Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

El diagnóstico de la rabia utilizando metodologías moleculares fue aceptado por la OIE en 2018¹, reconociendo las ventajas de estas técnicas en la confirmación de casos de rabia, particularmente en situaciones en las que las muestras son subóptimas, o para el diagnóstico ante mortem, ya que no hay ningún requisito para virus vivos o muestras frescas. Los ensayos de PCR para lissavirus requieren una transcripción inversa (RT) antes de que la PCR pueda comenzar ya que el genoma es ARN. Los ensayos RT-PCR que detectan la región proximal de 3' del genoma se consideran los más sensibles, ya que los gradientes de transcripción se producen durante la replicación del lissavirus. Los ensayos RT-PCR de uso común se pueden dividir ampliamente en dos categorías, punto final (o basado en gel) y en tiempo real. Ambos enfoques son sensibles y específicos; sin embargo, el ensayo en tiempo real tiene algunos beneficios adicionales, como obtener resultados en "tiempo real" y realizarse en un sistema de tubos completamente cerrado, reduciendo así el potencial de contaminación del operador. Existen dos enfoques principales para detectar amplicons específicos del lissavirus obtenidos mediante ensayos en tiempo real. La primera utiliza sondas de hidrólisis (como sondas TaqMan) que contienen un fluoróforo y un quencher. Cuando la sonda se une a la región objetivo durante la amplificación, la actividad de exonucleasa de la polimerasa da lugar a la disociación del fluoróforo y el quencher, lo que permite medir la fluorescencia resultante. El segundo utiliza un tinte intercalante de ADN (fluorocromo como SYBR Green) que se une al ADN de doble cadena durante la amplificación. Los fluorocromos enlazados emiten fluorescencia que se detecta en cada ciclo, permitiendo la detección y cuantificación en tiempo real del producto. Debido a la naturaleza no específica de la unión a cualquier dsDNA, se lleva a cabo un análisis de la curva de disociación para confirmar la especificidad de la reacción. Los RT-PCR en tiempo real son rápidos debido a los pequeños tamaños de amplificación, típicamente menos de 200 bp de longitud; sin embargo, identificar regiones adecuadas para diseñar imprimaciones y sondas en regiones conservadas, puede resultar difícil, por lo que eliminar el requisito de una sonda es una ventaja distinta.

Se han diseñado varios RT-PCR en tiempo real para detectar específicamente cepas o linajes individuales de RABV² y también para detectar lissavirus en todo el género^{3,4,5,6, 7,8,9}. Todos los ensayos tendrán un límite de detección dependiendo de la conservación de las secuencias de imprimación (y si es necesario, la sonda) están en todo el género. De hecho, las cepas de virus emergentes o novedosas pueden hacer que los ensayos altamente específicos basados en sondas sean ineficaces. La elección de la detección en tiempo real (teñido frente a sonda) dependerá de la aplicación prevista. Para un laboratorio que lleva a cabo la vigilancia del material cerebral de origen local y espera un alto número de muestras negativas, el uso del tinte intercalante más barato es una opción sensata. El enfoque SYBR Green también sería óptimo al llevar a cabo la vigilancia de escaneo en la que la presencia de lissavirus novedosos o divergentes permanecería sin ser detectada por ensayos basados en sondas más restringidas.

Todos los miembros del género Lyssavirus causan la rabia de la enfermedad, que es mortal una vez que aparecen los síntomas. La gran mayoría de los casos de rabia humana y animal se deben al virus de la rabia (RABV), cuyo reservorio dominante es el perro doméstico^10. Los murciélagos son importantes reservorios de host para los lissavirus y todas las especies de lissavirus, excepto dos caracterizadas, se han identificado directamente en murciélagos —Ikoma lyssavirus (IKOV) y el virus Mokola (MOKV)— y de estos dos, se ha especulado que IKOV tiene un reservorio ^{de murciélagos 11}. Además de las 16 especies reconocidas de lissavirus¹², hay dos lissavirus que se han descrito recientemente: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)¹³ y Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)¹⁴. Los lissavirus se pueden dividir genéticamente en tres filogrupos, con la mayoría de los lissavirus, incluyendo RABV, pertenecientes al filogrupo I. Sin embargo, los lissavirus más divergentes pertenecen al filogrupo III y es poco probable que sean detectados por RT-PCR diseñados para apuntar a las secuencias de virus RABV o filogrupo I.

