análisis de citometría de flujo de viabilidad y proporciones CSC permite una evaluación óptima de la CSC dirigida a la eficacia de los medicamentos. Por último, esta plataforma fisiológica es compatible con imágenes en múltiples momentos durante el experimento, evaluación de la muerte celular y proliferación, organización celular y morfología con inmunohistoquímica, señalización soluble con ELISA en fenotipos de células medianas con citometría de flujo y expresión génica después de la PCR.

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Protocolo

Todas las muestras de pacientes se recogen bajo un protocolo IRB aprobado de pacientes que consienten, cuyas muestras se desidentifican después de la desbultamiento del tumor y la recolección de ascitis.

1. Generación de esferoides a partir de números de celda pequeña en placas colgantes colgantes de 384 pocillos

  1. Coloque la placa colgante en un sonicador lleno de agua estéril desionizada (DI) y sonicar durante 20 minutos.
  2. Con una mano enguantada, retire el plato del sonicador y lávelo con agua DI corriente.
  3. Deje que la placa se quede en un baño de ácido plurónico al 0,1% durante 24 horas para evitar la adsorción de proteínas y la adherencia esferoide a los pozos.
  4. Retire las placas con una mano enguantada y enjuague ambos lados de la placa con agua DI corriente a fondo.
  5. Toque o agite vigorosamente la placa dentro de un gabinete de bioseguridad para eliminar el agua de los pozos en un ambiente estéril.
  6. Coloque la placa bajo luz UV durante 30-60 minutos a cada lado para esterilizar las placas y minimizar la contaminación.
    NOTA: La placa también se puede exponer a gas óxido de etileno en una cámara para la esterilización.
  7. Llene cada pozo de un plato de 6 pocillos con 4-5 ml de agua DI autoclave estéril y empareje la placa colgante entre la tapa y la parte inferior de la placa de 6 pocillos. Agregue entre 800 y 1.000 l de agua DI estéril alrededor del borde de la placa colgante para proporcionar un ambiente húmedo, estable y estéril para minimizar el volumen perdido por evaporación (Figura1 A-C).
  8. Para las células cultivadas en 2D, aspirar a células medianas que cubren en su fase log de crecimiento y lavar con 1 x solución salina tamponada de fosfato (PBS) para eliminar los rastros de suero bovino fetal (FBS) en el medio de crecimiento, ya que dificulta la acción de la trippsina.
  9. Aspirar el PBS y añadir 1.5-2 mL de 0.25% trypsin-EDTA a la placa de cultivo de tejido de 100 mm. Incubar células durante 5 min en una incubadora establecida en 37oC.
    NOTA: Las celdas pueden desprenderse a diferentes velocidades, por lo que las placas deben revisarse en un microscopio de luz de sobremesa para asegurar el desprendimiento de la célula después de 5 min. Ajustar el protocolo de desprendimiento por las instrucciones del proveedor cuando se utiliza una línea de celda.
  10. Añadir 6-8 ml de medio celular que contenga FBS o cualquier suero al plato para neutralizar la trippsina, recoger las células con un pipeta serológica de 10 ml y depositarlas en un tubo cónico de 15 ml.
  11. Cuente las células cargando 10 s de la suspensión celular a cada lado de un hemocitómetro y siga el protocolo de conteo asociado.
  12. Para las células derivadas del paciente recogidas de tumores sólidos primarios o metastásicos o de ascitis que no han sido cultivadas en 2D, prepare suspensiones de una sola célula en un medio libre de suero (SFM) descrito anteriormente3.
  13. Procesar los tejidos tumorales como se describió anteriormente y almacenar suspensiones de una sola célula para su uso posterior en el medio de congelación apropiado21,22.
    1. Para el tejido tumoral sólido, picar mecánicamente con una cuchilla de afeitar y filtrar la solución resultante a través de un filtro de 40 m antes de aislar las células deseadas de un gradiente de densidad21,22.
    2. Para muestras de ascitis, concentrar las células por centrifugación, lise glóbulos rojos en tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK), lavar en 1x PBS, y luego pasar a través de un filtro de 40 m y una aguja de 28 G 4 veces22.
  14. Para el aislamiento de los COováricos ováricos, ordene las células con citometría de flujo como se describe a continuación en detalle.
  15. Las células individuales recién aisladas se congelan para su almacenamiento y se descongelan cuando es necesario para la experimentación.
  16. Para preparar la suspensión celular para el revestimiento, calcule el volumen deseado de la solución celular necesaria para el chapado: 20 s por caída X número total de gotas - volumen total de la solución necesario.
  17. Diluir la concentración celular a la concentración celular deseada por 20 l (es decir, 100 células en una caída de 20 l).
  18. Mezcle suavemente la suspensión celular utilizando un pipeta antes de enchapar para asegurar una distribución homogénea de las células y mejorar la uniformidad entre las gotas.
    NOTA: La mezcla excesiva de la suspensión celular puede provocar la muerte celular y los escombros en los esferoides de la gota colgante.
  19. Coloque la punta de la pipeta en el pozo en un ángulo de aproximadamente 45o y pipetee 20 s l de la solución celular en cada gota colgante.
    NOTA: Los patrones de chapado se pueden ajustar dependiendo del número de esferoides necesarios. Esferoides de chapado en todos los demás pozos es más seguro cuando grandes cantidades de esferoides no son necesarios en un experimento, porque evita la fusión accidental de las gotas (Figura1D, E). Si se necesitan grandes cantidades de esferoides para un experimento, placa cada pozo dejando cada pozo dejando una fila de pozos de borde en todos los lados (Figura1F).
  20. Coloque la tapa de la placa de 6 pocillos de nuevo en la parte superior de la placa colgante y utilice una tira termoplástica elástica que sea insensible a la pérdida de humedad, para sellar los bordes y evitar la evaporación adicional de las gotas. Incubar en una incubadora humidificada de CO2 estándar (5% CO2, 37 oC).
  21. Alimente las gotas colgantes una vez cada 2–3 días para reponer el medio de cultivo celular para los nutrientes necesarios agregando 2-3 l a cada esferoide que contenga bien.
    NOTA: Después de la toma de imágenes, siempre se recomienda alimentar las gotas colgantes, ya que la exposición al aire durante la toma de imágenes conduce a la evaporación.

