Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

هنا نقدم السابقين فيفو مختلطة نظام الثقافة أحاديه الطبقة لدراسة الهجرة الخلية البشرية الورم (hGC) في الوقت الحقيقي. يوفر هذا النموذج القدرة علي مراقبه التفاعلات بين عارضه والمحاور النخاعية وغير النخاعية داخل غرفه مجزاه.

Abstract

الورم المفلطح هو واحد من السرطانات البشرية الأكثر عدوانيه بسبب التغاير الخلوي واسعه النطاق وخصائص الهجرة من عارضه. من أجل فهم أفضل للأليات الجزيئية الكامنة وراء هجره خلايا الورم الدبقي ، من الضروري القدرة علي دراسة التفاعل بين عارضه والمحاور داخل البيئة المجهرية للورم. من أجل نمذجة هذا التفاعل الخلوي ، قمنا بتطوير نظام الثقافة المختلطة التي تتكون من عارضه والظهرية الجذر عقد قاعدي (drg) الثقافات المشتركة اكسون-oligodendrocyte. تم اختيار الثقافات DRG لأنها يمكن ان تكون معزولة بكفاءة ويمكن ان تشكل التوقعات طويلة وواسعة والتي تعتبر مثاليه للدراسات الهجرة من هذا النوع. ثم تمت أضافه الفئران المنقية oligodendrocytes علي الفئران المنقية drg محاور والمستحثة إلى النخاع. بعد التاكد من تشكيل الميالين المدمجة ، تمت أضافه عارضه أخيرا إلى الثقافة المشتركة وتم رصد تفاعلاتها مع محاور drg و oligodendrocytes في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الزمني الفاصل. وفي ظل هذه الظروف ، عارضه شكل البنية التجميعية الشبيهة بالورم التي تعبر عن GFAP و Ki67 ، وتهاجر علي طول المسارات المحورية النخاعية وغير النخاعية وتتفاعل مع هذه المحاور من خلال تشكيل الكاذبة. ويمكن استخدام نظام الثقافة المشتركة السابقة لدينا للتعرف علي أليات الخلوية والجزيئية الجديدة للهجرة hGC ويمكن استخدامها لاختبار فعاليه المخدرات في المختبر.

Introduction

الورم المفلطح هو واحد من الأورام الأكثر عدوانيه وفتكا في الدماغ البشري. ويشمل المعيار الحالي للرعاية الاستئصال الجراحي للورم تليها الإشعاع1 زائد المصاحبة والاداريه المساعد لtemozolomide2. حتى مع هذا النهج متعدد العلاجية, تكرار الورم لا مفر منه3. ويرجع ذلك جزئيا إلى طبيعة الهجرة واسعه النطاق من الخلايا السرطانية ، التي تغزو الدماغ حمه خلق العديد من التوقعات مثل الاصبع داخل الدماغ4 التي تجعل استئصال كامل من غير المحتمل.

في السنوات الاخيره ، أصبح من الواضح ان العدوانية من الورم الدبلاستومي يرجع ، في جزء منه ، إلى وجود السكان من الخلايا الجذعية السرطانية داخل كتله الورم5،6، والتي تظهر احتمالات الهجرة عاليه7،8، مقاومه العلاج الكيميائي والإشعاع9،10 والقدرة علي تشكيلالأورامالثانوي GSCs هي قادره علي تلخيص الأورام متعددة الأضلاع الاصليه عندما xenografted إلى الفئران عاريه5.

وعلي الرغم من ثروة المعرفة المتعلقة بالخلفية الوراثية للأورام السرطانية ، فان الدراسات المتعلقة بالهجرة الخلوية (GC) تعرقل حاليا بسبب نقص الكفاءة في المختبر أو في نماذج الهجرة المجرية. وعلي وجه الخصوص ، في حين ان التفاعلات الخلوية المحورية المكونة من قبل العوامل الخلوية والبيئية تشكل عنصرا أساسيا في غزو الدروما ، فان معرفتنا لا يوجد حاليا اي نظام تجريبي مع القدرة علي نمذجة هذه التفاعلات12،13،14. لمعالجه هذا النقص ، قمنا بتطوير نظام الثقافة المجرية السابقة لعارضه الاوليه المشتركة مع المنقي DRG اكسون-oligodendrocytes التي تؤدي إلى ارتفاع التعبير عن علامات الورم المتمايزة ، فضلا عن الهجرة واسعه النطاق والتفاعل من عارضه مع ألياف النخاعية وغير النخاعي هذه المنصة المجرية السابقة ، بسبب تخطيطها مجزاه ، هو مناسبه لاختبار اثار المداواة الرواية علي أنماط الهجرة hGC.,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي بروتوكولات جمع وعزل ونشر خلايا الورم الدبقيه البشرية المستمدة من المريض من قبل لجنه الهجرة والاستشفاء في مستشفي رود ايلاند. تم الحفاظ علي جميع الكائنات وفقا لدليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية. تمت الموافقة علي جميع بروتوكولات استخدام الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام من مستشفي رود ايلاند.

