Method Article

Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se describe un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los microorganismos intestinales humanos se han convertido recientemente en un objetivo importante de la investigación en la promoción de la salud humana y la prevención de enfermedades. En consecuencia, las investigaciones de interacciones entre endobióticos (por ejemplo, fármacos y prebióticos) y la microbiota intestinal se han convertido en un importante tema de investigación. Sin embargo, los experimentos in vivo con voluntarios humanos no son ideales para tales estudios debido a la bioética y las limitaciones económicas. Como resultado, se han utilizado modelos animales para evaluar estas interacciones in vivo. Sin embargo, los estudios de modelos animales siguen estando limitados por consideraciones de bioética, además de diferentes composiciones y diversidades de la microbiota en animales frente a humanos. Una estrategia de investigación alternativa es el uso de experimentos de fermentación por lotes que permiten evaluar las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal in vitro. Para evaluar esta estrategia, se utilizaron exopolisacáridos bifidobacterianos (Bif) como xenobiótico representativo. Luego, las interacciones entre Bif EPS y la microbiota intestinal humana se investigaron utilizando varios métodos como la cromatografía de capa delgada (TLC), el análisis de composición de la comunidad bacteriana con secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). Aquí se presenta un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro. Es importante destacar que este protocolo también se puede modificar para investigar las interacciones generales entre otros endobióticos y la microbiota intestinal.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microbiota intestinal desempeña un papel importante en el funcionamiento de los intestinos humanos y en la salud del huésped. En consecuencia, la microbiota intestinal se ha convertido recientemente en un objetivo importante para la prevención y la terapia de enfermedades1. Además, las bacterias intestinales interactúan con las células intestinales anfitrionas y regulan los procesos fundamentales del huésped, incluidas las actividades metabólicas, la disponibilidad de nutrientes, la modulación del sistema inmunitario e incluso la función cerebral y la toma de decisiones2,3 . Los endobióticos tienen un potencial considerable para influir en la composición bacteriana y la diversidad de la microbiota intestinal. Así, las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana han atraído una creciente atención de la investigación4,5,6,7,8,9.

Es difícil evaluar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana in vivo debido a la bioética y las limitaciones económicas. Por ejemplo, los experimentos que investigan las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana no se pueden realizar sin el permiso de la Administración de Alimentos y Medicamentos, y el reclutamiento de voluntarios es costoso. En consecuencia, los modelos animales se utilizan a menudo para tales investigaciones. Sin embargo, el uso de modelos animales es limitado debido a las diferentes composiciones de microbiota y diversidad en las comunidades asociadas a los animales frente al ser humano. Un método in vitro alternativo para explorar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana es a través del uso de experimentos de cultivo por lotes.

Los exopolisacáridos (SEP) son prebióticos que contribuyen significativamente al mantenimiento de la salud humana10. Los SAE distintos que consisten en diferentes composiciones y estructuras monosacáridos pueden exhibir funciones distintas. Los análisis anteriores han determinado la composición de los SAE Bif, que son el xenobiótico representativo al que se dirige en el actual estudio11. Sin embargo, efectos metabólicos asociados al huésped no se han considerado con respecto a la composición y diversidad EPS.

El protocolo descrito aquí utiliza la microbiota fecal de 12 voluntarios para fermentar Bif EPS. La cromatografía de capa delgada (TLC), la secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases (GC) se utilizan en combinación para investigar las interacciones entre los SSA y la microbiota intestinal humana. Las ventajas distintivas de este protocolo en comparación con los experimentos in vivo son su bajo costo y evitar los efectos de interferencia del metabolismo del huésped. Además, el protocolo descrito se puede utilizar en otros estudios que investigan interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo sigue las directrices del comité de ética de la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan (Hunan, China) y la Universidad Zhejiang Gongshang (Zhejiang, China).