2. Adición de medio de cultivo celular a las placas esferoides colgantes

  1. Retire la tira termoplástica y la tapa dentro de un armario de bioseguridad y agregue 2-3 l del medio de cultivo apropiado a cada pocil que contenga una gota colgante.
    NOTA: El volumen añadido dependerá del tamaño de la gota y de la cantidad de tiempo entre las alimentaciones.
  2. Después de la alimentación, cubra la placa con la tapa superior y aplique la tira termoplástica fresca en los bordes exteriores antes de volver a colocar la placa en la incubadora.

3. Imagen de contraste de fase de la morfología esferoidea

  1. Retire la tira termoplástica de alrededor de los bordes de la placa en un gabinete de bioseguridad.
  2. Retire cuidadosamente la placa de esferoides colgantes de 384 pocillos del gabinete de bioseguridad con la tapa todavía en su lugar y colóquela en la bandeja del microscopio en un microscopio epifluorescente.
  3. Utilice la opción de imágenes en vivo en el software de imágenes en 4x, 10x o 20x para observar los esferoides colgantes y tomar las imágenes deseadas.
  4. Después de guardar las imágenes, lleve la placa de vuelta al gabinete de bioseguridad y las células de alimentación como se describió anteriormente.
  5. Vuelva a sellar la placa con una tira termoplástica fresca y vuelva a colocar la placa sellada en la incubadora.