1-التحضيرات الاعلاميه والعازلة

  1. اعداد 50 مل من وسائل الاعلام العصبي: 1x العصبية القاعدية المتوسطة ث/س فيتامين (ا) ، 1x المصل مجانا الملحق ث/س فيتامين (ا) ، 2 مم L-الجلوتامين ، 20 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 20 نانوغرام/مل الاساسيه-عامل النمو الليفية (FGF) ، 2 ميكروغرام/مل الهيبارين ،
  2. اعداد 50 مل من تكمله العصبية القاعدية المتوسطة: 1x المتوسطة العصبية القاعدية ، 1x المصل مجانا الملحق ، 4 غرام/لتر D-الجلوكوز ، 2 ملم L-الجلوتامين ، و 50 ng/mL عامل نمو العصب (NGF).
  3. اعداد 500 مل من N2B2 المتوسطة: 1:1 دولبيكو تعديل النسر المتوسطة--هام في المغذيات F12 الخليط (DMEM-F12) ، 1x الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم (لها-G) ، 66 ملغ/مل البقري المصل الزلال (جيش صرب الدين) ، 0.1 ملغ/مل ترانسفيرين ، 0.01 ملغ/مل البيوتين ، 6.29 ملغ/مل البروجسترون ، 5 ميكروغرام/مل N-اسيتيل-L-سيستين (NAC) ، و 1 مم putriscine. Aliquot وتجميد عند-20 درجه مئوية.
  4. اعداد 500 مل من C-المتوسطة: 1x الحد الأدنى الاساسيه (م) ، D-الجلوكوز (النهائي 4 غرام/لتر) ، 10 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، و 2 مم L-الجلوتامين. Aliquot وتجميد عند-20 درجه مئوية. أضافه عامل نمو العصب (NGF) الطازجة قبل الاستخدام (50 ng/mL).
  5. اعداد 200 mL من بابين العازلة: 1x الحل الملح متوازنة Earle (EBSS) ، 100 mM ملغ2حتى4، 30 ٪ الجلوكوز ، 0.25 m egta ، و 1 م ناهكو3.
  6. اعداد 10 مل من DMEM-ل-G المتوسطة: 1x DMEM ، 0.5 ٪ جيش صرب الجمهورية ، و 1x لها-G.
  7. اعداد 200 مل من المخزن المؤقت PB: 1x الفوسفات المحلول الملحي المخزنة في دولبيكو (DPBS) دون Ca2 + و Mg2 + و 0.5 ٪ بوسنيا. Degas العازلة قبل الاستخدام والحفاظ علي الجليد.

2. العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية العصبية الدروما

  1. عزل الأعصاب
    1. جمع الهجرة المعتمدة ووافق المريض الانسجه البشرية الطازجة الورم المفلطح (GBM) من غرفه العمليات. نقل عينات GBM علي الجليد في DPBS التي تحتوي علي 2x مكافحه مضاده لل BL2 السلامة البيولوجية المعتمدة مجلس الوزراء.
    2. نقل 1 سم3 gbm عينه مع الحد الأدنى من النخر أو تلوث خلايا الدم الحمراء إلى لوحه 60 مم ومقطعه إلى 1 مم3 شظايا. أزاله اي DPBS الزائدة.
    3. هضم النسيج مع 5 مل من كولاجيناز/ديداز (1 ملغ/مل) لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية ودوامه بلطف الطبق كل دقيقه 5-10.
    4. نقل شظايا هضمها إلى أنبوب 50 mL والثلاثيات بواسطة الأنابيب مع ماصه 10 مل عده مرات لانفصال الانسجه.
    5. أضافه كميه متساوية من وسائل الاعلام العصبية والانسجه مره أخرى. السماح لشظايا كبيره لتسويه.
    6. أزاله الوسائط دون شظايا الانسجه وتمرير ببطء من خلال مصفاه الخلية 70 μM وضعت علي أنبوب 50 mL الطازجة.
    7. كرر الخطوات 2-1-5-2-1-6 حتى يتم فصل جميع الانسجه ، وتغيير مصفاه الخلية حسب الحاجة.
    8. تدور تعليق الخلية في 110 x ز لمده 10 دقيقه.
    9. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من ACK ليسينج العازلة لأزاله تلوث خلايا الدم الحمراء. احتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    10. تدور تعليق الخلية في 110 x g لمده 5 دقائق.
    11. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الاعلام نيوروكروي. خذ 10 μL من تعليق الخلية وتمييع مع 10 μL من التريلون الأزرق. عد 10 μL من تعليق الخلية باستخدام عداد الخلية الألى أو الصفيحة الدموية ولوحه في 10 مل من وسائل الاعلام العصبية في كثافة 3 × 106 خلايا في 100 مم تعليق لوحات الثقافة.
    12. أضافه 2 مل من وسائل الاعلام العصبية الطازجة إلى الثقافة 2-3 مرات في الأسبوع.
      ملاحظه: سيتم تشكيل الأعصاب في تعليق خلال 3-4 أسابيع. بعد الخياطة ل 2-4 مرات ، وتاكيد ستيمنس عن طريق الحد من التخفيف المقايسة والأورام التلخيص عن طريق زرع xenographic في الفئران المناعية كما هو موضح سابقا 22.
  2. المجالات العصبية الفرعية
    1. عندما تشكل المجالات وتصل إلى قطر بين 200-500 μm ، نقل الأعصاب إلى أنبوب 15 مل وتدور في 110 x ز لمده 5 دقائق.
    2. أعاده تعليق المجالات العصبية في 1 مل من محلول انفصال الخلية قبل الإحماء.
    3. نقل إلى أنبوب 1.5 mL واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    4. تعيين ماصه P200 إلى 150 μL و تريلوريات عن طريق التنضيد صعودا ونزولا إلى انفصال المجالات العصبية.
    5. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب 15 مل. أضافه 4 مل من وسائل الاعلام العصبية وتدور في 300 x ز لمده 5 دقائق.
    6. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في 5 مل من وسائل الاعلام نيوروكروي. خذ 10 μL من تعليق الخلية وتمييع مع 10 μL من التريلون الأزرق. عد 10 μL من تعليق الخلية باستخدام عداد الخلية الألى أو الصفيحة الدموية ولوحه في كثافة من 1 × 106 خلايا/60 ملم طبق في الحجم النهائي من 4 مل.
    7. تحديث الوسائط 2 مرات في الأسبوع وخلايا الثقافة الفرعية حسب الحاجة. تجميد المجالات العصبية الكاملة عند الرغبة في وسائل الاعلام القاعدية العصبية ث/س فيتامين A تستكمل مع 10 ٪ DMSO. ويمكن استخدام الأعصاب للتجارب بعد P4.

3. ثقافة أيها من الفئران الظهرية الجذر Ganglia (DRGs) ، Oligodendrocytes (OPCs) و عارضه