El ensayo descrito aquí utiliza el par de imprimación en tiempo real JW12-N165, descrito por primera vez en 2005³. Los imprimadores fueron diseñados para ser pan-lyssavirus aunque la aplicación original era como un ensayo TaqMan con sondas para diferenciar especies de lissavirus. La confirmación posterior de que el par de imprimación era pan-lyssavirus en especificidad se logró utilizando un ensayo en tiempo real SYBR de 2 pasos sobre todas las especies de lissavirus disponibles, incluyendo WCBV¹⁵. El par de imprimación se describe aquí en un ensayo en tiempo real RT-PCR de un solo paso que utiliza un fluorocromo intercalante, validado utilizando representantes de las 16 especies reconocidas de lissavirus. Este ensayo en tiempo real de un solo paso es un ensayo rápido, sensible y específico del lissavirus y demuestra que la robustez del primer conjunto para identificar incluso especies de lissavirus altamente divergentes.

Muestras de material de diagnóstico recibidas en APHA después de una infección natural, u obtenidas inoculando ratones utilizando protocolos evaluados por el comité de ética y estadística de APHA bajo las regulaciones del Home Office del Reino Unido bajo licencia 70/7394.

1. Cuantificación del ARN mediante un espectrofotómetro de microvolúmenes

1. Asegúrese de que los ajustes del espectrofotómetro estén ajustados a ARN.
2. Utilice 1-2 l de agua de grado molecular para inicializar la máquina y establecer una línea de base.
3. Utilice 1-2 l de cada muestra de ARN de prueba para evaluar la cantidad de ARN.
4. Guarde las lecturas y el documento.
5. Ajuste el ARN a 1 g/L, si es necesario.
   NOTA: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento. Si se obtiene ARN utilizando una columna, o método basado en perlas, el ARN suele ser inferior a 1 g/L. En esta situación utilice el ARN limpio.

2. Preparación de la serie de dilución de ARN para determinar la sensibilidad del punto final

1. Haga una dilución serial de 10 veces del ARN.
   1. Etiquetar tubos con la serie de dilución (por ejemplo, 10^-1, 10^-2, etc.) y los detalles del ARN.
   2. Añadir 45 l de agua de grado molecular a cada tubo.
   3. Añadir 5 l de ARN (previamente diluido a 1 g/L) y mezclar bien.
   4. Deseche la punta de la pipeta en el desinfectante adecuado y reemplácelo con una punta nueva.
   5. Tomar 5 l de la 10^-1 y añadir a 10^-2 tubo y mezclar bien.
   6. Repita 2.1.3-2.1.5 con las diluciones restantes.
      NOTA: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento.

