Summary
Vi beskriver ett protokoll som utnyttjar fluorescens in situ hybridisering (fisk) för att visualisera flera herpesviral RNAs inom lytiskt infekterade mänskliga celler, antingen i suspension eller anhängare. Detta protokoll omfattar kvantifiering av fluorescens som producerar ett nukleocytoplasmatiska förhållande och kan utökas för samtidig visualisering av värd-och virusproteiner med immunofluorescensbildning (IF).
Abstract
Mekanistisk insikt kommer från noggrann undersökning och kvantifiering av specifika RNAs och proteiner. De relativa platserna för dessa biomolekyler i hela cellen vid bestämda tidpunkter kan fångas med fluorescens i situ-hybridisering (fisk) och immunofluorescenser (IF). Under lytisk herpesvirusinfektion, viruset kapar värdcellen att företrädesvis uttrycka virala gener, orsakar förändringar i cellmorfologi och beteende av biomolekyler. Lytic aktiviteter centreras i kärn-fabriker, kallat viral Replication delar upp, som är urskiljbara med fisken och om. Här beskriver vi ett anpassningsbart protokoll av RNA-fisk och om tekniker för Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV)-infekterade celler, både vidhäftande och i suspension. Metoden omfattar steg för utveckling av specifika anti-Sense oligonukleotider, dubbelrna-fisk, RNA-fisk med IF och kvantitativa beräkningar av fluorescensintensitet. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på flera celltyper, icke-infekterade celler, latent celler, lytiska celler, tidsförlopp, och celler som behandlats med hämmare för att analysera spatiotemporal aktiviteter av specifika RNAs och proteiner från både den mänskliga värden och KSHV.
Introduction
I deras lytiska (aktiva) fas, herpesviruses kapa värdcellen, orsakar förändringar i cellmorfologi och lokalisering av biologiska molekyler, att producera virioner. Basen för verksamheten är kärnan, där den dubbelsträngade DNA viral genomet replikeras och förpackas i ett protein skal, kallas en kapsid1. Till att börja med, viruset uttrycker sina egna proteiner, kapning värd maskiner och förhindra uttryck för icke-väsentliga värdgener, en process som kallas värd avstängnings effekten. Majoriteten av denna verksamhet är lokaliserad till specifika 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-fria kärnkrafts regioner kallas viral replikering fack, bestående av både värd och virala proteiner, RNAs, och viral DNA2. Cellen är översyn för att ge utrymme och resurser för replikering fack och därmed montering av viral capsids. När kapsid lämnar kärnan, hur kapsid är höljeförsedda i cytoplasman för att producera en membran-bunden viral partikel, även känd som en Virion, är oklart. Förståelse för lokalisering och rumsliga förändringar av både värd-och viral biomolekyler under den lytiska fasen ger djupare mekanistisk insikt i arrangemanget av replikeringsutrymmet, värd avstängnings effekt, Virion-egress-vägen och andra processer relaterade till herpesviral infektion och replikering.
För närvarande den bästa metoden för att upptäcka och studera dessa förändringar är visualisering av proteiner och RNAs i infekterade celler med immunofluorescens (IF) och fluorescerande in situ hybridisering (fisk), respektive. Användning av en tids kurs med dessa tekniker avslöjar lokaliseringen av biomolekyler vid viktiga punkter i den lytiska fasen eller helt enkelt spatiotemporal data. FISKA och om komplettera andra biokemiska tekniker, såsom hämning av en cellulär process (t. ex. hämning av viral DNA-replikation), RT-qPCR (realtid polymeraskedjereaktion), RNA-sekvensering, nordlig blotting, masspektrometri, västerländsk analys av viral DNA-produktion, som kan ge en mer global bild av cellulära aktiviteter.
Vi utvecklade RNA-FISKSTRATEGIER för att undersöka RNA-produkter från specifika gener och en beräknings analys som kvantitativt beräknar det nukleocytoplasmiska förhållandet hos en specifik genprodukt. Provberedningen, modifierad från tidigare publikationer av Steitz och kollegor3,4, är relativt lätt och kan användas för både anhängare och suspenderade celler. Protokollet är också anpassningsbart för samtidig användning av flera RNA-fiskstrategier (dubbelrna-fisk) eller RNA-fisk med IF-strategier. Utveckling av en specifik fisk strategi är utmanande, men förslag för att förbättra framgången beskrivs. Den dataanalys som beskrivs här är kvantitativ om fluorescerande pärlor och starka markörer för fack gränser används och ger ytterligare insikt i mikrografer, insikt som tar bort observation bias. Det detaljerade protokollet är utformat för både latent och lytiska celler infekterade av Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) och kan användas med icke-infekterade celler eller celler infekterade av andra herpesviruses5. Metoderna för kvantifiering är tillämpliga på studier av nukleocytoplasmatiska förändringar eller omlokalisering mellan subcellulära fack i de flesta celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utformning av fluorescens in situ (FISH) anti-Sense oligonukleotides för att upptäcka en specifik herpesviral avskrift
- Välj 25 till 40 NT segment från sekvensen av RNA av intresse och konvertera för att vara anti-Sense. En lyckad fisk strategi kan innehålla från en upp till tio eller flera olika anti-Sense oligonukleotides. Tänk på följande när du väljer sekvenser:
- Om RNA av intresse innehåller en unik upprepa region, sedan kapitalisera på den här funktionen och designa en anti-Sense oligonukleotide att rikta upprepningssekvens.