  1. اعداد الاطباق الثقافية الايهاه
    ملاحظه: تنفيذ الخطوات التالية الأيام قبل الحصاد المخططة من DRGs.
    1. تجميع الاطباق الثقافية أيها.
    2. تمييع محلول الكولاجين الأسهم إلى 500 ميكروغرام/مل في معقمه المقطر H2O; تخلط جيدا.
    3. مع ماصه نقل معقمه ، وملء طبق الثقافة 35 mm مع 2 مل من محلول الكولاجين. أزاله الحل ، وترك فيلم رقيقه من الكولاجين وراء وضعه في المقبل 35 مم الطبق. كرر هذه العملية ، أضافه المزيد من محلول الكولاجين حسب الحاجة ، حتى يتم المغلفة جميع الاطباق.
    4. مره واحده جميع لوحات هي المغلفة ، ووضع لوحات في صينية 245 مم × 245 مم الثقافة ووضع ثلاثه 1 مم × 1 مم الشاش منصات في وسط الدرج.
    5. لتتبلمر الكولاجين ، والشاش الرطب منصات مع 1 مل من هيدروكسيد الأمونيوم المركزة وتغطيه الصواني لمده 15 دقيقه.
    6. أزاله منصات الشاش والسماح للاطباق 35 مم لتجف في غطاء المحرك الصفحي التدفق.
    7. في حين يتم تجفيف الاطباق ، وتحميل برميل من الشحوم حقنه قضيب مع الشحوم فراغ عاليه. وضع الغرف الايهاه في زجاجه كبيره الفم وسائل الاعلام مليئه بالماء المقطر. تعقيم علي حد سواء عن طريق التعقيم والسماح لتبرد.
    8. الملف خارج النقطة من 18-ز الوخز بالابر لجعل غيض حاده. تعقيم في 70 ٪ الايثانول. قم بتوصيل الابره بحقنه الشحوم.
    9. تعقيم دبوس أشعل الموقد عن طريق تمرغ في الايثانول 70 ٪ ؛ السماح لها بالهواء الجاف في غطاء المحرك الصفحي التدفق.
    10. أزاله الغطاء من الجافة ، طبق الكولاجين 35 mm المغلفة. امسك الطبق بين اصبع الإبهام والمؤشر. امسك الدبوس باليد الأخرى تطبيق ضغط صارم لخلق حتى 200 μM الخدوش واسعه في جميع انحاء مركز الطبق.
    11. وباستخدام ماصه المرعي ، ضع قطرين من الخلايا العصبية القاعدية المدعمة في وسط الخدوش.
    12. كرر الخطوات 3.1.10-3.1.11 حتى يتم خدش جميع الاطباق.
    13. جفف الغرف الايهاه في غطاء التيار الرقائقي.
    14. مع ملقط الاصبغه الدموية المعقمة ، وفهم غرفه واحده أيها من المفرق المركزي. الوجه ملقط الأرقاء حتى الجزء السفلي من الغرفة هو مواجهه.
    15. تطبيق الشحوم سيليكون إلى غرفه أيها ، بدءا من الأعلى. تاكد من وضع الشحوم بدقه والتداخل في جميع الزوايا.
    16. قم بازاله الغطاء من طبق 35 ملم. عكس الطبق ووضع الخدوش علي الغرفة. اضغط لأسفل علي الجزء السفلي من لوحه برفق مع زوج من ملقط.
    17. اقلب اللوحة برفق باستخدام ملقط الاصبغه الدموية. حرر الملقط.
    18. ضع كومه من الشحوم في قاعده المقصورة المركزية. ملء كل غرفه مع تكمله العصبية القاعدية المتوسطة (NB) والتحقق من وجود تسرب. تسرب الختم مع الشحوم سيليكون حسب الحاجة.
    19. مواصله تجميع جميع الاطباق الثقافية وتخزين بين عشيه وضحيها في 37 ° ، 5 ٪ CO2.
  2. عزل الفئران DRG الخلايا العصبية والثقافة في غرفه أيها
    1. التضحية الحامل في التوقيت E16 Sprague-Dawley الفئران بواسطة CO2 خنق أو عن طريق جرعه زائده من المواد الكيميائية.
    2. وضع الحيوانية في موقف ضعيف علي سطح نظيف. تطهير البطن مع 70 ٪ الايثانول.
    3. امسكي جلد البطن السفلي بالملقط وارفعيه برفق.
    4. باستخدام مقص ، وجعل "انا" شق علي طول الخط الأوسط من الحيوانية ، مع الحرص علي عدم ثقب عضلات جدار البطن.
    5. مع زوج نظيف من الملقط ، وفهم جدار العضلات وجعل شق عرضيه مع زوج نظيفه من مقص باستخدام الحذر لا لثقب الرحم أو الأمعاء.
    6. مع زوج من ملاقط حاده ، وفهم الرحم ورفع بلطف علي التوالي من التجويف البريتوني.
    7. باستخدام مقص معقمه جديده ، ومقطع النسيج الضام في قاعده كل قرن الرحم.
    8. ضع الرحم بأكمله في طبق الزراعة النسيجية المعقمة 100 مم.
    9. حمل الرحم إلى غطاء للتدفق الرقائقي لتشريح.
    10. أزاله الاجنه من الرحم ، واحده في كل مره ، عن طريق قطع من خلال الكيس السلوى وأغاظه بلطف الجنين خارج والي صحن 60 مم يحتوي علي 5 مل من L-15 مع 1x القلم-بكتيريا.
    11. مع ملقط دقيق ، ضع 3-4 الاجنه في طبق 60 مم يحتوي علي 5 مل من L-15 مع 1x القلم-بكتيريا.
    12. العمل تحت تشريح المجهر ومع جنين واحد في كل مره ، موت ببطء عن طريق قطع الراس.
    13. الاستلقاء علي الجانب البطني الجنيني وأزاله الأطراف والذيل.
    14. مع ملقط دقيق ، وجعل شق الخط النصفي في الحيوانية.
    15. أزاله الأعضاء الداخلية والانسجه للكشف عن الهياكل الظهرية ، وخاصه الحبل الشوكي الذي ينبغي ان تكون مرئية عند الانتهاء.
    16. ضع شفره واحده من المقص الصغير التشريح بين العمود الفقري والقناة الشوكية واقطع بعناية من خلال العمود الفقري للكشف عن النخاع الشوكي. الحرص علي عدم مقطع من خلال الحبل الشوكي.