1. Preparación de bacterias

  1. Preparación de caldo medio bifidobacterium
    1. Combinar los siguientes componentes en 950 ml de agua destilada: extracto de carne, 5 g/L; Extracto de levadura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; tono de soja, 5 g/L; glucosa, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solución salina, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); y resazurina, 0,4 ml (2,5 mg/L). Ajuste el pH a 6,8 con 2 M NaOH.
    2. Autoclave a 121 oC durante 15 min y dejar que el caldo se enfríe a temperatura ambiente (RT) en condiciones anaeróbicas (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Añadir cisteína-HCl esterilizada por filtro (0,5 g/L) y mupirocina (5 mg/L) al medio.
  2. Añadir una alícuota (50 l) de Bifidobacterium longum congelado a un tubo de cultivo con 5 ml de caldo medio de bifidobacterium en condiciones anaeróbicas, luego cultivar en una incubadora anaeróbica durante 24 h a 37 oC.

2. Preparación de SEP bifidobacterianos

  1. Preparación del medio de agar PYG
    1. Combine lo siguiente: peptona, 20 g/L; Extracto de levadura, 10 g/L; glucosa, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4x 7H2O, 0,08 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Ajuste el pH a 7.2 utilizando 10 M NaOH.
    2. Autoclave el soporte a 121 oC durante 15 min y enfríe a 50 oC. A continuación, por 1 L de medio, añadir 0,5 ml de solución de vitamina K1 esterilizada por filtro (1 g de vitamina K1 disuelta en 99 ml de etanol al 99%), 5 ml de solución de hemino (0,5 g de hemino disuelto en 1 ml de 1 mol/L NaOH , entonces llevado hasta 100 mL con agua destilada), y 0,5 g de cisteína-HCl.
    3. Antes de verter las placas PYG, añadir filtro-esterilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolyl -D-galactopiranoside (X-Gal, 0.06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) y mupirocina (5 mg/L) al medio.
      NOTA: X-Gal y LiCl.3H2O permiten la identificación de colonias B. longum en placas a través de cambios de coloración.
  2. Inocular 20 oC de cepas de B. longum (paso 1.2) a placas PYG y colocar en una incubadora anaeróbica a 37 oC durante 72 h.
  3. Recoger colonias bacterianas mucoide de las placas PYG usando una cuchara de pesaje, luego resuspender completamente en 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) utilizando un oscilador de vórtice.
    NOTA: Las mezclas bacterianas y EPS deben ser resuspendidas completamente por vórtice o pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente hasta que las fibras se disuelvan completamente en PBS.
  4. Centrifugar la suspensión a 6.000 x g durante 5 min.
  5. Transfiera cuidadosamente los sobrenadores a un nuevo tubo centrífugo y mezcle completamente con tres volúmenes de etanol frío 99% por inversión y mezcla repetidas.
  6. Centrifugar la mezcla a 6.000 x g durante 5 min y eliminar completamente los sobrenadores.
  7. Retire los precipitados de los tubos centrífugos raspando y secando los extractos de EPS durante la noche utilizando un vacío de velocidad.

3. Preparación del medio de fermentación

  1. Preparación de la cultura básica media VI
    1. Combine lo siguiente: peptona, 3 g/L; triptona, 3 g/L; Extracto de levadura, 4,5 g/L; mucina, 0,5 g/L; sales biliares No. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2x 6H2O, 4,5 g/l; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4x 7H2O, 3,0 g/L; MnCl2x 4H2O, 0,32 g/L; FeSO4x 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4x 7H2O, 0,18 g/L; CaCl2x 2H2O, 0,1 g/l; ZnSO4x 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4x 5H2O, 0,01 g/L; y NiCl2s6H2O, 0,092 g/L. Ajuste el pH a 6,5 con 1 M HCl.
    2. Preparar la hemicina y la cisteína como se hace en la sección 2.1 y añadir después de autoclave y enfriamiento.
  2. Preparar medios de cultivo que contengan diferentes fuentes de carbono con un medio base VI. Antes del autoclave, añadir 8 g/L de fibras Bif EPS a medio VI, compuesto por el grupo VI_Bif. Además, añadir 8 g/L de almidón a medio VI para representar el grupo VI_Starch. Por último, el medio VI sin adición de una fuente de carbono se utiliza como control (grupo VI).
    NOTA: Bif EPS y almidón se disuelven primero en agua caliente utilizando un agitador magnético, luego se mezclan con un medio VI preparado.
  3. Autoclave todos los medios a 121 oC durante 15 min y dejar enfriar a RT.
  4. Transfiera una submuestra (5 ml) de cada medio a los tubos de cultivo en una incubadora anaeróbica, y almacene el medio restante a 4 oC.