Obs: Tycowski och kollegor5 ge ett exempel på denna strategi med Rhesus rhadinovirus (RRV) polyadenylerade nukleära (Pan) RNA. - Om RNA av intresse innehåller en känd protein-bindande plats eller stam-loop struktur, design oligonukleotides att undvika dessa regioner.
- Beroende på målen för experimenten, överväga intronic sekvens och om att utforma en anti-Sense oligonukleotid för det.
- Om RNA av intresse innehåller en unik upprepa region, sedan kapitalisera på den här funktionen och designa en anti-Sense oligonukleotide att rikta upprepningssekvens.
- Utföra enkla beräknings analyser på valda anti-Sense sekvenser för att säkerställa bindande specificitet och reducera aggregering av anti-Sense oligonukleotid.
- Sekvenserna måste vara cirka 50% GC-rika (hög guanin och cytosin innehåll) och har en smälttemperatur i intervallet 60 till 70 ° c.
- Använd ett sekvensanalysator verktyg för att välja sekvenser som inte själv dimerize eller form hårnålar med smält temperaturer över 37 ° c, hybridisering temperatur.
- Utföra en ncbi blastn (nationellt centrum för bioteknik information Basic Local Alignment search Tool för nukleotidalignments) Sök efter de valda sekvenser mot både värd och viral transkriptom med "något liknande" inställning. Denna sökning kommer att identifiera unika anti-Sense oligonukleotides som sannolikt inte kommer att binda till andra värd eller viral avskrifter.
Obs: om transkriptom inte är tillgängliga, utföra Blast sökning med genomisk sekvenser. Det är idealiskt om sökningarna utförs på sekvenser från viruset isolerade från de infekterade cellerna som används i experimentet eftersom vilda stammar tenderar att diversifiera och innehåller en kombination av sekvenser från olika Lab stammar.
- Beställ renad DNA oligonukleotides motsvarande den anti-Sense sekvens som har verifierats beräkningsmässigt att vara unik och sannolikt att binda till målet RNA. Inga särskilda modifieringar behöver införas i oligonukleotiderna.
- Testa den konstruerade anti-Sense oligonukleotides för bindande specificitet av fisk och Northern blot.
- Använda en oinfekterad cell-linje från samma värdarter (t. ex., 293T) och helst samma celltyp, genomföra en transfektion med en Plasmid uttrycker RNA av intresse från en robust promotor (CMV, cytomegalovirus) och en med den tomma vektorn (t. ex., pcDNA3). Använd en positiv kontroll för transfektion såsom Co-transfektion med en GFP (grönt fluorescerande protein) plasmid (t. ex., pmaxGFP) eller vektorn som innehåller GFP.
Anmärkning: det är viktigt att undvika cell-linjer som har förevigat med herpesvirus Epstein-Barr-virus (EBV) eftersom det finns sekvens likheter mellan herpesviruses. - Utför fisk enligt beskrivningen i avsnitt 3 på båda cell uppsättningarna med de anti-Sense oligonukleotider som beskrivs i detta protokoll. Härleda de framgångsrika kandidaterna genom att jämföra fisk experiment med enskilda, par eller uppsättningar av anti-Sense oligonukleotides. Använd en positiv kontroll för FISH-protokollet som U2 snRNA (små nukleära RNA) fisk, närvarande vid 500 000 kopior per Human cell Nucleus6 (tabell 1).
- Den fluorescerande signalen bör vara specifik och stark i den cell som innehåller RNA av intresse. Designa ytterligare anti-Sense oligonukleotides att stärka signalen och ta bort anti-Sense oligonukleotides som binder nonspecifikt från övervägande. Signal styrkan måste vara över bakgrund och autofluorescence.
- Testa bindande specificitet av Northern blot.
- Använda en oinfekterad cell-linje från samma värdarter (t. ex., 293T) och helst samma celltyp, genomföra en transfektion med en Plasmid uttrycker RNA av intresse från en robust promotor (CMV, cytomegalovirus) och en med den tomma vektorn (t. ex., pcDNA3). Använd en positiv kontroll för transfektion såsom Co-transfektion med en GFP (grönt fluorescerande protein) plasmid (t. ex., pmaxGFP) eller vektorn som innehåller GFP.
2. oligonukleotid och cell beredning
- Efter tillverkarens anvisningar använder du Terminal transferas för att märka de anti-Sense oligonukleotides med dioxigenin (dig)-dutp eller, om starkt bindande, direkt med en fluorescerande nukleotid som Alexa fluor 594-5-dutp. Efter märkning, ytterligare rening är inte nödvändigt. Förvara märkta oligonukleotides vid-20 ° c upp till flera år och i aluminiumfolie om direkt märkta för att förhindra foto blekning.
Varning: märkningen lösningen innehåller ett giftigt material, kalium cacodylate. Hantera etiketter reaktioner med handskar.
Anmärkning: för att spara resurser, flera olika anti-Sense oligonukleotides kan märkas i en reaktion. Detta protokoll utnyttjar 3 '-End märkning. Intern märkning är utmanande eftersom den kemiska gruppen (t. ex. gräva eller fluorophore) fastnar eller inte kan komma in den aktiva platsen för en DNA-polymeras. Ett experiment med två olika RNAs kan utföras med hjälp av direkt-märkta anti-Sense oligonukleotides och anti-gräva immunofluorescens med en annan fluorophore (e.g., FITC (fluorescein) eller Alexa fluor 488 med Alexa fluor 594). - Följ cellerna till åtta kammar bilder.