    17. مع الملقط الناعم ، امسكي بخفه نهاية الحبل الشوكي وارفعيه ببطء من الجنين. سيتم ربط ال DRGs بالحبل الشوكي
    18. نقل الحبال الشوكية والمرفقة DRGs إلى صحن 35 مم يحتوي علي 2 مل من L-15 مع 1x القلم-بكتيريا. مكان علي الجليد.
    19. مره واحده وقد تم عزل جميع الحبال الشوكية ، واستخدام ملقط غرامه لنتف بشكل فردي DRGs من الحبل الشوكي. ضع DRGs في طبق جديد 35 مم.
    20. إذا كانت الجذور العصبية موجودة علي DRGs ، قم بقصها بعيدا.
    21. أزاله الاطباق المعدة 35 مم من 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه. قم بازاله الوسائط من اليوم السابق. مكان 80 μL من الخلايا العصبية القاعدية المكملة (الفجيرة) التي تحتوي علي 10 μM 5-فلورو-2 '-ديوكسيرادين (FUDR) في المقصورة المركزية و 250 μL من وسائل الاعلام في كل المقصورة الخارجية.
    22. ضع 2 عقد قاعدي في كل حجره مركز. عوده الاطباق إلى 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
    23. في اليوم التالي أضافه 2.5 مل من الفجيرة.
    24. تغذيه الثقافات التالية الجدول الزمني في الجدول 1، تغيير الجدول الزمني استنادا إلى اليوم الذي تم اختياره لبدء الاعداديه drg.
    25. في اليوم 21 (أو عندما تصل محاور إلى نهاية المقصورات البعيدة) ، اما ثقافات البذور مع الأعصاب gbm (المضي قدما إلى الخطوة 3.2.26) والصورة الحية أو نخاع الثقافات مع الثقافات oligodendrocytes (المضي قدما إلى الخطوة 3.3) ومن ثم البذور مع العصبية gbm بعد النخاع.
    26. استبدال المتوسطة NB في كل غرفه أيها البعيدة التي سيتم المصنفة مع العصبي GBM مع تكمله NB المتوسطة التي تحتوي علي 10 ٪.
    27. مع مجموعه ماصه P20 إلى 10 μL ، قم بازاله واحده من الأعصاب GBM من طبق الثقافة. يجب ان يقيس النطاق العصبي GBM حوالي 200 ميكرون في الحجم.
    28. ضع طرف الماصة في الغرفة البعيدة واطرد أعصاب GBM ببطء بحيث يسقط برفق علي المحاور في الجزء من الغرفة البعيدة الأقرب إلى الغرفة المركزية ، علي المحاور بالقرب من الغرفة المركزية. احرص علي عدم السماح لطرف الماصة بتعطيل المحاور.
    29. اترك الثقافة في خزانه السلامة البيولوجية لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة للسماح للمجال العصبي GBM لنعلق.
    30. بمجرد ان الأعصاب قد تعلق ، بعناية فائقه استبدال وسائل الاعلام في المقصورة البعيدة مع تكمله NB المتوسطة.
    31. ثقافات الصور الحية لأيام 3-7 ، أضافه وسائل الاعلام حسب الحاجة. وفي هذه الحالة ، تم استخدام حاويه الخلية الحية التي تسيطر عليها CO2 المرفقة بالمجهر (علي سبيل المثال ، زيزيس اكسيبريي) لمراقبه هجره الخلايا بشكل مستمر لمده 7 أيام باستخدام الحقل الساطع. تم الحصول علي الصور كل 10 دقائق باستخدام البرامج المرتبطة. كرر نفس البروتوكول باستخدام عارضه التي تم نقلها بشكل ثابت للتعبير عن GFP وتم التقاط الصور باستخدام مزيج من برايت والليزر 488 nm.
      ملاحظه: قد يتم نقل العصبية مع لينتيفيروس أو المحولة مع البلازميدات أو siRNAs. ويمكن أيضا معالجه المقصورات بمثبطات الجزيئات الصغيرة المطلوبة لدراسة الهجرة.
  3. النخاع النخاعي من Axons مع اوليغوداندروسايتس
    1. اليوم قبل العزلة اوليجوديندروسيتي ، استبدال المتوسطة NB في drgs مع C-المتوسطة.
    2. قبل تشريح ، مكان 10 مل من بابين العازلة في صحن 60 ملم في الحاضنة لتتوازن.
    3. في غطاء التيار الصفحي ، وملء 1 100 مم طبق وطبق 1 60 مم مع الجليد HBSS الباردة. مكان علي الجليد.
    4. التضحية ب P2 الفئران الجرو عن طريق قطع الرؤوس. أزاله الجلد باستخدام زوج من المقص. بعد أزاله الجلد ، وقطع الجمجمة علي طول الخط الأوسط مع زوج من مقص غرامه.
    5. قم بازاله الجمجمة برفق بملقط ناعم. باستخدام ملعقة ، مغرفة بلطف الدماغ من الجزء السفلي من الجمجمة ونقل إلى غطاء لوحه ثقافة الانسجه المقلوبة.
    6. أزاله المخيخ وتقسيم المخ إلى نصفي الدماغ اثنين. أزاله المصابيح حاسة الشم ، الحصين ، والعقدة القاعدية تحت قشره الدماغ من كل نصف الكره الارضيه. ضع القشرة المخية في الطبق 100 مم الذي يحتوي علي HBSS. كرر الخطوات 3.3.4-3.3.6 للحيوانات المتبقية.
    7. العمل مع قشره واحده في كل مره ، وأزاله السحايا مع الملقط دومونت غرامه. ضع جميع الرؤوس الخالية من السحايا في اطباق جديده 60 مم مع HBSS.
    8. الزهر الانسجه القشرية في 1 مم3 قطع. مكان علي الجليد.
    9. ضع معايرتها Papain العازلة في أنبوب 15 مل. أضافه 200 وحدات من بابين و 2 ملغ L-السيستين. تصفيه تعقيم وأضافه 200 μL من DNase العقيمة انا.
    10. أزاله HBSS من انسجه المخ مكعبات واستبدال مع بابين العازلة من 3-3-2. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده 80 دقيقه ، وتهتز بلطف كل 15 دقيقه.