3. Preparación de reacciones RT-PCR en tiempo real

1. Usando una hoja de cálculo, planifique el diseño de la placa de acuerdo con el número de muestras de prueba y muestras de control, tanto para el lissavirus como para los ensayos de actina.
   NOTA: Si se van a probar 4 muestras por duplicado con un control positivo y negativo, esto equivale a 10 reacciones para ambos ensayos.
2. En una "sala limpia" o área separada de la plantilla de ARN, limpie las superficies con un desinfectante adecuado antes de usar o prepare una estación de trabajo PCR (si lo utiliza). Para preparar la estación de trabajo, limpie la superficie del gabinete con un desinfecto adecuado y coloque los elementos necesarios en la estación de trabajo y cierre las puertas. Encienda la luz UV durante 10 minutos
3. Retire los regentes y las imprimaciones del congelador y el deshielo (reactivos enumerados en la Tabla 1 y los imprimadores de la Tabla2).
   NOTA: La mezcla enzimática se almacena en glicerol por lo que no requiere descongelación y debe mantenerse en hielo (o en un bloque fresco) en todo momento. Todos los demás reactivos se pueden descongelar a temperatura ambiente.
4. Una vez descongelado, mezcle los reactivos y la centrífuga brevemente para recoger líquido.
   NOTA: No vórtice la mezcla enzimática, sólo centrifugar brevemente.
5. Preparar mezclas maestras separadas para el lissavirus y la actina. Para cada reacción, añadir 7,55 ml de agua de grado molecular, 10 l de 2 x mezcla de reacción verde SYBR universal, 0,6 l de imprimación directa, 0,6 l de imprimación inversa, 0,25 l de mezcla enzimática iTaq RT.
   1. Utilice una hoja de cálculo para calcular los volúmenes correctos para evitar errores en el cálculo manual. Asegúrese de que se haya preparado suficiente mezcla maestra para compensar el error de pipeteo. Por lo tanto, si se requieren 10 reacciones (ver NOTA en 3.1), prepare 12 reacciones
   2. Preparar la mezcla maestra en hielo (o en un bloque fresco) y permanecer en hielo hasta que se coloque en la máquina en tiempo real.
6. Mezcle las mezclas maestras preparadas, centrifugar brevemente y dispensar 19 ol en los pozos relevantes de tubos de tiras o una placa de 96 pocillos compatible con la máquina en tiempo real en uso.
   NOTA: Minimizar la producción de burbujas en los pozos mientras se pipetea.
7. En una habitación separada, o en un armario UV preparado como se describe en 3.2, agregue cuidadosamente 1 l del ARN previamente ajustado a 1 g/l (ver paso 1.5) debajo de la superficie del pozo maestro-mezcla apropiado y mezcle suavemente. Deseche la punta de la pipeta en el desinfectante directamente después de su uso (bajo la superficie).
   1. Agregue los controles después de las muestras de prueba, con el control positivo añadido siguiente y el control sin plantilla (NTC – agua de grado molecular) añadido en último lugar. La cantidad de ARN utilizada puede ser alterada dependiendo del tipo de muestra, y la extracción de ARN utilizada. La cantidad utilizada debe validarse para garantizar que la reacción esté optimizada.
8. Sellar la placa con tapas de tiras o sellador teniendo cuidado de asegurar que todas las tapas estén firmemente cerradas y etiquetadas lo suficiente como para orientar las muestras. Etiquete el borde de los tubos de placa/tira.
9. Gire las muestras usando una centrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior de los pozos.
10. Transfiera la placa a la máquina PCR en tiempo real, abra la puerta y colóquela en el soporte asegurando la ubicación/orientación correcta de las muestras de acuerdo con el diseño de la placa.
    NOTA: Si se utilizan tiras de tubo, asegúrese de que el soporte esté en su lugar.
11. Abra el programa de máquina PCR en tiempo real y elija la opción para el experimento en tiempo real SYBR con la curva de disociación. Programe la máquina PCR en tiempo real utilizando las condiciones de ciclo térmico especificadas en la Tabla3, incluidos los puntos de recopilación de datos.
12. Seleccione SYBR como el colorante fluorescente y seleccione unknown como el tipo de muestra e inserte un nombre en el cuadro de nombre de muestra correcto.
    NOTA: Diferenciar entre las réplicas y también entre los pozos de lissavirus y de la actina.
13. Elija una ubicación de archivo para guardar los datos experimentales, asegúrese de que la lámpara se apagará al final de la ejecución y, a continuación, inicie la ejecución.
    NOTA: Como el primer paso es una etapa RT, no se recopilan datos durante este tiempo, por lo tanto, si la lámpara requiere un período de calentamiento, esto puede ocurrir durante la etapa RT. La máquina y el software en tiempo real mostrarán las curvas de amplificación en tiempo real, mientras que la curva de fusión se generará al final del ciclo.

4. Análisis de datos

1. Una vez completada la ejecución, realice el análisis de datos de la siguiente manera.
   1. En primer lugar, analice los resultados de la gráfica de amplificación de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Las muestras positivas muestran rampas exponenciales, generalmente seguidas de meseta y un valor C t. Las muestras negativas muestran gráficas de amplificación planas sin valores C_t (Figura1A). El valor C_t es calculado automáticamente por el software, aunque esto debe ser comprobado y alterado manualmente si es necesario.
   2. En segundo lugar, analice los resultados de la curva de disociación de las muestras de prueba junto con las muestras de control. Una muestra positiva tendrá una temperatura de fusión (T_m) 77 – 80 oC, y se solapará con la Figura de control positivo 1B).
   3. Obtenga el resultado de diagnóstico general asegurándose de que los controles son válidos. Utilice la Tabla 4 para interpretar los resultados en relación con el control interno de la acción. Si las muestras de control positivas son negativas y/o las muestras negativas son positivas, la ejecución debe no tenerse en cuenta.
   4. Registre los valores C_t y T_m obtenidos para el ARN de control en una "tarjeta de control" para permitir el análisis de tendencias y ayudar a identificar derivas en la sensibilidad del ensayo.

Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, la sensibilidad del pan-lyssavirus RT-PCR se demostró en una serie de dilución del virus estándar de control (CVS) (Figura 1) y una serie de otros lissavirus (Figura 2YFigura 3). El tinte SYBR Green I se utilizó como un RT-PCR universal de un solo paso, donde la síntesis de ADNc y la amplificación de PCR se llevan a cabo en un solo tubo. A medida que se produce la amplificación del objetivo específico, se une más tinte, lo que resulta en un aumento en tiempo real de los niveles de fluorescencia. Todos los ensayos de intercalación de tintes en tiempo real deben interpretarse en dos fases: amplificación y disociación. La fase de amplificación es idéntica a cualquier amplificación en tiempo real (Figura 1A). Hay una "fase temprana" lineal durante los primeros ciclos en la que la amplificación del ADN no se puede calcular debido a una señal insuficiente en relación con el fondo. La longitud de esto está directamente relacionada con la cantidad de destino en la muestra. Posteriormente, hay una fase exponencial donde se detecta y registra la duplicación de moléculas de ADN. Por último, se alcanza la fase de meseta (aparte de las muestras altamente diluidas que pueden no llegar a esta fase antes del final del programa). En esta fase, la intensidad de la fluorescencia se agota, debido al agotamiento de los reactivos. Las gráficas de amplificación observadas mediante una dilución serial de CVS de 10 veces, conforme a las gráficas previstas (Figura 1AC) donde el ensayo de lissavirus demostró una mayor sensibilidad que el ensayo de la acción. La curva de disociación se calculó después de la amplificación, donde el ADN se disociaba en ssDNA por un aumento incremental de la temperatura y la fluorescencia monitoreada en función de la temperatura (Figura 1B, D-F). La temperatura umbral a la que el amplicon específico se disocia en ssDNA, causó una liberación de fluorescencia, que se midió por el software termociclador (TM). Esta fase de disociación proporcionó datos sobre el tamaño del amplificador, lo que permitió al usuario interpretar el resultado en comparación con un control positivo, lo que dio lugar a una probabilidad insignificante de resultados falsos positivos. La TMCVS mediante el ensayo pan-lysavirus (Figura 1B) y el ensayo de actina (Figura 1D) son distintos, y ayudaron al usuario a confirmar el análisis de ensayo correcto señalando laMobtenido (Figura 1E). Además, la CTy TMse evaluaron los valores entre las corridas y los operadores y se demostró que eran reproducibles (Tabla 5). El umbral utilizado para calcular la CTvalor fue calculado automáticamente por el software y dependiendo de muchos factores, incluyendo la mezcla de reacción o instrumento utilizado. Durante los 12 carreras independientes la media CTfue de 20,66 (SD 0,63) para el ensayo de lissavirus y 27,5 (SD 1.13) para el ensayo de la ley. Por el contrario, la variación observada en la TMvalores fue notablemente más bajo, debido a la falta de influencias externas en esta medición. Por ejemplo, la media TMpara el ensayo de CVS lyssavirus fue de 78,92 (SD 0,16) (Tabla 5), en comparación con la media de todos los lissavirus 78,81 oC (SD 0,531) (Tabla 6YFigura 1F). Esta falta de variación en la TMa través de la Lyssavirusel género es ventajoso ya que el mismo ARN de control se puede utilizar independientemente del lissavirus en la muestra, por diferenciación entre las especies de lissavirus que utilizan la TMno es posible, sobre todo porque diferentes sublinajes RABV abarcaron la gama de TMvalores observados (Tabla 6). Las gráficas de amplificación no específicas rara vez se observan con este ensayo; sin embargo, se requieren parámetros específicos para definir un resultado positivo frente a un resultado negativo no específico. El SD observado en todos los lissavirus (0.531) se aplicó a la más baja (77.34 - LBVa) y más alta (79.67 - IKOV) observada TMvalores para establecer un rango de 76,8 oC a 80,2 oC para bandas específicas positivas. Por lo tanto, TMvalores fuera de este rango se consideraron inespecíficos y, por lo tanto, un resultado negativo. Ocasionalmente se observan varios picos para una muestra. Si el pico dominante está en la T correctaM(para cada réplica) la muestra se considera positiva. La razón más común por la que se observa un pico no específico es debido a los imprimadores, el ensayo se ha optimizado para minimizar los dimers de imprimación. Los atenuadores de imprimación suelen dar lugar a un amplificador más pequeño que el de la secuencia de destino, por lo tanto, tendría una TMmás bajo que el producto específico.