Obs: åtta kammare diabilder tillåta flera samtidiga experiment samtidigt minimera värdefulla resurser som antikroppar. Ett alternativ till åtta kammare diabilder är en sex-och vävnadsodling tallrik med standard täckglas (22 mm x 22 mm) som är både sterila. Ett liknande arrangemang är möjligt med cirkulära täckband och en 24-brunn vävnad kultur plattan. För båda, öka de volymer som nämns i detta protokoll med 10-15x (t. ex. 1,75 mL hybridiseringslösning), och 4x (t. ex., 600 μL hybridiseringslösning) respektive.- För anhängare lytiska celler, Använd 1x trypsin/PBS vid 37 ° c och 5% CO2 för 10 min att suspendera celler och späd till 60% confluency.
Obs: vidhäftande cellinjer som används i fisk experiment ingår 293T, iSLK. 2197, och islk-BAC36 celler8. - Applicera 200 μL cellsuspension i varje kammare i de sterila åtta-chambered bilderna och tillåta frö tillväxt för 12-24 h vid 37 ° c och 5% CO2. Justera efter behov för långsamma eller snabbväxande celler och för celler som lätt skadas av trypsin.
Obs: målet är att ha jämnt fördelade celler ordentligt fäst vid bilden. Överväg att inducera lytisk fas efter vidhäftning om de lytiska cellerna är bräckliga. Slutsatser hämtade från experiment med iSLK celler är begränsade9. - För lytiska suspension-celler, pre-behandla åtta kammare diabilder med 1:10 Poly L-lysin för 5 min under vävnad kultur huva. Låt sedan bilderna torka över natten i rumstemperatur eller 1 h vid 65 ° c. Inkubera 800 μL av lytiska celler i en koncentration av 1 x 106 celler/ml med kamrade glidbanorna i 30 min till 1 h vid 37 ° c och 5% Co2.
Obs: suspension-celler kommer att bosätta sig i en monolayer, fastnar på Poly L-lysin och därmed överskott celler är inte ett problem i jämförelse med anhängare celler. Lytiska celler som bildar druva kluster, om möjligt, bör separeras med mild vortexa eller kemiska medel. Visserligen har författarna inte haft stor framgång med sådana rekommendationer när det gäller lytiska BJAB-RRV-GFP-celler. Om suspension-celler inte fastnar väl, överväga att öka antingen tiden eller koncentrationen av poly L-lysin inkubering.
- För anhängare lytiska celler, Använd 1x trypsin/PBS vid 37 ° c och 5% CO2 för 10 min att suspendera celler och späd till 60% confluency.
3. fixering, immunofluorescens (frivillig), hybridisering och visualisering av viral RNAs
- Ta bort media och överflödiga celler. Under hela detta protokoll, Använd vakuumsugning för att ta bort lösningar och skonsam mikropipettering för att lägga till lösningar.
Obs: styrkan hos ett vakuum kan reduceras genom att placera en 200 μL mikropipett med spetsen över glaset Pastorpipetten. Byt ut mikropipettspetsen mellan tvätt stegen för att förhindra kontaminering. Varje tvättsteg måste utföras snabbt eftersom det är absolut nödvändigt att cellerna aldrig torkar ut. - Omedelbart, fixera cellerna med förkyld 4% formaldehyd/PBS (fosfatbuffrad saltlösning) på is under 30 min. Tvätta cellerna tre gånger med 200 μL 1x PBS kyld till 4 ° c och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur eller på is.
- Permeabilize de fasta cellerna med 200 μL av pre-kylda 0,5% Triton-X/PBS (fosfatbuffrad saltlösning) för 10 min på is eller 750 μL av pre-kyld 70% etanol vid 4 ° c för 1 h (min) till 7 d (max).
Anmärkning: samla in protein, totalt RNA och genomisk DNA-prover vid tidpunkten för fixering för att säkerställa överensstämmelse mellan bilder och biokemiska analyser. Alla tvättar i hela detta protokoll utförs på samma sätt om inte annat anges. 70% etanol Lösgör limmet mellan kamrarna och bilden, vilket underlättar senare separation, och ger också en betydande paus i protokollet. Icke desto mindre, använda paraffin film runt kammaren glida för att minska avdunstning och kontrollera nivån på etanol i varje kammare ungefär var 8 h. 70% etanol också flackar cellerna, vilket gör en skarpare bild, medan Triton-X inte torkar cellerna och ändra cellens dimensioner.
- Permeabilize de fasta cellerna med 200 μL av pre-kylda 0,5% Triton-X/PBS (fosfatbuffrad saltlösning) för 10 min på is eller 750 μL av pre-kyld 70% etanol vid 4 ° c för 1 h (min) till 7 d (max).
- Avlägsna kamrarna noga för att förhindra sprickbildning i bilden. Om experimentet innehåller immunofluorescens (om) av ett virus eller värd protein med en polyklonala primär antikropp, utför om som beskrivs nedan innan du fortsätter till RNA-fisk. Om immunofluorescensen använder en monoklonal primär antikropp ska du utföra immunofluorescensering enligt beskrivningen i steg 3.3.1 efter steg 3,11.