4. Preparación de muestras fecales humanas

  1. Recoger muestras fecales frescas inmediatamente después de la defecación fresca de voluntarios humanos adultos sanos usando recipientes de heces, y posteriormente utilizar para la preparación de lodos.
    NOTA: Antes de la recolección de la muestra, todos los voluntarios deben ser examinados para asegurar que no reciban antibióticos, probióticos, o tratamientos prebióticos durante al menos 3 meses antes de donar muestras. Además, todos los donantes deben proporcionar consentimiento informado y por escrito.
  2. Transfiera una muestra fecal fresca (1 g) a 10 ml de PBS anaeróbico de 0,1 M (pH 7,0) en vasos de vidrio y, a continuación, utilice varillas de vidrio para preparar una suspensión del 10% (p/v).
  3. Utilice un tamiz de 0,4 mM para filtrar la suspensión fecal. A continuación, utilice una submuestra de la suspensión filtrada para inocular los experimentos de fermentación del cultivo por lotes y almacene el resto a -80 oC para análisis posteriores.
    NOTA: Los pasos 4.2–4.3 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.

5. Fermentación por lotes in vitro

  1. Añadir lodos fecales filtrados (500 l) al medio de fermentación preparado en el paso 3.2 dentro de una cámara anaeróbica, luego incubar a 37 oC.
  2. Recoger 2 ml de muestras fermentadas a 24 h y 48 h en la cámara anaeróbica y luego centrifugar fuera de la cámara a 6.000 x g durante 3 min.
  3. Transfiera cuidadosamente los sobrenadores a un nuevo tubo centrífugo que se utilizará para el análisis de degradación de polisacáridos y las mediciones de ácidos grasos de cadena corta (SCFA).
  4. Almacene los gránulos de centrifugación a -80 oC y, posteriormente, utilícelos para la extracción de ADN genómico bacteriano.

6. Degradación de EPS por microbiota fecal humana

  1. Cargar 0,2 l de sobrenatantes fermentados en placas de aluminio tLC con gel de sílice pre-revestido-60, luego secar con un secador de pelo.
  2. Desarrollar las placas en 20 ml de una solución de ácido fórmico/n-butanol/agua (6:4:1, v:v:v) y secar con un secador de pelo.
  3. Remoje las placas en el reactivo de orcinol para teñir, luego seque con un secador de pelo.
    1. Preparar reactivos de orcinol disolviendo 900 mg de Liquenol en 25 ml de agua destilada y añadiendo 375 ml de etanol. Posteriormente, el ácido sulfúrico concentrado debe añadirse lentamente y mezclar la solución a fondo.
  4. Caliente las placas a 120 oC durante 3 minutos en un horno de hornear y evalúe la degradación de las EPS midiendo las bandas TLC.