    11. نقل الانسجه المهضومة إلى أنبوب 50 mL وأضافه 2 مل من C-المتوسطة.
    12. تريلوريتي مع ماصه المصلية 5 مل لانفصال الانسجه. تسمح قطع أكبر من الانسجه لتسويه. أزاله سوبرناتانت ووضعها في أنبوب معقم 15 مل.
    13. أضافه 2 مل من C-متوسطه وتكرار تريلوريشن مع ماصه المصلية 5 مل مره أخرى. قم بالتبديل إلى طرف ماصه 1 مل والتريرات حتى يتم فصل النسيج تماما. نقل إلى أنبوب 15 مل.
    14. تدور الانسجه تريريتيد في 300 x ز لمده 15 دقيقه. أزاله ماده طافي بعناية وأعاده التعليق بيليه في 8 مل من dmem--ز المتوسطة.
    15. قبل الرطب مصفاه الخلية 30 μM معقمه مع 2 مل من العازلة PB. مكان مصفاه الخلية علي أنبوب 50 mL وتصفيه تعليق الخلية 1 مل في وقت واحد. شطف فلتر مع 5 مل من العازلة PB.
    16. نقل تعليق الخلية إلى لوحه البكتريولوجية مم 100 ؛ احتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه للسماح ميكروليا لنعلق.
    17. أزاله وسائل الاعلام ووضعها في أنبوب 15 مل. شطف لوحه بلطف مع 2 مل من DMEM-ل-ز المتوسطة ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    18. أعاده تعليق تعليق الخلية برفق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع مع 10 ميكرولتر من التريلون الأزرق. عد 10 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام عداد الخلية الألى أو الكريات الدموية.
    19. تدور تعليق الخلية في 300 x ز لمده 10 دقيقه.
    20. يستنشق ماده طافي تماما وأعاده التعليق الخلايا في 70 μl من PB العازلة لكل 1 × 107 الخلايا. تخلط جيدا واحتضان في 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
    21. أضافه 20 ميكرولتر من الخرز المضادة لA2B5 لكل 1 × 107 خلايا. تخلط جيدا واحتضان في 4 درجه مئوية.
    22. أضافه 1-2 mL من العازلة PB لكل 1 × 107 الخلايا وأجهزه الطرد المركزي في 300 x ز لمده 10 دقيقه في 4 درجه مئوية الطرد المركزي.
    23. الشفط الفائق تماما. أعاده تعليق ما يصل إلى إجمالي 108 خلايا في 500 μl من المخزن المؤقت PB. ابقي علي الثلج
    24. وضع عمود حبه المغناطيسي في المجال المغناطيسي للفاصل.
    25. اعداد العمود عن طريق الشطف مع 500 μL من المخزن المؤقت PB. تطبيق تعليق الخلية إلى العمود. تجاهل التدفق في حاويه نفايات (يحتوي هذا علي خلايا غير مسماه).
    26. اغسل العمود مع 500 μL من PB المخزن المؤقت 3 مرات. تجاهل التدفق من خلال.
    27. أزاله العمود من الفاصل المغناطيسي ووضع في أنبوب جمع.
    28. ماصه 1 مل من المخزن المؤقت PB إلى العمود. مسح الخلايا المسمية مغناطيسيا عن طريق دفع بحزم الغطاس في العمود.
    29. أضافه 4 مل من C-متوسطه إلى كسر الخلية وتدور في 300 x ز لمده 10 دقيقه.
    30. أزاله سوبرناتانت وأعاده التعليق في 5 مل من N2B2 المتوسطة. خذ 10 μL من تعليق الخلية وتمييع مع 10 μL من التريلون الأزرق. عد 10 μL من تعليق الخلية باستخدام عداد الخلية الألى أو مقياس الكريات الدموية.
    31. لوحه oligodendrocytes في تركيز الخلايا 150,000 لكل غرفه أيها تحتوي علي DRG مع axons الموسعة بالبالكامل.
    32. في اليوم التالي تغيير وسائل الاعلام في غرفه أيها إلى N2B2 للسماح للحصول علي النخاع. استبدل الوسائط كل 2-3 يوما. سيكتمل النخاع في 14 يوما.
    33. في اليوم 14 ، ثقافة البذور مع الأعصاب GBM كما هو الشان في 3.2.26-3.2.32. الحفاظ علي الثقافات النخاعية في N2B2 متوسطه لمده اي تجارب.
      ملاحظه: يتم تقديم البروتوكول كمخطط بياني انسيابي في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل دراسة تفاعل عارضه مع محاور ، ونحن ولدت محاور تنقيه drg كما سبق وصفها15،16،17،18. ثم تم بذر هذه المحاور المنقية drg مع عارضه ، التي شكلت gfap +/ki67 + الأورام مثل الهياكل المدمجة داخل الشبكة محاور ، في حين ان عارضه الفردية هاجرت اما في الجمعية أو بين محاور (الشكل 2). لتحديد كيف تتفاعل عارضه مع axons النخاع ، ونحن المصنفة الثقافات drg اكسون مع الفئران المنقية oligodendrocytes والتي يسببها النخاع كما سبق وصفها19،20،21. وأظهرت أضافه عارضه علي الثقافات المشتركة لل DRG-oligodendrocyte ان عارضه تهاجر بالاقتران مع المحاور النخاعية وبعيدا عن كتله الورم من خلال تشكيل الكاذبة كما هو مبين في ورقتنا الاخيره (الشكل 3)22. يمكن تحديد النخاع النخاعي اوليغوداندرونسيتي باستخدام البروتين الأساسي Myelin (MBP) تلطيخ الثقافات. لقياس هجره عارضه في هذه الثقافات قمنا بقياس المساحة الاجماليه للثقافة التي احتلتها عارضه المهاجرة باستخدام برنامج Image J22.