Obs: Använd en ny borttagnings anordning eller en med mycket lite överblivna lim som tillhandahålls av tillverkaren och försiktigt underlätta kamrarna bort för att förhindra att bilden från sprickbildning. Med 70% etanol som permeabiliserande reagens för 4 h minskar kraftigt sannolikheten för sprickbildning. I fallet med en spricka, fortsätta protokollet om avdelningar som inte påverkas av sprickan och vara uppmärksam på den högre oxidations graden av ofullständigt förseglade diabilder (dvs. minskad lagringstid).- Skölj celler med förkyld 1x PBS och blockera med pre-kyld 4% BSA (bovint serum albumin)/1x PBS i 30 min vid 4 ° c.
Anmärkning: användning av BSA i hela detta protokoll begränsar icke-specifik märkning. - Ta bort blockerande lösning och inkubera cellerna med 1:200 eller en annan polyklonala primär antikropp i 0,1% BSA/1x PBS för 1 h vid 4 ° c. Tvätta sedan tre gånger med 1x PBS.
Anmärkning: en antikropp10 för detektion av SSB/ORF6 (viral enkelsträngad DNA-bindande protein) användes vid 1:200 utspädning. - Inkubera cellerna med en sekundär antikropp med fluorophore kompatibel med den fisk-detekterande antikroppen i 1 h vid 4 ° c. Tvätta tre gånger med 1x PBS. Sedan Fix med 4% formaldehyd/1x PBS för 10-15 min och permeabilize med antingen Triton-X eller 70% etanol som tidigare beskrivits innan du fortsätter att fiska. Täckglas med plåtfolie för att bevara fluorescerande signal och förhindra foto blekning.
- Skölj celler med förkyld 1x PBS och blockera med pre-kyld 4% BSA (bovint serum albumin)/1x PBS i 30 min vid 4 ° c.
- Tvätta cellerna med 2x SSC (saltlösning natriumcitrat) en gång och applicera sedan 45 μL hybridiseringslösning bestående av 50% formamid, 10% dextransulfat, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 μg/mL laxspermadna, 125 μg/mL E. coli tRNA och 1 mm Vanadyl ribonucleosid Komplex. Inkubera i 1 h vid 37 ° c i en fuktighets kammare som kan vara en 150 mm petriskål med fuktade sterila våtservetter.
Anmärkning: Förbered färsk hybridiseringslösning minst en timme före användning. Lös dextran sulfat i vatten först, vortexa ofta och inkuberande i en 37 ° c vattenbad. - Beräkna för att ha en föreslagen koncentration av 25 μM oligonukleotides i 35-uL hybridiseringslösning per kammare. Justera koncentrationen av anti-Sense oligonukleotid efter behov. Tillsätt destillerat vatten till oligonukleotiderna för att bringa denatureringvolymen till 10 μL.
Anmärkning: efter märknings reaktionen lagras oligonukleotider i den kylda lösningen som innehåller 0,18 M kalium cacodylate, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl2, 18 mm edta, 2,7 mm K-fosfat och 6,8 mm kcl, 45 μm 2-merkaptoetanol, 0,02% Triton X-100 och 2% glycerol. Koncentrationerna är tillräckligt höga för att spädningen med vatten skall ge denatureringslösningen till koncentrationer nära 1x TE (10 mM Tris-HCl och 1 mM EDTA), en standard buffert för oligonukleotiddenaturering. - Denaturera gräva-och/eller Alexa fluor 594-märkta oligonukleotides vid 95 ° c i 5 min. Tillsätt sedan 35 μL färsk hybridiseringslösning per avsedd kammare till de denaturerade oligonukleotiderna. Om du utför dubbel fisk, kan båda uppsättningarna av anti-Sense oligonukleotides denatureras och hybridiseras tillsammans.
- Ta bort pre-hybridisering lösning och sedan lägga hybridisering lösning som innehåller den märkta oligonukleotides till cellerna. Inkubera över natten i luftfuktighets kammaren vid 37 ° c med aluminiumfolie för att skydda de fluorophore-märkta oligonukleotiderna.
Observera: inkubering ska vara minst 10 h och högst 24 timmar. - Nästa dag, tvätta cellerna två gånger med 2x SSC i 10 min vid 37 ° c och sedan två gånger med 1x SSC i 10 min vid 25 ° c.
- Fixera cellerna med förkyld 4% formaldehyd/1x PBS för 10-15 min på is. Tvätta sedan cellerna med PBS tre gånger och permeabilize för 1 h med förkyld 70% etanol eller 10 min med pre-kylda 0,5% Triton-X/1x PBS vid 4 ° c.
- Inkubera cellerna med 1:200 anti-DIG FITC i pre-kyld 0,1% BSA/1x PBS för 1 h vid 4 ° c. Ta bort antikroppslösningen och tvätta tre gånger med 1x PBS.
- Fix med pre-kyld 4% formaldehyd/1x PBS för 10-15 min vid 4 ° c och sedan tvätta tre gånger med 1x PBS. Om du utför immunofluorescens för en värd eller viral protein med en monoklonal primär antikropp, permeabilisera cellerna och sedan utföra IF-protokollet som beskrivs i steg 3.3.1. Annars gå vidare till DAPI-färgning.