4. Cuantificación de la Proliferación y Viabilidad dentro de los Esferoides

  1. Placa spicadeos en un número suficiente de pozos para obtener >10 réplicas técnicas para cada punto de tiempo (es decir, el día 1 y el día 7) que se va a examinar.
    NOTA: Los pozos que se utilizan para este ensayo generalmente no se utilizan de nuevo debido a posibles contaminantes del tinte de resazurina.
  2. Añadir 2 l de solución filtrada basada en resazurina a los pozos designados para el análisis de proliferación como si alimentar esos pozos e incubar durante un período de incubación predeterminado.
    NOTA: Este tiempo de incubación puede variar según el tipo de celda y el número de células en el esferoide. Se recomienda determinar el tiempo de incubación necesario antes de comenzar los experimentos de proliferación iniciando mediciones después de 1 hora de incubación y luego volviendo a medir cada 30 minutos hasta que la señal se lee en la meseta de los pozos de control. Las lecturas de ensayo se pueden tomar tantas veces como se desee. La incubación suele ser de 4 h para los esferoides iniciados con 100 células cancerosas.
  3. Encienda primero el lector de microplacas seguido por el software de lector de placas asociado al menos 15 minutos antes de la primera lectura para permitir que la máquina se caliente y asegure la temperatura interna a 22 oC, ya que la temperatura puede afectar a las lecturas.
  4. Abra un conjunto de protocolos de placa de 384 pocillos con excitación de 530/25 nm y longitudes de onda de emisión de 590/35 nm con óptica según la parte inferior, ganancia establecida en 35, velocidad de lectura establecida en Normal, y tipo de lectura establecido en Fluorescencia .
  5. Después del período de incubación, abra el sándwich colgante drop en un gabinete de bioseguridad y lleve la placa de 384 pocillos con la tapa todavía en su lugar al lector de placas.
  6. Coloque la placa de 384 pocillos con la tapa todavía en su lugar en la bandeja del lector de placas, que se extenderá una vez que la máquina esté calentada y haga clic en Aceptar para leer la placa.
  7. Vuelva a colocar la placa de pozo en la base de 6 pocillos y colóquela en la incubadora. Si se han leído todos los puntos de tiempo para el día, vuelva a sellar la placa antes de volver a colocarla en la incubadora.
  8. Guarde el experimento en la ventana emergente y, a continuación, haga clic en Sí cuando se le solicite ¿Desea ejecutar PowerExports para la placa 1 para generar datos del software del lector de placas en una hoja de cálculo para la organización.
  9. Valores medios de fluorescencia para cada condición y normalizarse por el promedio de la condición de control para informar de cambio de pliegue en la proliferación en diversas condiciones experimentales.
  10. Al comparar el día 1 al día 7, normalice dividiendo por día 1 fluorescencia promedio para obtener un cambio de pliegue en la proliferación con el tiempo.
  11. Calcule las barras de error utilizando el error estándar de la media y determine la significancia estadística entre grupos experimentales con una prueba estadística apropiada, como la prueba T de dos colas del estudiante.

5. Evaluación de la toxicidad de los medicamentos en los esferoides

  1. Administración de medicamentos
    1. En cualquier momento después de la formación de esferoides, entregar el medicamento diluido a la concentración deseada de tal manera que una dosis de 2 l contenga 10 veces la concentración final deseada del medicamento.
      NOTA: Esto supone una evaporación de 2 ml de la gota para que el volumen final después del tratamiento farmacológico sea de 20 l. Por ejemplo, una dosis de 50 M de cisplatino tendrá una solución preparada de 500 m. Si las gotas contienen más de 20 l, la concentración de fármaco y/o el volumen añadido debe ajustarse en consecuencia.
    2. Tratar las muestras de control con 2 s de medio de cultivo celular.
      NOTA: El cisplatino se solubiliza en el agua. Por lo tanto, los controles son 2 l de medio de cultivo celular; sin embargo, si el vehículo farmacológico es un disolvente diferente (por ejemplo, DMSO), entonces los controles deben ser medio de cultivo celular con una concentración igual de DMSO como se utiliza en el tratamiento de drogas.
    3. Continuar monitoreando el fármaco tratado y los esferoides de control durante todo el período de incubación del fármaco con microscopía de fase para tener un registro visual del efecto de la toxicidad del fármaco, así como con el tinte de resazurina como se describió anteriormente para monitorear la viabilidad celular.
      NOTA: Típicamente, los medicamentos se añaden después de 5-7 días en las gotas colgantes y toxicidad medida después de 48--72 hs, pero esto puede variar dependiendo del experimento. Los medicamentos se pueden agregar tan pronto como se han formado esferoides estables, generalmente entre 1-4 días.
  2. Cuantificación de toxicidad de fármacos por recuento celular
    1. Al final del tratamiento farmacológico, recoja 10 esferoides cada uno de los pozos tratados con el control y los medicamentos utilizando una tubería de 1.000 l y deposite cada conjunto de esferoides en su propio tubo de microcentrífuga.
    2. Descompone los esferoides en células individuales mediante pipeteo repetido.
      NOTA: Para reducir el daño celular potencial debido al pipeteo repetido, se puede realizar la digestión enzimática con una enzima como la trippsina para facilitar la generación de soluciones de una sola célula antes del pipeteo23. La minimización de la muerte celular debido al pipeteo dependerá del tipo de célula y debe optimizarse en consecuencia. Si le preocupa la muerte por desagregación, consulte el análisis con tinte de resazurina y el ensayo de citotoxicidad para métodos alternativos que no requieren desagregación esferoide.
    3. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 400 x g para recoger las células en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga y aspirar el sobrenadante.
    4. Añadir 20 s de medios frescos o 1x PBS a cada tubo y mezclar bien.
    5. Añadir Trippan azul a una proporción de 2 s de tinción azul Trypan a 20 l de suspensión celular.
    6. Cargue 10 s de células y suspensión azul Trypan en cada cámara del hemocitómetro y cuente las células bajo un microscopio de luz, con células teñidas azules que representan células muertas y células no manchadas que representan células vivas.
      1. La celda viva % (Número de celdas vivas - número total de celdas) x 100.

6. Caracterización esferoide con técnicas histológicas

NOTA: Hay dos opciones de molde 3D impresas en un polímero biocompatible para replicar moldes de matriz de esferoides fabricados por Ivanov et al.24: 1) 20 molde de pozo que pueden contener 28 ol por pozo y 2) 63 molde de pozo que puede contener 9 ol por pozo (Figura2D).

  1. Esterilice el moho histológico y su borde limpiándolos con 70% de etanol y conecte la frontera firmemente alrededor del molde y coloque el molde en posición vertical. Ambos moldes se adaptan aproximadamente a 3 ml de fluido (3.203 ml para la matriz de 20 esferoides y 3.196 ml para la matriz de esferoides de 63).
  2. Cubra ligeramente la matriz de esferoides con aceite de 10.000 cSt Si utilizando un hisopo de algodón puntiagudo para facilitar la eliminación del gel de procesamiento de muestras fundido en pasos posteriores.
  3. Caliente el gel de procesamiento de muestras hasta que se licuar a través de microondas durante 10-20 s con la tapa aflojada.
  4. Añadir entre 2,6 y 2,8 ml de gel de procesamiento fundido en el molde hasta aproximadamente nivelar con la parte superior del borde.
  5. En unos minutos, una vez solidificado, retire el gel de procesamiento fundido separando el borde del molde y luego invirtiendo el molde de matriz.
  6. Inserte la punta de la pinza entre el molde y el borde para separarlos cuidadosamente y luego use un rascador de celda para ayudar a desalojar el yeso del molde si no se separa de inmediato.
  7. Cosecha los esferoides de la placa colgante pipeteando el contenido de un solo pozo en una placa de petri celular de 100 o 150 mm con una tubería de 1.000 l, y aísla el esferoide visualmente.
  8. Pipeta de 5 l del contenido del pozo, incluido el esferoide identificado en uno de los pozos de matriz, hasta que se llene la matriz.
  9. Espere 3 minutos para asegurarse de que los esferoides se han asentado en la parte inferior de la matriz antes de pipetear suavemente el gel de procesamiento fundido en cada uno de los pozos teniendo cuidado de no molestar a los esferoides.
  10. Agregue gel de procesamiento adicional para nivelar la parte superior de la matriz y, una vez enfriado, coloque la matriz esferoide solidificada en un casete etiquetado para su procesamiento.
  11. Sumerja el cassette etiquetado en un 4% de formalina durante la noche para fijar los esferoides a 4 oC y luego almacene en etanol al 70% a 4 oC hasta que esté listo para el procesamiento.
  12. Procesar con el programa de parafina estándar de 1 h y luego incrustar las matrices de esferoides de modo que las matrices procesadas se enfrentan en posición vertical con la parte inferior de los pozos más cercanas a la cara del bloque.
  13. Asegúrese de que las matrices estén integradas lo más planas posible, con la cara inferior al ras con la parte inferior del bloque y coloque bloques en el hielo.
  14. Cargue el bloque en el microtome y ajuste el bloque de forma que la hoja esté paralela a la cara del bloque cargada.
  15. Matriz de corte (profundidad de la muestra de 15 m) hasta que se alcance la parte inferior de los pozos de matriz asegurándose de que los pozos circulares sean visibles en muestras cortadas.
  16. Cambie a una profundidad de muestra de 5 m y continúe cortando y recogiendo cintas. Compruebe bajo el microscopio cada unas pocas rebanadas para determinar si se ha alcanzado la profundidad del esferoide. Una vez que se alcanzan los esferoides, recoja cada diapositiva posterior hasta que los esferoides ya no sean visibles.
  17. Mancha cada diapositiva con el protocolo estándar H&E.

