Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la enfermedad.
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Artículo de método
Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer
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En este artículo
Resumen
Resumen
En este protocolo, delineamos el procedimiento para la generación de esferoides tumorales dentro de gotas colgantes de 384 pozos para permitir la detección de alto rendimiento de las terapias contra el cáncer en un microambiente fisiológicamente representativo. Delineamos la formación de esferoides de células madre de cáncer derivados del paciente, así como la manipulación de estos esferoides para un análisis exhaustivo después del tratamiento farmacológico. Específicamente, describimos la recopilación de morfología esferoide, proliferación, viabilidad, toxicidad de fármacos, fenotipo celular y datos de localización celular. Este protocolo se centra en gran medida en las técnicas de análisis que se implementan fácilmente utilizando la plataforma de caída colgante de 384 pozos, por lo que es ideal para la detección de drogas de alto rendimiento. Si bien enfatizamos la importancia de este modelo en los estudios de cáncer de ovario y la investigación de células madre del cáncer, la plataforma de 384 pozos es susceptible a la investigación de otros tipos de cáncer y modelos de enfermedades, extendiendo la utilidad de la plataforma a muchos campos. Al mejorar la velocidad del cribado personalizado de drogas y la calidad de los resultados de cribado a través de cultivos 3D fisiológicamente representativos de fácil implementación, se prevé que esta plataforma ayude al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de tratamiento, y por lo tanto tienen un amplio impacto clínico.
Introducción
La mortalidad mundial relacionada con el cáncer alcanzó unpeaje de 9,8 millones de muertes en 2018 1, lo que puso de relieve la necesidad de mejorar la terapia. Desafortunadamente, el costo del desarrollo de medicamentos contra el cáncer está aumentando, y el desarrollo de un solo medicamento cuesta aproximadamente 650 millones de dólares,lo que indica la necesidad de mejorar las estrategias para desarrollar nuevos medicamentos contra el cáncer. Se cree que las células madre cancerosas (CSC), que se caracterizan por un aumento de la quimiorresistencia3,la capacidad de auto-renovarse y la capacidad....
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Protocolo
Todas las muestras de pacientes se recogen bajo un protocolo IRB aprobado de pacientes que consienten, cuyas muestras se desidentifican después de la desbultamiento del tumor y la recolección de ascitis.
1. Generación de esferoides a partir de números de celda pequeña en placas colgantes colgantes de 384 pocillos
- Coloque la placa colgante en un sonicador lleno de agua estéril desionizada (DI) y sonicar durante 20 minutos.
- Con una mano enguantada, retire el plato del sonicador y lávelo con agua DI corriente.
- Deje que la placa se quede en un baño de ácido plurónico al 0,1% durante 24 horas para evitar la adsorció....
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Resultados
Los esferoides formados con líneas celulares o CSS derivados del paciente se pueden formar con un rango de números de células pequeñas dentro de gotas colgantes (Figura2A). Los esferoides se forman de forma fiable con tan solo 10 células por pozo, lo que permite la conservación de muestras de pacientes poco frecuentes. Las células dentro de estos esferoides están rodeadas por otras células en 3 dimensiones, ya que estarían in vivo, lo que permite contactos fisiológicos de células celulares y.......