- Inkubera cellerna med 0,4 μg/mL DAPI i pre-kyld 0,5% Triton-X/1x PBS för 15 min på is och sedan tvätta tre gånger med 1x PBS.
- Montera diabilder med fluorescerande pärlor (tillval) och ett monteringsmedium. Försegla täckglaset till bilden med genomskinligt nagellack.
- Med hjälp av ett konfokal Mikroskop, samla bilder av proverna inom en timme till en vecka av att utföra protokollet på 630x förstoring. Applicera flera skikt av nagellack för att täta locket slip och förlänga fluorophore liv genom att minska graden av oxidation.
Obs: Använd inte ett DAPI-innehållande monteringsmedium. När du samlar in bilderna, inkludera skalstapeln på varje bild för senare kvantifiering. Fluorescerande pärlor fungerar som kontroller av fluorescensintensitet mellan glidmedel och prov preparat11. Hämta bilder i mellandelen av cellen för tvådimensionell (2D) kvantifiering i steg 4.
4. kvantifiering av fisk och om bilder för att markera subcellulär lokalisering och för att bestämma nukleocytoplasmic förhållandet av fluorescens
- Utför bildanalys på en monterad bunt av de olika fluorescerande-färgade och sammanslagna bilder för att säkerställa konsekvens. Ange skalan för bildanalys programmet med hjälp av skalstapeln som inkluderas när bilderna samlades in.
- För att kvantifiera fluorescens intensitet över flera kanaler och i förhållande till den nukleära DAPI fläcken, använda ett linje verktyg och en Plot-profilfunktion. Ange sedan raden permanent på en kopia av bilden med hjälp av markörer som inte blockerar eller påverkar tittarens omdöme.
- Fastställa kriterier för att vägleda där linjen ritas som ett spår som fångar en mångfald av topografiska egenskaper, toppar och dalar, längs en central axel eller en linje som inte korsar övermättade områden.
Anmärkning: dessa linje spår skildrar rå fluorescens i en cell och därmed är begränsade till jämförelser av platserna för en fläck, inte intensitet. För att jämföra intensiteter av samma fläcken mellan diabilder, behandlingar eller preparat, Lägg till en fluorescerande pärla i bilden som en intern kontroll under steg 3,13. Den fluorescerande pärla måste läggas under monteringsprocessen och detekteras med samma inställningar på excitation laser och Fotomultiplikator röret (konfokala).
- Fastställa kriterier för att vägleda där linjen ritas som ett spår som fångar en mångfald av topografiska egenskaper, toppar och dalar, längs en central axel eller en linje som inte korsar övermättade områden.
- För att kvantifiera ett skifte i subcellulär lokalisering, beräkna nukleocytoplasmiska nyckeltal av celler som genomgår olika behandlingar.
- Mät arean och råfluorescensintensiteten hos både kärnan och cytoplasman med hjälp av den nukleära DAPI fläcken för att ställa in den inre gränsen. Inkludera nukleära och cytoplasmiska kontroller såsom ett nukleärt RNA (t. ex., KSHV PAN RNA) och cytoplasmiska RNA (t. ex. värd GAPDH mRNA). Dessutom beräkna bakgrundsintensitet för tre cell-liknande områden och genomsnittet värdena per pixel eller μm2.
Obs: intensitetsvärden tenderar att sakna enheter och därför används termen "enheter". - Normalisera både nukleära och cellulära råintensitetsvärden genom att först bestämma den genomsnittliga bakgrunden för samma område och sedan subtrahera det individualiserade värdet från råintensiteten i området.
- En kärna av en lytisk B-cell har till exempel en yta på 133,4 μm2 och en rå intensitet på 75976 enheter medan bakgrundsintensiteten för samma fluorescerande signal fastställdes till 0,67 enheter per μm2. Den normaliserade kärnkrafts nivån skulle
- En kärna av en lytisk B-cell har till exempel en yta på 133,4 μm2 och en rå intensitet på 75976 enheter medan bakgrundsintensiteten för samma fluorescerande signal fastställdes till 0,67 enheter per μm2. Den normaliserade kärnkrafts nivån skulle
- Ange värdena i följande ekvation.
ANMÄRKNINGAR: denna beräkning styr för förändringar i subcellulära området. Lytisk induktion och läkemedelsbehandling kan förstora kärnan eller ändra storleken på cellen, respektive. - För att tolka resultaten, skapa en låda morrhår Plot. En jämn fördelning av den fluorescerande signalen skulle vara nära noll, medan en nukleär distribution skulle gynna ett positivt förhållande värde och en cytoplasmisk fördelning skulle trenden mot ett negativt förhållande värde.