7. Ensayo de citotoxicidad muerta viva

  1. A cada gota colgante, agregue el tinte celular vivo, calceína-AM a la concentración final de 2 m, y el tinte de células muertas, etidio homodímero-1 a la concentración final de 4 m, teniendo en cuenta que el volumen de caída es de 20 ol.
    NOTA: Trate de mantener los volúmenes agregados al mínimo, y por lo general agregue 2 l de los dedos combinados.
  2. Vuelva a colocar las placas en la incubadora emparedado en un plato de 6 pocillos con una tapa e incubar las esferoides durante 45 min a 37 oC.
    NOTA: Dependiendo del tamaño de los esferoides, este tiempo de incubación varía significativamente. Por ejemplo, los esferoides de menos de 400 m normalmente solo requieren entre 30 y 45 minutos de tiempo de incubación, mientras que los esferoides más grandes cercanos a 800 m han requerido hasta 90 minutos de tiempo de incubación. Los tiempos de incubación deben optimizarse para el experimento de un individuo.
  3. Para obtener imágenes posteriores, cosere los esferoides con una pipeta de 1.000 ml en un gabinete de bioseguridad y deposite cada esferoide en portaobjetos de microscopio de vidrio prelimpiados.
  4. Imagen esferoides a través del vidrio, en un microscopio confocal invertido.
    NOTA: Dependiendo de la proximidad del microscopio confocal al laboratorio en el que se cosechan esferoides, los esferoides pueden ser fotograbados en la gota original del medio colocado en la diapositiva o encerrados en 2% agarose si se requiere más estabilidad para el transporte de esferoides.
  5. Usando el modo Adquisición Multidimensional en el software del microscopio, localice el esferoide usando la iluminación DIC con un aumento de 10x y luego escanee el plano z para identificar las alturas que abarcan el esferoide.
  6. Haga clic en la serie Z y establezca el límite superior e inferior del z-scan ligeramente más alto que la parte superior del esferoide y ligeramente inferior a la parte inferior del esferoide.
  7. Emocionar los esferoides a 488 nm para calceina-AM (células vivas; verde) y 561 nm para etidio homodimer-1 (células muertas; rojo) con el tamaño de paso recomendado por el software, ganancia máxima y exposición mínima para cada color.
  8. Haga clic en Adquirir para obtener una imagen compuesta de la pila z de celdas vivas y muertas dentro del esferoide.
  9. Cuantifique las proporciones en vivo/muertos utilizando el software de procesamiento de imágenes para cuantificar un porcentaje de intensidad de píxeles desde el canal correspondiente a las celdas vivas frente al porcentaje de intensidad de píxeles del canal correspondiente a las celdas muertas del compuesto imágenes de proyección z.
    NOTA: Debido a las limitaciones en la cuantificación de una estructura 3D con una proyección 2D, un método alternativo para cuantificar la fluorescencia viva frente a la muerta, dentro de las placas colgantes es utilizar un lector de placas siguiendo el protocolo incluido con la calceína-AM y el etidio homodimer-1 kit.

8. Inmunofluorescencia

  1. Caliente una solución de agarosa de baja fusión del 2%, por lo que la solución es viscosa y justo por encima del punto de fusión y colóquela en una diapositiva del microscopio para crear un lecho suave de agarosa
  2. Cosecha esferoides empujando 20 s de PBS a través de la gota sobre el lecho blando de 2% de agarosa.
    NOTA: Esto debe hacerse rápidamente para que la agarosa no se solidifique antes de que se incrusten los esferoides.
  3. Una vez que la agarosa se enfríe y gele con el esferoide cosechado atrapado dentro (menos de 5 min), agregue un 4% de formalina tamponada neutra para fijar los esferoides. Alternativamente, agregue metanol helado en frío y fije los esferoides incrustados en agarosa a -20 oC durante 30 min.
  4. Lavar 3 veces durante 5 min cada uno con 1x PBS, descartando PBS después de cada lavado.
  5. Bloquear durante 1 h a RT con 10% de suero (es decir, suero de caballo) y 0,15% solución de jabón (Triton X-100) en 1x PBS.
  6. Lavar 3 veces durante 5 min cada uno con 1x PBS, descartando PBS después de cada lavado.
  7. Esferoides de mancha con anticuerpo fluorescente deseado a la dilución de anticuerpos recomendada o predeterminada (es decir, faloide etiquetado fluorescentemente a una dilución de 1:100), incubando durante al menos 90 minutos a temperatura ambiente, cubierto de luz.
    NOTA: Los protocolos variarán dependiendo de los anticuerpos y la dilución de objetivos y anticuerpos puede necesitar ser optimizado dependiendo del experimento.
  8. Visualice esferoides manchados fluorescentes con el microscopio confocal invertido utilizando métodos descritos en la sección anterior para la toma de imágenes de esferoides.
  9. Las imágenes compuestas de la pila z demostrarán morfología 3D en los esferoides.

