Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

Resumen

Aquí se describe un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro.

Resumen

Los microorganismos intestinales humanos se han convertido recientemente en un objetivo importante de la investigación en la promoción de la salud humana y la prevención de enfermedades. En consecuencia, las investigaciones de interacciones entre endobióticos (por ejemplo, fármacos y prebióticos) y la microbiota intestinal se han convertido en un importante tema de investigación. Sin embargo, los experimentos in vivo con voluntarios humanos no son ideales para tales estudios debido a la bioética y las limitaciones económicas. Como resultado, se han utilizado modelos animales para evaluar estas interacciones in vivo. Sin embargo, los estudios de modelos animales siguen estando limitados por consideraciones de bioética, además de diferentes composiciones y diversidades de la microbiota en animales frente a humanos. Una estrategia de investigación alternativa es el uso de experimentos de fermentación por lotes que permiten evaluar las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal in vitro. Para evaluar esta estrategia, se utilizaron exopolisacáridos bifidobacterianos (Bif) como xenobiótico representativo. Luego, las interacciones entre Bif EPS y la microbiota intestinal humana se investigaron utilizando varios métodos como la cromatografía de capa delgada (TLC), el análisis de composición de la comunidad bacteriana con secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). Aquí se presenta un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro. Es importante destacar que este protocolo también se puede modificar para investigar las interacciones generales entre otros endobióticos y la microbiota intestinal.

Introducción

La microbiota intestinal desempeña un papel importante en el funcionamiento de los intestinos humanos y en la salud del huésped. En consecuencia, la microbiota intestinal se ha convertido recientemente en un objetivo importante para la prevención y la terapia de enfermedades¹. Además, las bacterias intestinales interactúan con las células intestinales anfitrionas y regulan los procesos fundamentales del huésped, incluidas las actividades metabólicas, la disponibilidad de nutrientes, la modulación del sistema inmunitario e incluso la función cerebral y la toma de decisiones^2,3 . Los endo....

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices del comité de ética de la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan (Hunan, China) y la Universidad Zhejiang Gongshang (Zhejiang, China).

1. Preparación de bacterias

1. Preparación de caldo medio bifidobacterium
   1. Combinar los siguientes componentes en 950 ml de agua destilada: extracto de carne, 5 g/L; Extracto de levadura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; tono de soja, 5 g/L; glucosa, 10 g/L; K₂HPO₄, 2.04 g/L; MgSO₄x 7H₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solución salina, 40 mL (CaCl₂

Resultados

La producción de EPS mucoide se pudo observar en cultivos B. longum en placas PYG después de la incubación anaeróbica durante 72 h (Figura1A). La centrifugación de los raspaduras de cultivo, seguida de la precipitación de etanol y el secado, dio lugar a la recolección de EPS similares a la celulosa (Figura1B). Las EPS secas y el almidón soluble se utilizaron entonces como fuentes de carbono para cultivos de fermentación. TLC se utilizó para la separació.......

Discusión

Se han realizado progresos significativos hacia la comprensión de la composición y las actividades de la microbiota intestinal humana en la última década. Como consecuencia de estos estudios, ha surgido el concepto holobionte, que representa las interacciones entre los huéspedes y las comunidades microbianas asociadas, como entre los seres humanos y su microbiota intestinal^19,20. Además, los seres humanos son incluso ahora considerados como superorganismos

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m filtros de membrana	Millipore	SLGP033RB	Uso para filtrar muestras
Tamiz de 0,4 mm	Thermo Fischer	308080-99-1	Uso para preparar muestras fecales humanas
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-Gal)	Solarbio	X1010	Uso para preparar placa de color
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Muestra estándar para agar SCFA
	Solarbio	YZ-1012214	El componente de
la cámara anaeróbica	Electrotek	AW 400SG	Cultivo y fermentación de bacterias
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Úselo para autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	El componente del horno de
horneado	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Úselo para calentar y hornear
Extracto de carne de res	Solarbio	G8270	El componente del medio
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870&comercio;	gérmenes
Sales biliares	Solarbio	YZ-1071304	El componente del medio
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Muestra estándar para SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Solución salina del medio
Columna capilar	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm &veces; 30 m &veces; 0,25 μ m)	Utilizado para la detección de SCFA
Peptona de caseína	Sigma-Aldrich	39396	El componente de la
centrífuga	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Uso para la centrifugación
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	El componente del medio
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	El componente del medio
Cisteína-HCl	Solarbio	L1550	El componente del medio
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023	Úselo para preparar vitamina K1
FeSO4.7H2	O Solarbio	YZ-111614	El componente del medio
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	399388	Utilizado para TLC
Cromatografía de gases	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Se utiliza para la detección de SCFA
Vaso de precipitados de vidrio	Fisher Scientific	FB10050	Se utiliza para la preparación de lodos
Glucosa	Solarbio	G8760	El componente del medio
Haemin	Solarbio	H8130	El componente del medio
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Solución básica utilizada para ajustar el pH de los tampones
Isobutírico	Sigma-Aldrich	46935-U	Muestra estándar para
ácidos isovaléricos	Sigma-Aldrich	129542	Muestra estándar para AGCC
K2HPO4	Solarbio	D9880	Solución salina de
KCl	Solarbio	P9921	El componente del medio
KH2PO4	Solarbio	P7392	Solución salina del medio
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Úselo para preparar placas de color
Extracto de carne	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	El componente del medio
Ácido metafosfórico	Sigma-Aldrich	B7350	Muestra estándar para SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	El componente del medio
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Solución salina del
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE	Secuenciación de ADN
MnSO4. H20	Sigma-Aldrich	M8179	Solución salina de medio
Mupirocina	Solarbio	YZ-1448901	Antibiótico
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Solución salina de medio
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	solución salina de medio
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determinar las concentraciones de ADN
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Solución básica utilizada para ajustar el pH de los tampones
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Se utiliza para TLC
NiCl2	Solarbio	746460	El componente del medio
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Se utiliza para preparar reactivos
de orcinolPropionic	Sigma-Aldrich	94425	Muestra estándar para SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extracto de ADN genómico bacteriano
Polvo de PBS listo para usar	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Se utiliza para preparar la suspensión lipídica
Resazurin	Solarbio	R8150	Equipo anaeróbico
Concentrador de vacío	de velocidad LABCONCO	CentriVap	Uso para preparar EPSs
Almidón	Solarbio	YZ-140602	Uso para la fuente de carbono
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	150692	Se utiliza para preparar reactivos
T100 PCR	BIO-RAD		amplificación de PCR
Láminas de aluminio TLC	MerckMillipore	116835	utilizado para TLC
tripticasa Peptona	Sigma-Aldrich	Z699209	El componente del medio
Triptona	Sigma-Aldrich	T7293	El componente del medio
Tween 80	Solarbio	T8360	Solución salina del medio
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Muestra estándar para SCFA
Vitamina K1	Sigma-Aldrich	V3501	El componente del
medio Oscilador de vórtice	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Uso para el vorticing
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	Y1625	El componente del medio
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	El componente del medio

media medio media SCFA medio sistemade orcinol 1861096