Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.
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Artículo de método
Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental
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Resumen
Resumen
Los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos a la biotransformación o inducen estrés oxidativo. Entre las nucleobasas oxidadas, la más estudiada es la 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN. Los aldehídos y los epoxialdehídos resultantes del proceso de peroxidación lipídica son moléculas electrofílicas capaces de formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como los aductos de etheno 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) y 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación. Los métodos selectivos y sensibles para su cuantificación en el ADN son necesarios para el desarrollo de estrategias preventivas que ralentizan las tasas de mutación celular y el desarrollo crónico de la enfermedad (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas). Entre los métodos sensibles disponibles para su detección (cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a detectores de espectrometría de masas en tándem o electroquímico, ensayo de cometas, inmunoensayos, 32P-etiquetado posterior), los más selectivos son los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas tándem (HPLC-ESI-MS/MS). La selectividad es una ventaja esencial al analizar muestras biológicas complejas y HPLC-ESI-MS/MS evolucionada como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente.
Presentamos aquí métodos validados, precisos y precisos de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo y 1,n2-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de los efectos de la exposición ambiental PM2,5 .
Introducción
Algunas especies reactivas de oxígeno (ROS) son capaces de oxidar enlaces dobles de carbono de bases de ADN y algunos carbonos en la fracción desoxirribosa, generando bases oxidadas y roturas de hebras de ADN1. Como una molécula cargada negativamente rica en átomos de nitrógeno y oxígeno, el ADN es también un objetivo para los grupos electrófilos que reaccionan covalentemente con los sitios nucleófilos (nitrógeno y oxígeno), dando productos que se denominan aductos de ADN2. Por lo tanto, los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la tox....
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Protocolo
Ratones a/J masculinos de cuatro semanas de edad, libres de patógenos específicos, se obtuvieron del centro de cría de animales de laboratorio de la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Río de Janeiro, Brasil, y fueron tratados en consecuencia al Comité ético de la Facultad de medicina, Universidad de São Paulo (Protocolo no 1310/09).
1. recolección de los tejidos de ratones
- Anestesiar el animal con xilazina y ketamina. Para un ratón con 30 g de peso corporal, inyectar una solución (no más de 2 mL) que contenga 2,63 mg de ketamina y 0,38 mg de xilazina, intraperitonealmente.
- Recolectar sangre (0,5-1,5 mL) para aná....
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Resultados
Las concentraciones medias de ADN (± SD) obtenidas a partir de ratones hígado (~ 1 g de tejido), pulmón (~ 0,2 g de tejido) y riñón (~ 0,4 g de tejido) fueron, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 y 3.223 ± 723 μg/mL en el volumen final de 200 μL. En la figura 3se muestra un cromatograma representativo obtenido por HPLC-DAD del ADN purificado. La presencia de los cuatro 2 '-desoxinucleósidos, libre del ARN ribonucleósidos, que eluye inmediatamente an.......
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Discusión
Un problema importante que se encuentra en los análisis de 8-oxodguo por métodos de HPLC es la posible inducción de su formación durante los procedimientos de trabajo de extracción de ADN, hidrólisis de ADN, y la concentración de ADN hidrolizados22,38. Con el fin de minimizar el problema de la formación artística de 8-oxodGuo, se recomienda la adición de deferoxamina a todas las soluciones de extracción de ADN, almacenamiento e hidrólisis, el uso del método chaot.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 y 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 y 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) y CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. f. Oliveira y A. A. F. Oliveira recibieron becas de FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) y CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior). M. h. g. Medeiros, P. di Mascio, p. h. n. Saldiva, y ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2'-desoxiadenosina | Laboratorios de isótopos de Cambridge | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2'-desoxiguanosina | Laboratorios de isótopos de Cambridge | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrilo | Reactivos de Carlo Erba | 412413000 | |
| alcalinos fosfatasa de la mucosa intestinal bovina | Sigma | P5521 | |
| acetato de amonio | Merck | 101116 | |
| timo de ternera DNA | Sigma | D1501 | |
| solución de lisis celular | QIAGEN | 158908 | |
| cloroformo | Carlo Erba Reactivos | 412653 | |
| deferoxamina | Sigma | D9533 | |
| desoxirribonucleasa I (DNasa I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| etanol | Carlo Erba Reactivos | 414542 | |
| ácido fórmico | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS sistema | HPLC: Agilent serie 1200 ESI-MS/MS: HPLC de Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | : bomba binaria (G1312B), bomba isocrática (G1310A), horno de columna con válvula de conmutación de columna (G1316B), detector de matriz de diodos (G1315C), muestreador automático (G1367C). ESI-MS/MS: Espectrómetro de masas de trampa de iones cuadrupolar lineal, modelo 4000 QTRAP. | |
| Sistema HPLC/DAD | Shimadzu Dos | bombas (LC-20AT), detector de matriz de fotodiodos (DAD-20AV), autoinyector (Proeminence SIL-20AC), horno de columna (CTO-10AS/VP) | |
| Columna de HPLC (50 x 2,0 mm i.d., 2,5 y micro; m, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| Columna de HPLC (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 y micro; m, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| Columna de HPLC (250 x 4,6 mm i.d., 5,0 y micro; m, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| Cartucho de guardia de seguridad HPLC C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| alcohol isoamílico | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| alcohol isopropílico (isopropanol) | Reactivos Carlo Erba | A412790010 | |
| ketamina | Ceva | Nombre comercial: Cloruro de magnesio Dopalen | |
| Reactivos Carlo Erba | 349377 | ||
| cloruro de magnesio | Sigma | M2393 | |
| metanol | Carlo Erba Reactivos | L022909K7 | |
| fosfodiesterasa I de Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| solución de precipitación de proteínas | QIAGEN | 158912 | |
| proteinasa K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonucleasa A | Sigma | R5000 | |
| sodio cloruro | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hidroximetil)-aminometano | Carlo Erba Reactivos | 489983 | |
| xilacina | Syntec do Brasil | Nombre comercial: Xilazin |
Referencias
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
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Reimpresiones y permisos