9. Recolección y análisis de poblaciones de células madre cancerosas con citometría de flujo

  1. Preparación de esferoides para el análisis de citometría de flujo
    1. Recoger esferoides de cada pocil en las placas colgantes con una tubería de 1.000 l y depositarlas en un tubo centrífugo de 15 ml para la desagregación con pipeteo repetido.
    2. Cuente las células viables en un hemocitómetro usando Trypan Blue para determinar el número de celda y la concentración como se describió anteriormente.
    3. Suspensión celular alícuota en cinco tubos de microcentrífuga de tal forma que cada uno contenga un mínimo de 50.000 células.
    4. Centrifugar todos los tubos a 400 x g durante 5 min en una microcentrífuga.
    5. Aspirar el sobrenadante de cada tubo y resuspender los gránulos en 100 ml de tampón.
    6. Tubos de etiqueta "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" y "ALDH/CD133", respectivamente.
    7. Añadir 0,5 l de anticuerpo APC-isotipo al tubo APC-iso y 1 l de anticuerpo CD133 al tubo ALDH/CD133 según lo determinado por la dilución en serie y la recomendación de los fabricantes.
    8. Añadir 5 l de reactivo DEAB y 0,5 l de ALDH al tubo DEAB, y 1 l de ALDH al tubo ALDH/CD133.
    9. Vortex todos los tubos durante aproximadamente 2 s e incubar a 37oC durante 45 min.
    10. Vortex todos los tubos de nuevo y centrifugar a 400 x g durante 5 minutos en una microcentrífuga.
    11. Etiquetar tubos FACS "Unstained", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" y "ALDH/CD133" y llenar un recipiente de espuma aislado para reservar.
    12. Aspirar sobrenadant y resuspender el control "sin mancha" en tampón FACS de 400 ol (1x PBS con 2% FBS) y todos los demás tubos en 400 l de búfer DAPI FACS (zona de influencia FACS con 300 m 4',6-diamidino-2-fenilindo).
    13. Coloque los tubos en un recipiente con hielo hasta que se analicen en un catómetro de flujo.
      NOTA: Para ordenar las células madre del cáncer de ovario, recoja todas las células que el citómetro mide ser ALDH+ y CD133+ con puertas configuradas para incluir una señal APC no específica del 0,5% y una señal ALDH+ no específica del 0,15%. Al menos 10.000 células necesitan ser analizadas para obtener resultados confiables. Más detalles se pueden encontrar en las publicaciones recientes3,17.
  2. Análisis de las poblaciones de ALDH+/CD133+ en FlowJo
    1. Haga doble clic en el icono FlowJo para abrir el programa y arrastre los archivos .fcs obtenidos del software de citometría de flujo al espacio de trabajo.
    2. Haga doble clic en el archivo sin conservar y establezca el eje Y en la altura de dispersión lateral (SSC-H) y el eje X en la altura de dispersión hacia delante (FSC-H).
    3. Haga clic en el botón T situado junto a cada eje para ajustar la escala y la transformación para maximizar la separación entre diferentes poblaciones de celdas.
    4. Haga clic en el botón Detonar polígono y dibuje una puerta poligonal alrededor de la población de celdas y etiquete la población 'Células'.
    5. Haga doble clic en la población de celdas en el espacio de trabajo para ver solo las celdas dentro de la población de 'Células' y luego haga clic en el eje FSC para cambiar el canal del eje a ancho FSC y luego haga clic en el eje SSC y cambie el canal del eje al FSC-H.
    6. Elija la herramienta Puerta rectangular y dibuje un rectángulo alrededor de la población más densa a la izquierda de celdas que abarcan la totalidad del eje Y para excluir posibles dobletes hacia la derecha de la ventana y etiquete esta puerta "Células únicas".
    7. Haga clic con el botón derecho y copie las celdas y la puerta de celdas simples anidadas y péguelas debajo de cada muestra en el espacio de trabajo.