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Discusión
La plataforma de placacolgante colgante de 384 pocillos para la formación de esferoides 3D es una herramienta fácilmente implementada para cualquier laboratorio de biología celular o biología del cáncer. Esta plataforma fisiológica permite el estudio de líneas celulares, así como muestras de pacientes primarios dentro de cultivos 3D fisiológicamente relevantes, al tiempo que permite la detección de fármacos de alto rendimiento. La plataforma también garantiza que las condiciones de cultivo sean altamente ajustables, lo q.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado principalmente por DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer y Michigan Ovarian Cancer Alianza. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA046592. CMN cuenta con el apoyo de la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca Grant No. 1256260. MEB cuenta con el apoyo de la beca del Departamento de Educación para graduados en áreas de necesid....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco ILT25200056 | ||
| 10 mL pipeta serológica | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10.000 cSt Aceite de Si | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Se utiliza para recubrir el molde de matriz de esferoides para facilitar la eliminación de los geles de procesamiento de tejidos, como Histogel, del molde. |
| Placa de cultivo de tejidos de 100 mm | Thermo Scientific | 130182 | |
| tubo cónico de 15 mL | Celltreat | FL4021 | |
| 1x DMEM para medio libre de suero | Gibco | 11965-092 | |
| 1x F12 para medio libre de suero | Gibco | 11765-054 | |
| 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µ m filtro | Fisher Scientific | 22363547 | |
| placa de 6 pocillos | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | Una enzima suave de desprendimiento celular compuesta de enzimas proteolíticas y colagenolíticas. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | colorante de resazurina utilizado para medir la viabilidad y la proliferación de células en función de su capacidad para reducir la resazurina a resorufina, que es altamente fluorescente. |
| Kit de ensayo ALDEFLUOR | Stem Cell Tech | 1700 | Kit para identificar células madre y progenitoras que expresan altos niveles de aldehído deshidrogenasa, un indicador de células madre cancerosas. El kit está compuesto por el reactivo ALDEFLUOR, DEAB, ácido clorhídrico, dimetilsulfóxido y tampón de ensayo ALDEFLUOR. |
| ALDEFLUOR Dietilaminobenzaaldehído (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | El dietilaminobenzaaldehído (DEAB) es un inhibidor de las isoenzimas de ALDH, que se utiliza para determinar la tinción inespecífica de ALDH. |
| Cámara CCD Andor iXon x3 | Oxford | Instruments-Antibióticos | |
| y Antimicóticos | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotipo IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Control de isotipos para cuantificar la tinción inespecífica de anticuerpos IgG2b. |
| Suplemento B27 | Gibco | 17504044 | |
| básico Factor de crecimiento de fibroblastos | Tecnologías de células madre | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Jeringas de insulina | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Lector de microplacas | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Anticuerpo fluorescente dirigido a CD133, un marcador de células madre cancerosas. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatino | Sigma-Aldrich | P4394 | Agente quimioterápico a base de platino que funciona como un agente alquilante que altera el ADN. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato) | Invitrogen | D1306 | |
| Factor de crecimiento epidérmico | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Sistema de imágenes celulares | Technologies AME3300 | ||
| Suero fetal bovino - premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacitómetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Gel de procesamiento de tejidos que puede penetrar y mantener la muestra dentro del gel al tiempo que evita la decoloración alrededor de la muestra al teñirla. |
| Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo | humano Lonza | PT-5006 | |
| Células endoteliales microvasculares humanas | Lonza | CC2543 | |
| Suplemento de insulina-transferrina-selenio | Gibco | 51500-056 | |
| Kit de viabilidad vivo/muerto | Invitrogen | L3224 | Kit para la detección basada en fluorescencia de células vivas (calceína-AM) y muertas (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular | Devices-Olympus | |
| IX81 Microscopio confocal invertido | Olympus-Olympus | ||
| IX83 Research Microscopio invertido | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Tiras de polímero termoplástico que sirven para limitar la evaporación de las gotas en las placas colgantes y, al mismo tiempo, permiten el intercambio de gases. |
| Perfecta 3D 384 Placas colgantes para pocillos | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Disponible a través de Sigma-Aldrich |
| faloidina AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | La faloidina es un péptido para marcar fluorescentemente la F-actina en células fijas. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D | Systems-Impresora | 3D |
| Agua DI estéril | Fisher Scientific | 353046 | |
| Azul de tripán | Gibco | 15250061 | colorante azoico utilizado para diferenciar entre células vivas y muertas en función de su capacidad para pasar a través de la membrana dañada de las células muertas, pero no a la membrana intacta de las células vivas. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D | Systems-Un | material polimérico biocompatible para impresión 3D. |
| Unidad de escáner confocal CSU-X1 de Yokogawa | Yokogawa | - |
Referencias
- All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575....
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Reimpresiones y permisos