الاثنين الاربعاء الجمعه
اليوم الأول Nbf
الأسبوع الأول ملحوظه Nbf ملحوظه
الأسبوع الثاني Nbf ملحوظه ملحوظه
الأسبوع الثالث ملحوظه ملحوظه

الجدول 1: جدول تغذيه ثقافات DRG.

Figure 1
الشكل 1: ملخص تخطيطي للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عارضه تشكل هياكل شبيهه بالورم في الثقافة المشتركة مع axons DRG. وكانت الثقافة ثابته وملطخه لعلامات الورم gfap (الأحمر) و Ki67 (الأخضر) ، في حين كانت ملطخه محاور مع نيوروخيوط (الأزرق). شريط المقياس: 200 μm. وقد تم تعديل هذا الرقم من الورقة22التي نشرت مؤخرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عارضه الهجرة علي طول المسارات المحورية النخاعية. عارضه التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (gfp) الهجرة علي طول المسارات محواري النخاعي الملطخة باللون الأحمر ل mbp في نظام الثقافة hgc-drg-oligodendrocyte. شريط المقياس: 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن اجراء دراسات الهجرة لعارضه باستخدام أنظمه غرفه Boyden أو اختبارات الصفر. ومع ذلك ، في حين ان هذه التجارب تفشل في إعطاء اي معلومات بشان تفاعلات الخلايا السرطانية مع الانسجه المحيطة الأخرى ، يمكن للنظام الحالي تلخيص تفاعلات GC مع ألياف النخاعية وغير النخاعية. وعلاوة علي ذلك ، لدراسة تكوين الورم والهجرة نقطه النهاية ، والثقافات شريحة الشكل العضوي من الدماغ القوارض أو في غرس الجسم المجري من الخلايا الدمه في الدماغ القوارض أو الجناح قد استخدمت سابقا23،24،25. وقد استخدمت المزيد من الجهود الاخيره علي النمذجة ثلاثية الابعاد من خلايا الدروما أنظمه مثل طبقات الكولاجين26،27،28، السقالات القائمة علي astrocyte29،30، طبقات مصفوفة خارج الخلية31، الكهربائية ألياف النانو32، والهلام المائي33. وفي حين ان هذه التجارب تسفر عن نتائج مرضيه لنقطه النهاية فيما يتعلق بالهجرة ، فانها تفتقر إلى القدرة علي الدراسة في الوقت الحقيقي بواسطة المجهر العالي الاستبانة.