    8. Haga doble clic en la puerta Células únicas anidada bajo la muestra de DAPI en el espacio de trabajo para ver la población de celda única desde ese tubo de muestra y haga clic en el eje FSC y cambie el canal del eje al canal DAPI - Area.
    9. Haga clic en el eje SSC y cambie el canal del eje a Histograma.
      NOTA: Las celdas vivas estarán hacia la izquierda, ya que excluyen DAPI, mientras que las celdas muertas tomarán el DAPI y aparecerán a la derecha del gráfico.
    10. Haga clic en el botón T junto al eje DAPI y haga clic en Personalizar eje para ajustar la escala para maximizar la separación entre los picos negativos DAPI positivos y DAPI.
      NOTA: Aparecerá una ventana con opciones de escalado. A menudo, establecer el campo Escala en Biex y ajustar las Décadas Extra Negativas y la Base de Anchura producirá la mayor separación.
    11. Haga clic en Aplicar en la ventana emergente para aplicar cambios de escala, elija el botón Rango de puerta y extiéndalo sobre el pico negativo DAPI, correspondiente a la población de celdas vivas.
    12. Etiquete esta puerta "Células Vivas" y haga clic con el botón derecho para copiar la puerta "Células Vivas" para pegarla debajo de la puerta "Células individuales" bajo los tubos 'APC-iso, 'DEAB' y 'ALDH/CD133' para seleccionar la misma porción de celdas vivas en cada tubo de muestra.
    13. A continuación, haga doble clic en la población de celdas vivas anidadas bajo el archivo de muestra APC-iso y cambie el eje X al ALDH — Canal de área y el eje Y al canal APC — Area.
    14. Una vez más, ajuste la escala del eje haciendo clic en el botón T y Personalizar eje de cada eje para que los eventos se localicen en la región inferior izquierda del trazado y seleccione la opción Puerta cuádruple y haga clic en la ventana de trazado para establecer una puerta de cuadrante .
    15. Ajuste la intersección de la puerta de tal manera que aproximadamente el 0,5% de la población se encuentra en la parte superior izquierda de la ventana de parcela o cuadrante 'APC positivo'.
      NOTA: Este 0,5% representa la tinción no específica del isotipo APC.
    16. Haga clic con el botón derecho en cada etiqueta de cuadrante individualmente en el espacio de trabajo y cámbieles el nombre adecuadamente. Control o Comando haga clic en cada etiqueta de puerta de cuadrante en el espacio de trabajo y cópielos.
      NOTA: 'Q1' representa las celdas CD133+; 'Q2' representa las celdas CD133+ y ALDH+'; 'Q3' representa células ALDH+; y 'Q4' representa las células CD133- y ALDH-.
    17. Pegue las puertas del cuadrante en la población de células vivas anidadas bajo el archivo 'DEAB'. Ajuste la línea vertical de tal forma que aproximadamente el 0,15% de la población celular se encuentra dentro del cuadrante 'ALDH+' teniendo cuidado de no mover la línea horizontal.
      NOTA: Este 0,15% representa una señal ALDH no específica.
      1. Para asegurarse de que la línea horizontal no ha cambiado de posición, copie las nuevas puertas de cuadrante anidadas bajo el archivo DEAB y péguelas en las celdas activas bajo el archivo iso de APC. Seleccione Sí cuando se le pida que reemplace la puerta del cuadrante existente.
      2. Compruebe en el área de trabajo que el porcentaje de 'CD133+' sigue siendo aproximadamente 0,5 en el archivo 'APC-iso'.
    18. Copie y pegue las puertas del cuadrante en la población de "Células vivas" del archivo 'ALDH/CD133'.
      NOTA: El porcentaje de la población celular viable presente en el cuadrante superior derecho será el porcentaje de CI de doble positivo ALDH+ y CD133+ dentro de la muestra.