- Mät arean och råfluorescensintensiteten hos både kärnan och cytoplasman med hjälp av den nukleära DAPI fläcken för att ställa in den inre gränsen. Inkludera nukleära och cytoplasmiska kontroller såsom ett nukleärt RNA (t. ex., KSHV PAN RNA) och cytoplasmiska RNA (t. ex. värd GAPDH mRNA). Dessutom beräkna bakgrundsintensitet för tre cell-liknande områden och genomsnittet värdena per pixel eller μm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISKEN och om metoder som beskrivs i detta manuskript visas i figur 1 tillsammans med kvantifieringen av resultaten genom spår av fluorescerande intensitet. De resultat som presenteras här är semi-kvantitativa och ger insikt i lokalisering, snarare än i jämförelser mellan intensiteter av olika fluorescerande fläckar eftersom experiment inte innehöll en fluorescerande pärla i bilden preparatet. Figur 1 avslöjar också att cytoplasmiska och nukleära områden och deras nyckeltal är olika för latent och lytiska KSHV-infekterade celler. Sålunda, området styrs i nucleocytoplasmic förhållandet utställningsmonter i figur 2. Figur 2 validerar den beräkning som beskrivs i detta manuskript för en nukleocytoplasmic förhållande med användning av en nukleär kontroll, viral polyadenylerade nukleära (Pan) RNA, och en cytoplasmisk kontroll, värd GAPDH mRNA. Figur 3 visar att när KSHV DNA-replikering hämmas i den lytiska fasen genom användning av antingen fosfonoättiksyra (DOXY + PAA) eller cidofovir (Doxy + cido), den tidiga ORF59-58 avskriften skiftar till en övervägande cytoplasmiska lokalisering. Mikrograferna och de två kvantifieringsmetoderna i figur 3 stöder detta resultat och avslöjar att Pan RNA lokaliseras till specifika nukleära platser trots hämning av viral DNA-replikering och förändringen ses för tidigt ORF59-58 avskrift.
Figur 1: linjer spår av fluorescerande intensitet avslöja nyanser i fluorescens in situ hybridisering (fisk) av KSHV transkriptioner och immunofluorescens (om) av KSHV replikering fack. (a-B) Konfokala bilder av TREx RTA (tetracyklin inducerbara viral replikering och transkription aktivator protein) BCBL-1 celler12 som har inducerats i den lytiska fasen för 24 h med doxycyklin (Doxy). Skalstapeln indikerar 10 μm. (a) fluorescens in situ hybridisering (fisk) för viral rnas (grön) och immunofluorescensen (IF) för viral ENKELSTRÄNGAD DNA-bindande protein (ORF6/SSB) (röd), en komponent i KSHV replikations utrymmen, avslöjar att viral avskrifter lokalisera i cytoplasman, kärnan, och i nukleära Foci utanför ORF6/SSB berikade områden, även känd som replikering fack. Anti-SSB-antikroppen10 späddes till 1:200 i 0,4% BSA/1x PBS och upptäcktes med 1:500 anti-kanin Alexa fluor 594 sekundär antikropp i 0,4% BSA/1x PBS. Alla anti-Sense oligonukleotider som används i denna studie finns i tabell 1. Detektion av ORF59-58 mRNA omfattar både bicistronic och monocistronic utskrifter. Men i KSHV-infekterade JSC-1 celler, den monocistronic mRNA är minst 18-faldig mindre riklig än den bicistronic avskriften och sannolikt bidrar endast en mindre del av den totala fluorescerande signalen observerade13. Dessutom en av PAN RNA oligonukleotides (SB88) kan också upptäcka viral avskrift för K7. Signalen från en detektion av K7 kommer inte att vara lika betydande jämfört med signalen upptäcka KSHV PAN RNA, som är närvarande vid nästan 80% av alla polyadenylerade RNA i en lytisk KSHV-infekterade cell14. Dessutom en av de fyra anti-Sense oligonukleotides (tkv13) i upptäckten av K 8.1 mRNA kan binda till flera isoformer av K 8.1 och andra isoformer av närliggande öppna läsramar (ORF). FISKEN signalerar från endast oligonukleotide tkv13 är otillräckligt (data som inte visas). Den kombinerade hybridisering av de fyra oligonukleotides och bindningen av dem på samma avskrift sannolikt ger den observerade starka signalen. Vita linjer som kantas av celler i a) skildra linje banan för fluorescensintensitet för fisken och om signalerna, ritade i (C). (B) digitalt zoomade bilder av celler i (a) flankerade av vita linjer. För enkelhetens skull utelämnas den blå DAPI-kanalen. (C) tomterna visar de relativa fluorescerande intensiteterna för varje fläck längs samma linje: αSSB (röd), virala utskrifter (grön, avskrift anges på Plot), och DAPI (blå). Skuggade områden indikerar DAPI-reducerade regioner som motsvarar viral Replication fack eller SSB/ORF6-berikade områden. (D) förhållandet mellan kärnkraftsområdet och cell områdes förändringar, vilket innebär att fluorescensintensiteten som används genomgående normaliserades för området. Enukleära och cellulära områden mätta med Trex rta bcbl-1 celler med och utan att genomgå lytisk aktivering. Statistiskt signifikanta förändringar ses jämfört med icke-inducerad celler. Boxen och morrhår tomter representerar 10 och 90 percentiler. Figur omtryckt med smärre modifieringar från Vallery, Withers och kollegor15 under en Creative Commons Attribution License. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kontroll nukleära och cytoplasmiska fisk strategier validera beräkningsmetoden för nukleocytoplasmic ratio. (A) fisk för värden GAPDH mRNA (röd) och för viral polyadenylerade nukleära (Pan) lncRNA (grön) och DAPI nukleär färgning (blå) är positiva fisk kontroller för beräkningsmetoden bestämning av nukleocytoplasmatiska förhållandet. Host GAPDH mRNA är ett kanoniskt mål för KSHV: s värd avstängnings effekt och bryts ned vid lytisk induktion som visas här. Bfluorescensintensiteter längs en linje som indikeras med vita linjer som flår lytiska celler i a. DAPI (blått), PAN RNA (grön) och GAPDH mRNA (röd). Skuggade områden är enligt definitionen i figur 1. C) kvantifiering av fluorescensintensiteterna hos celler som representeras av (a) (n = 150 för varje GAPDH-prov, n = 75 för proverna ORF59-58 eller k 8.1) utfördes för tre biologiska replikat av celler som visas i figur 2 och figur 3. . P-värden: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) och < 0.0005 (* * *). (D) representativa norra blot av RNA från TREx RTA BCBL-1 celler 24 h efter Doxy. Boxen och morrhår tomter representerar 10 och 90 percentilen. Figur omtryckt med smärre modifieringar från Vallery, Withers och kollegor15 under en Creative Commons Attribution License. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: linje spår och beräkning av nukleocytoplasmatiska nyckeltal avslöjar en stark förskjutning till cytoplasman för den tidiga LYTISKA ORF59-58 transkription vid hämning av viral DNA-replikering. TREx RTA BCBL-1 celler behandlades för 24 h utan läkemedel (Unind), doxycyklin endast (Doxy), eller med doxycyklin och en hämmare av herpesviral DNA-replikation, fosfonoättiksyra (Doxy + PAA) eller cidofovir (Doxy + Cido). Paneler (A-C) visar data från prover som samlats in från tre biologiska replikat. (A) qPCR-värden för viral intracellulär DNA under hämning av viral DNA-replikation normaliserades till mängden promotor DNA i värd CELLS GAPDH-genen. (B) Northern blot (vänster) och kvantifiering (höger) visar totala RNA-nivåer under hämning av viral DNA-replikering. Icke-inducerad nivå av alla RNAs var omöjlig att upptäcka. (C) representativa fisk bilder för viral ORF59-58 transkriptioner (grön) och Pan RNA (röd) vid hämning av viral DNA-replikering. DAPI (blått) var den nukleära fläcken. (D) kvantifiering av fluorescensintensiteten hos celler som representeras av (C) (n = 75 vardera) utfördes på biologiska triplicates. (E) fluorescensintensitet längs linjer som ritas över celler som anges med vita linjer i (C) visas: DAPI (blå), Pan RNA (röd) och ORF59-58 mRNA (grön). P-värden: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) och < 0.0005 (* * *). Sekvenserna av alla oligonukleotider i denna studie finns i tabell 1. Boxen och morrhår tomter representerar 10 och 90 percentiler. Figur omtryckt från Vallery, Withers och kollegor15 under en Creative Commons Attribution License. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Norra oligos | |||||||
| Oligo No. | Gen | Sekvens | Position inom genen | Position med referensen NC 009333.1 genom (siffrorna reflekterar inte riktning eller sträng) | |||
| KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTTGAAATTGCTGG | 1284 till 1309 | 73936 till 73961 | |||
| JBW249 | KSHV SOX/ORF37 | TAACCTGACACCACCAAACACACGGTCCAC | 262 till 291 | 57633 till 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 till 967 (ORF59 ORF) | 95879 till 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 till 57 | 76029 till 76070 | |||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 till 687 | 29496 till 29519 | |||
| (Nacka) | Mer från Human RNase P | TGGGCGGAGGAGAGTAGTCTG | 319 till 339 | N/A | |||
| FISK sonder | |||||||
| Oligo No. | Gen | Sekvens | |||||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 till 687 | 29496 till 29519 | |||
| SB85 | KSHV PAN RNA | CGCTGCTTTCCTTTCACATT | 373 till 392 | 29205 till 29224 | |||
| SB88 | KSHV PAN RNA | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG | 1 till 22 | 28830 till 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 till 57 | 76029 till 76070 | |||
| tkv14 | KSHV K 8.1 | TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA | 377 till 414 | 76390 till 76427 | |||
| tkv15 | KSHV K 8.1 | GTAAGGTTACGCTTTATCCCTACACACCGACGGTTTACCC | 461 till 500 | 76474 till 76513 | |||
| tkv16 | KSHV K 8.1 | GGACAAGTCCCAGCAATAAACCCACAGCCCATAGTATG | 688 till 725 | 76701 till 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTTCATTGACCCTCCTGATT | 54 till 79 | 96767 till 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTTGCACTACTCCGGTT | 93 till 122 | 96724 till 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCCAGCGTCGAGTACATTCGCA | 300 till 329 | 96517 till 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 till 967 | 95879 till 95905 | |||
| tkv380 | KSHV ORF59-58 | AAAGAGTGTGAACGAGTACAGGGCCTT | 1289 till 1315 | 95531 till 95557 | |||
| tkv381 | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCTGACGCGCAGATCCATTCC | 1423 till 1450 | 95396 till 95423 | |||
| tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC | 1571 till 1602 | 95244 till 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | GGGTCGAGATTCAGCTAATTAGGCGAAAACTCCACAGG | 2136 till 2173 | 94673 till 94710 | |||
| Stellaris | GAPDH | Premade av Stellaris | N/A | N/A | |||
| qPCR-primers | |||||||
| tkv458 | GAPDH promotor | CTGCACCACCAACTGCTTAG | N/A | N/A | |||
| tkv459 | GAPDH promotor | GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT | N/A | N/A | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | Mer från GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT | N/A | 60075 till 60094 | |||
| tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | CCTGGGTCAAGCTGTTGTTT | N/A | 60218 till 60237 | |||
| RT-qPCR primers | |||||||
| TKV 455 | K8/K-bZIP framåt RT qPCR primer | Mer från CGAAAGCAAGGCAGATACG | 655 till 673 | 75603 till 75621 | |||
| TKV 456 | K8/K-bZIP omvänd RT qPCR primer för ospliced | GCCATTGTTCCCATTTGAGT | 755 till 774 | 75703 till 75722 | |||
| TKV 457 | K8/K-bZIP omvänd RT qPCR primer för skarvade | CATCAGCATGTCGCGAAG | 871 till 888 | 75819 till 75836 | |||
| JBW479 | Mänsklig RNase P framåt | AGCTTGGAACAGACTCACGG | 238 till 257 | N/A | |||
| JBW480 | Mänsklig RNase P omvänd | GCGGAGGAGAGTAGTCTGAA | 317 till 336 | N/A | |||
Tabell 1: alla oligonukleotider som används vid analyserna av denna publikation. Tabell 1 reproducerades med tillstånd från American Society for mikrobiologi under en Creative Commons Attribution License från Vallery et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs i denna rapport kan anpassas till olika celltyper och omfattar steg för dubbelrna-fisk och RNA-fisk med om man använder både monoklonala och polyklonala primära antikroppar. Även beredda diabilder typiskt avbildas med ett konfokala Mikroskop, kan avbildning utföras med en STED (stimulerad emission utarmning) Mikroskop efter modifieringar av ökad antikropp koncentration och ett annat monteringsmedium. För förbättrad analys av enskilda celler, kan prover som utarbetats med detta protokoll också sorteras, avbildas och analyseras av en cell sorterare eller flödescytometer med blygsamma förändringar, som visas av Borah och kollegor16. Detta protokoll kan dock inte antas för levande cell avbildning.
Kvantifieringsmetoderna detaljerade eliminera observation bias och tjänar till att validera en potentiell nukleocytoplasmic SKIFT. Den nukleocytoplasmic förhållandet pekar också när en biomolekyl justerar från att vara jämnt spridda att lokalisera i ett specifikt subcellulära fack. De resultat som presenteras här är semikvantitativa, medan protokollet beskriver sätt att stärka kvantifieringen. Styrkan i nukleocytoplasmic förhållandet och spårlinje (steg 4) beror på användningen av fluorescerande pärlor som intensitet kontroller (steg 3,13) och användning av tydliga subcellulära markörer, såsom en för nukleära Lamin A/C. Vid den här tiden finns det ingen tydlig gränsmarkering för KSHV viral Replication-fack. Oavsett, kan denna beräkning utvidgas till andra subcellulära fack med hjälp av lämpliga markörer.
Det stora hindret för protokollet som beskrivs i detta betänkande är utvecklingen av fisk strategier för specifika avskrifter (steg 1). Framgång förlitar sig på överflöd och bindande styrka av anti-Sense oligonukleotides. Specificitet till särskilda avskrifter görs ännu svårare genom förekomst av överlappande öppna läsramar (ORFs) i viral genom. Således har viral avskrifter ofta sekvens likhet17 med andra virala utskrifter från samma genomiska regionen, särskilt i händelse av herpesviruses. Ofta måste utvecklingen av en fisk strategi dra nytta av mer rikliga utskrifter. För att felsöka en brist på en fisk signal, bör användarna utföra FISH-protokollet med U2 snRNA fisk strategi för att bekräfta att tekniker i mänskliga celler och beredning av reagenser är tillräckliga. Likaså kan KSHV PAN RNA fisk strategi bekräfta lytisk aktivering i KSHV-infekterade celler. För att felsöka bindning av anti-Sense oligonukleotides, författarna rekommenderar att utveckla flera anti-Sense oligonukleotides. Om allt misslyckas finns det ett kommersiellt alternativ som framgår av användningen av GAPDH FISH Strategy i figur 2 och av Vallery, Withers och kollegor15.
Starkare algoritmer för att definiera cellulära och subcellulära gränser skulle ytterligare eliminera kvantifiering bias. Vissa analytiska bildbehandlings program kan ange gränser för cellen, kärnan och mer, men kräver slutgiltiga markörer. Ovanliga cellmorfologier som viral Replication fack är svåra för sådan programvara-en utmaning för framtida utveckling. Dessutom är de kvantifieringsmetoder som beskrivs här begränsade till en optisk del av en cell (2D bildanalys). Medan 3D bild förvärv är möjligt18, framtida utveckling av en kvantitativ 3D bildanalys kan ge ytterligare insikt i spatiotemporal reglering av viral replikering fack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski och Johanna B. Withers för rådgivning om dataanalys. Vi tackar också G. Hayward för anti-SSB antikroppen. Detta arbete stöddes av bidrag T32GM007223 och T32AI055403 från National Institutes of Health (to TKV) och NIH Grant (CA16038) (till JAS). JAS är utredare av Howard Hughes Medical Institute. Figurerna 1-3 och tabell 1 reproducerades med tillstånd från American Society for mikrobiologi under en Creative Commons Attribution License från följande publikation: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposis sarkom-Associated Herpesvirus mRNA ackumulering i nukleära Foci påverkas av viral DNA-replikering och viral Noncoding Polyadenylerade nukleära RNA. Journal of Virology. 92 (13), Doi: 10.1128/JVi. 00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A.
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