7. Efectos de las EPS en la microbiota intestinal humana

  1. Congele congele las muestras fecales originales preparadas en el paso 4.3 y las muestras fermentadas preparadas en el paso 5.4.
  2. Extraiga el ADN genómico bacteriano (ADN) de todas las muestras utilizando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano de heces siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Determine las concentraciones de ADN, las integridades y las distribuciones de tamaño utilizando un microespectrofotómetro y una electroforesis de gel de agar.
  4. Realizar PCR de genes rRNA bacterianos 16S a partir del ADNg extraído utilizando las siguientes imprimaciones delanteras y inversas descritas anteriormente12:
    -imprimación de avance (imprimación de código de barras 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
    -imprimación inversa (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    Utilice las siguientes condiciones de ciclor térmico:
    1. 94oC durante 5 min.
    2. 94oC para 30 s.
    3. 55oC para 30 s.
    4. 72oC durante 1 min.
    5. Repetir 2–4 para 35 ciclos
    6. 72oC durante 5 min.
    7. 4 oC mantener hasta retirar del ciclor térmico.
  5. Llevar a cabo la secuenciación de alto rendimiento de productos de PCR en una empresa de secuenciación de ADN utilizando análisis de comunidad microbiana de ultra alto rendimiento.
  6. Obtenga secuencias limpias y de alta calidad utilizando la canalización de análisis de secuencias de Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)13.
  7. Definir unidades taxonómicas operativas (OTU) para secuencias genéticas de rRNA 16S con similitud de nucleótidos superior al 97% utilizando herramientas bioinformáticas como la suite de software Mothur14.
  8. Elija una secuencia representativa de cada OTU y utilice el clasificador RDP junto con la base de datos taxonómica SILVA para clasificar las secuencias representativas15.
  9. Calcule la cobertura de Good, las métricas de diversidad alfa (incluido el índice Simpson y Shannon) y la riqueza (número observado de OTU) utilizando las herramientas bioinformáticas16.

8. Efectos de las EPS en la producción de SCFA por microbiota intestinal humana

  1. Añadir supernatores fermentados (1 ml) preparados en tubos centrífugos de 5,3 a 2 ml.
  2. Añadir 0,2 ml de ácido metafosfórico al 25% (p/v) de ácido metafosfórico a cada una de las muestras y mezclar a fondo las soluciones mediante vórtice.
  3. Centrifugar las mezclas a 13.000 x g durante 20 min y transferir los sobrenadores a tubos frescos.
  4. Concomitantemente, preparar soluciones de 120 mM ácidos acéticos, propónicos, butíricos, isobutíricos, valerico y isovalerico. A continuación, añadir 1 ml de cada ácido preparado a 1,2 ml de 25% (p/v) de ácido metafosfórico y utilizar como cócteles estándar.
  5. Filtrar las muestras utilizando una membrana de 0,22 m.
  6. Detectar concentraciones de SCFA mediante cromatografía de gases de alto rendimiento de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente11,17.
    NOTA: Se utiliza una columna InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) para la cromatografía de gases (GC). A continuación, las concentraciones de SCFA se cuantifican en función de las áreas pico utilizando el método estándar interno de un solo punto en el paquete de software GC Solution.

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Results

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La producción de EPS mucoide se pudo observar en cultivos B. longum en placas PYG después de la incubación anaeróbica durante 72 h (Figura1A). La centrifugación de los raspaduras de cultivo, seguida de la precipitación de etanol y el secado, dio lugar a la recolección de EPS similares a la celulosa (Figura1B). Las EPS secas y el almidón soluble se utilizaron entonces como fuentes de carbono para cultivos de fermentación. TLC se utilizó para la separació...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han realizado progresos significativos hacia la comprensión de la composición y las actividades de la microbiota intestinal humana en la última década. Como consecuencia de estos estudios, ha surgido el concepto holobionte, que representa las interacciones entre los huéspedes y las comunidades microbianas asociadas, como entre los seres humanos y su microbiota intestinal19,20. Además, los seres humanos son incluso ahora considerados como superorganismos