Una dilución serial de 10 veces de tres ARN de muestra cerebral positiva de lissavirus extraídos con TRIzol, se ejecutaron en paralelo y se trazaron (Figura2). El límite de detección de los tres lissavirus varió, pero ninguno superó Ct 36. Los valores del coeficiente R2 para los virus trazados en la Figura 2 oscilaron entre 0,9637 y 0,996. Para todos los virus analizados (Tabla6) el rango no superó esto, además, 7 de los 29 lyssavirus teníaR2 >0.99 (datos no mostrados). Teniendo en cuenta que la preparación de la serie de dilución procede de extracciones totales de ARN, la linealidad observada proporciona evidencia de que el ensayo es robusto. Finalmente, la detección de todas las especies de lissavirus (particularmente los más diversos virus del filogrupo III) se investigó utilizando un panel de ARN que abarca los tres filogrupos del género Lyssavirus. El ARN extraído de ratones originales, o infectados experimentalmente, material cerebral, se utilizó utilizando los protocolos descritos anteriormente. Los resultados confirman que las imprimaciones amplifican todas las especies de lissavirus, incluidos los lisavirus fecundistas III IKOV, WBCV y LLEBV (Tabla6 y Figura3). Se examinó un panel diverso de rabdovirus no-lyssavirus, originalmente recogidos y analizados antígenos16,y más recientemente genéticamente17 y se detectó una reactividad no cruzada, lo que indica que los cebón son específicos para miembros del género Lyssavirus solamente (datos no mostrados). El ensayo pan-lyssavirus en tiempo real se ha incluido en los sistemas de competencia interlaboratorio EURL (EU Reference Laboratory) desde 2013, lo que demuestra una concordancia del 100% con otros ensayos moleculares como el ensayo taqMan del pan-lysavirus y el ensayo RT-PCR convencional además del FAT (Prueba de AnticuerpoS Fluorescentes).

Figura 1: dilución serial de 10 veces del ARN de control positivo CVS, que se ejecuta en el ensayo pan-lyssavirus RT-PCR, se visualiza como la gráfica de amplificación (A) y la curva de disociación (B), y se ejecuta en el ensayo RT-PCR de acción y se visualiza como la gráfica de amplificación (C) y se ejecuta en el ensayo RT-PCR de acción curva de disociación (D). NTC: sin control de plantilla. Comparación del ARN de control CVS que se ejecuta tanto en el ensayo pan-lyssavirus RT-PCR (azul) como en el ensayo de la acción RT-PCR (rojo) que demuestra la diferencia en las curvas de disociación (E) — véase el Cuadro 5 para los valores medios; y finalmente curvas de disociación para LBVa (azul) e IKOV (rojo) que demuestran el rango de valores Tm observados en todo el género Lyssavirus (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: 10 diluciones seriales para tres especies de lyssavirus: RABV (RV108), DUVV (RV131) y ARAV (RV3379). R2 a 0,996, 0,9962 y 0,9637 respectivamente. Los puntos de datos a 10-7 (0.0001 ng/L) alcanzaron el límite de detección (donde se obtuvo un valor). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Datos representativos de dilución en serie multiplicados por 10 de todo el género Lyssavirus (ver leyendas individuales para la identidad del lissavirus y tabla 6 para los resultados tabulados en comparación con otros lyssavirus). Paneles A, C, E, G gráfican gráficas de amplificación y curvas de disociación B, D, F, H para A, C, E y G respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Reactivos de mezcla maestra RT-PCR en tiempo real en tiempo real.

Tabla 2: Detalles de la imprimación RT-PCR en tiempo real en tiempo real.

Tabla 3: Condiciones de ciclismo RT-PCR en tiempo real en tiempo real.

Tabla 4: Resumen de los resultados y resultados generales de la RT-PCR en tiempo real de pan-lyssavirus. Negativo se designa a una muestra sin valor Ct (amplificación) y sin temperatura de fusión (disociación), o una temperatura de fusión que está fuera del rango Tm para lissavirus positivos (76,8 oC - 80,2 oC). Positivo se designa a una muestra con un valor Ct (amplificación) y una temperatura de fusión (disociación) que está dentro del rango Tm para lissavirus positivos.

Tabla 5: Análisis entre corridas del control positivo CVS en 12 corridas independientes, incluidos varios operadores.

Tabla 6: Resumen de la especificidad, sensibilidad y Tm en tiempo real de pan-lyssavirus en los tres filogrupos. La media de Tm a través de los lyssavirus fue de 78,81 (SD 0,531).

Los autores no tienen nada que revelar.