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Resultados

Los esferoides formados con líneas celulares o CSS derivados del paciente se pueden formar con un rango de números de células pequeñas dentro de gotas colgantes (Figura2A). Los esferoides se forman de forma fiable con tan solo 10 células por pozo, lo que permite la conservación de muestras de pacientes poco frecuentes. Las células dentro de estos esferoides están rodeadas por otras células en 3 dimensiones, ya que estarían in vivo, lo que permite contactos fisiológicos de células celulares y...

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Discusión

La plataforma de placacolgante colgante de 384 pocillos para la formación de esferoides 3D es una herramienta fácilmente implementada para cualquier laboratorio de biología celular o biología del cáncer. Esta plataforma fisiológica permite el estudio de líneas celulares, así como muestras de pacientes primarios dentro de cultivos 3D fisiológicamente relevantes, al tiempo que permite la detección de fármacos de alto rendimiento. La plataforma también garantiza que las condiciones de cultivo sean altamente ajustables, lo q...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado principalmente por DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer y Michigan Ovarian Cancer Alianza. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA046592. CMN cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca Grant No. 1256260. MEB cuenta con el apoyo de la beca del Departamento de Educación para graduados en áreas de necesidad nacional (GAANN).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% tripsina-EDTAGibco ILT25200056
10 mL pipeta serológicaFisher Scientific13-678-11E
10.000 cSt Aceite de SiMillipore Sigma63148-62-9Se utiliza para recubrir el molde de matriz de esferoides para facilitar la eliminación de los geles de procesamiento de tejidos, como Histogel, del molde.
Placa de cultivo de tejidos de 100 mmThermo Scientific130182
tubo cónico de 15 mLCelltreatFL4021
1x DMEM para medio libre de sueroGibco11965-092
1x F12 para medio libre de sueroGibco11765-054
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)GibcoILT10010023
4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo FisherD1306
40 µ m filtroFisher Scientific22363547
placa de 6 pocillosFisher Scientific353046
AccutaseInnovative Cell Technologies Inc.1449Una enzima suave de desprendimiento celular compuesta de enzimas proteolíticas y colagenolíticas.
ACK Lysing BufferThermo ScientificA1049201
alamarBlueInvitrogenDAL1025colorante de resazurina utilizado para medir la viabilidad y la proliferación de células en función de su capacidad para reducir la resazurina a resorufina, que es altamente fluorescente.
Kit de ensayo ALDEFLUORStem Cell Tech1700Kit para identificar células madre y progenitoras que expresan altos niveles de aldehído deshidrogenasa, un indicador de células madre cancerosas. El kit está compuesto por el reactivo ALDEFLUOR, DEAB, ácido clorhídrico, dimetilsulfóxido y tampón de ensayo ALDEFLUOR.
ALDEFLUOR Dietilaminobenzaaldehído (DEAB)Stem Cell Tech1705El dietilaminobenzaaldehído (DEAB) es un inhibidor de las isoenzimas de ALDH, que se utiliza para determinar la tinción inespecífica de ALDH.
Cámara CCD Andor iXon x3OxfordInstruments-Antibióticos
y AntimicóticosGibco15240-062
APC-isotipo IgG2bMiltenyi biotec130-092-217Control de isotipos para cuantificar la tinción inespecífica de anticuerpos IgG2b.
Suplemento B27Gibco17504044
básico Factor de crecimiento de fibroblastosTecnologías de células madre78003.1
BD Lo-Dose U-100 Jeringas de insulinaFisher Scientific14-826-79
BioTek Synergy HT Lector de microplacasBioTek7091000
CD133-APCMiltenyi biotec130-113-184Anticuerpo fluorescente dirigido a CD133, un marcador de células madre cancerosas.
cellSens Dimension SoftwareOlympus
CisplatinoSigma-AldrichP4394Agente quimioterápico a base de platino que funciona como un agente alquilante que altera el ADN.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)InvitrogenD1306
Factor de crecimiento epidérmicoGibcoPHG0311
EVOS XL Sistema de imágenes celularesTechnologies AME3300
Suero fetal bovino - premium (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Ficoll 400Sigma-AldrichF4375
HemacitómetroHausser Scientific1490
HistogelThermo ScientificHG-4000-012Gel de procesamiento de tejidos que puede penetrar y mantener la muestra dentro del gel al tiempo que evita la decoloración alrededor de la muestra al teñirla.
Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposohumano LonzaPT-5006
Células endoteliales microvasculares humanasLonzaCC2543
Suplemento de insulina-transferrina-selenioGibco51500-056
Kit de viabilidad vivo/muertoInvitrogenL3224Kit para la detección basada en fluorescencia de células vivas (calceína-AM) y muertas (Ethidium Homodimer-1).
MEM Aminoácidos no esencialesGibco11140-050
MetaMorph 7.8 SoftwareMolecularDevices-Olympus
IX81 Microscopio confocal invertidoOlympus-Olympus
IX83 Research Microscopio invertidoOlympus
Parafilm MThomas Scientific7315D35Tiras de polímero termoplástico que sirven para limitar la evaporación de las gotas en las placas colgantes y, al mismo tiempo, permiten el intercambio de gases.
Perfecta 3D 384 Placas colgantes para pocillos3D BiomatrixHDP1384-8Disponible a través de Sigma-Aldrich
faloidina AlexaFluor488InvitrogenA12379La faloidina es un péptido para marcar fluorescentemente la F-actina en células fijas.
ProJet 3500 HD Max3DSystems-Impresora3D
Agua DI estérilFisher Scientific353046
Azul de tripánGibco15250061colorante azoico utilizado para diferenciar entre células vivas y muertas en función de su capacidad para pasar a través de la membrana dañada de las células muertas, pero no a la membrana intacta de las células vivas.
VisiJet M3 Crystal3DSystems-Unmaterial polimérico biocompatible para impresión 3D.
Unidad de escáner confocal CSU-X1 de YokogawaYokogawa-
centrales Life ,

Referencias

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