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Disclosures

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Las cifras fueron citadas en Yin et al. 11.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue financiado por la National Nature Science Foundation of China (No. 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (No. 2018JJ3200), y el programa de construcción de disciplina característica aplicada en la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia linguística durante la preparación de este manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 y micro; m filtros de membranaMilliporeSLGP033RBUso para filtrar muestras
Tamiz de 0,4 mmThermo Fischer308080-99-1Uso para preparar muestras fecales humanas
5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido (X-Gal)SolarbioX1010Uso para preparar placa de color
AceticSigma-Aldrich71251Muestra estándar para agar SCFA
SolarbioYZ-1012214El componente de
la cámara anaeróbicaElectrotek AW 400SGCultivo y fermentación de bacterias
AutoclaveSANYOMLS-3750Úselo para autoclave
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178El componente del horno de
horneadoShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AÚselo para calentar y hornear
Extracto de carne de resSolarbioG8270El componente del medio
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870&comercio;gérmenes
Sales biliaresSolarbioYZ-1071304El componente del medio
ButyricSigma-Aldrich19215Muestra estándar para SCFA
CaCl2SolarbioC7250Solución salina del medio
Columna capilarSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm &veces; 30 m &veces; 0,25 μ m)Utilizado para la detección de SCFA
Peptona de caseínaSigma-Aldrich39396El componente de la
centrífugaThermo ScientificSorvall ST 8Uso para la centrifugación
CoSO4.7H2OSolarbioC7490El componente del medio
CuSO4.5H2OSolarbio203165El componente del medio
Cisteína-HClSolarbioL1550El componente del medio
EtanolSigma-AldrichE7023Úselo para preparar vitamina K1
FeSO4.7H2O SolarbioYZ-111614El componente del medio
Ácido fórmicoSigma-Aldrich399388Utilizado para TLC
Cromatografía de gasesShimadzu CorporationGC-2010 PlusSe utiliza para la detección de SCFA
Vaso de precipitados de vidrioFisher ScientificFB10050Se utiliza para la preparación de lodos
GlucosaSolarbioG8760El componente del medio
HaeminSolarbioH8130El componente del medio
HClSigma-Aldrich30721Solución básica utilizada para ajustar el pH de los tampones
IsobutíricoSigma-Aldrich46935-UMuestra estándar para
ácidos isovaléricosSigma-Aldrich129542Muestra estándar para AGCC
K2HPO4SolarbioD9880Solución salina de
KClSolarbioP9921El componente del medio
KH2PO4SolarbioP7392Solución salina del medio
LiCl.3H2OSolarbioC8380Úselo para preparar placas de color
Extracto de carneSigma-Aldrich-Aldrich70164El componente del medio
Ácido metafosfóricoSigma-AldrichB7350Muestra estándar para SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160El componente del medio
MgSO4.7H2OSolarbioM8300Solución salina del
MISEQIlluminaMiSeq 300PESecuenciación de ADN
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Solución salina de medio
MupirocinaSolarbioYZ-1448901Antibiótico
NaClSolarbioYZ-100376Solución salina de medio
NaHCO3Sigma-Aldrich792519solución salina de medio
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Determinar las concentraciones de ADN
NaOHSigma-Aldrich30620Solución básica utilizada para ajustar el pH de los tampones
n-butanolChemSpider71-36-3Se utiliza para TLC
NiCl2Solarbio746460El componente del medio
OrcinolSigma-Aldrich447420Se utiliza para preparar reactivos
de orcinolPropionicSigma-Aldrich94425Muestra estándar para SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Extracto de ADN genómico bacteriano
Polvo de PBS listo para usarSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Se utiliza para preparar la suspensión lipídica
ResazurinSolarbioR8150Equipo anaeróbico
Concentrador de vacíode velocidad LABCONCOCentriVapUso para preparar EPSs
AlmidónSolarbioYZ-140602Uso para la fuente de carbono
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich150692Se utiliza para preparar reactivos
T100 PCRBIO-RADamplificación de PCR
Láminas de aluminio TLCMerckMillipore116835utilizado para TLC
tripticasa PeptonaSigma-AldrichZ699209El componente del medio
TriptonaSigma-AldrichT7293El componente del medio
Tween 80SolarbioT8360Solución salina del medio
ValericSigma-Aldrich75054Muestra estándar para SCFA
Vitamina K1Sigma-AldrichV3501El componente del
medio Oscilador de vórticeScientific IndustriesVortex.Genie2Uso para el vorticing
Extracto de levaduraSigma-AldrichY1625El componente del medio
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251El componente del medio
media medio media SCFA medio sistemade orcinol 1861096

References

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