هنا ، لقد أظهرنا نهجا جديدا لدراسة هجره عارضه من خلال اعداد الثقافة المشتركة DRG في غرفه الايها. إذا كان الوصول إلى الانسجه GBM الطازجة متاح ، يمكن ان تكون معزولة عارضه ومثقف بشكل موثوق. علي الرغم من ان عارضه يستغرق وقتا طويلا لتشكيل المجالات العصبية في البداية ، والثقافات من السهل الحفاظ عليها والثقافة الفرعية مره واحده في شكل المجالات. لضمان نجاح ثقافة hGC ، يجب معالجه النسيج في أسرع وقت ممكن. وينبغي التقليل من الوقت بين الاستئصال والمعالجة بقدر الإمكان ، وينبغي دائما نقل العينات علي الجليد.

و drg هو أيضا من السهل عزل, يمتد محاور لها أطول من الخلايا العصبية القشرية ويمكن بسهوله النخاع في الثقافة مع oligodendrocytes. يتم استزراع الخلايا العصبية hGC أو عارضه المنفصلة في المقصورات البعيدة للغرف ، مما يسمح بالتصوير الخلوي الحي والتحديد الكمي الحقيقي للتفاعلات الخلوية مع ألياف النخاعية. بالاضافه إلى ذلك ، لا يقتصر هذا البروتوكول فقط علي الثقافات DRG ، كما الخلايا العصبية القشرية يمكن أيضا ان تكون معزولة والنخاع مع بعض التعديلات علي هذا البروتوكول. ويمكن أيضا استخدام هذا النموذج لدراسة اشكال أخرى من سرطان المخ.

في حين ان DRG هو بسيط نسبيا لعزل والحفاظ علي, أضافه غرفه أيها هو مضيعه للوقت ويخلق العديد من القيود التقنية التي تتطلب التدريب والممارسة للنجاح. حاسمه لنجاح هذا البروتوكول هو طلاء الكولاجين موحده والخدش من الاطباق الثقافية لان الكولاجين متفاوتة أو سميكه بشكل مفرط يميل إلى قشر. وينبغي أيضا توخي الحذر الشديد في حين وضع الشحوم سيليكون علي غرف أيها. إذا لم يتم استخدام الضغط حتى اثناء الاستغناء عن الشحوم سيليكون ، سيكون هناك ثغرات علي طول الجزء السفلي من غرفه أيها التي سوف تتطلب الختم مع الشحوم الزائدة لمنع تسرب وسائل الاعلام. بالاضافه إلى ذلك ، يجب استخدام الحد الأدنى من الضغط عند التمسك غرف أيها إلى الطابق الثقافة الطبق. إذا كانت محاور تفشل في العبور من المقصورة الوسطي بعد أسبوع واحد و drg تبدو صحية علي خلاف ذلك ، فمن المرجح انه تم تطبيق الكثير من الضغط عند وضع غرفه أيها أو كميه زائده من الشحوم تم استخدامها.

لم يتم وصف الهجرة hGC علي طول الأجزاء القابلة للنهي وغير النخاعية في الدماغ بشكل جيد بسبب عدم وجود نماذج الجسم السابق الفعالة والقابلة للتكرار. ونحن نقدم هنا وصفا لتطوير نظام الثقافة الحيوية السابقة المبتكرة لدراسة كيفيه هجره الخلايا الدبقي علي طول محاور و myelin ، عنصرا حاسما في تطوير العلاجات الجديدة التي تستهدف علي وجه التحديد هجره الخلايا السرطانية. نظام ثقافتنا هو تنوعا نظرا لوجود العزلة فلويديك بين المقصورات ، وتسهيل القدرة علي دراسة مختلف العلاجات الرواية أو تركيزات مختلفه من المواد التي تؤثر علي هجره الخلايا الدبقي. ميزه اضافيه لنظام الثقافة المشتركة لدينا هو القدرة علي مراقبه الهجرة hGC وأثار العلاجات المختلفة في الوقت الحقيقي. ويجري حاليا استخدام البروتوكول الموصوف هنا كاساس لتطوير نظم الجسم الحيوي السابقة ثلاثية الابعاد الأكثر تطورا باستخدام المكونات الخلوية البشرية حصرا التي يمكن استخدامها لتقييم السموم وفعالية الادويه الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل الصناديق الداخلية لقسم جراحه المخ والأعصاب ، جامعه براون إلى N.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 154 ، الخلايا الجذعية السرطانية ، الهجرة ، نموذج فيفو السابق ، الثقافة المشتركة ، axons DRG ، الميلين
في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter