Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Resumen

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Resumen

Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER), crean una red para realizar una variedad de funciones. Estas estructuras altamente curvadas se pliegan en varias formas para formar una red dinámica dependiendo de las condiciones celulares. La visualización de esta red entre las mitocondrias y la sala de res ha intentado utilizar imágenes de fluorescencia de superresolución y microscopía de luz; sin embargo, la resolución limitada es insuficiente para observar las membranas entre las mitocondrias y urgencia en detalle. La microscopía electrónica de transmisión proporciona un buen contraste de membrana y resolución a escala de nanómetros para la observación de orgánulos celulares; sin embargo, es excepcionalmente lento al evaluar la estructura tridimensional (3D) de los orgánulos altamente curvados. Por lo tanto, observamos la morfología de las mitocondrias y la ER a través de la microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM) y las técnicas de microscopía electrónica de volumen utilizando ascorbato peroxidasa 2 mejorado y tinción de peroxidasa de rábano picante. Se aplicó un método de tinción en bloque, seccionamiento en serie ultrafino (tomografía de matriz) y microscopía electrónica de volumen para observar la estructura 3D. En este protocolo, sugerimos una combinación de clem y microscopía electrónica 3D para realizar estudios estructurales detallados de las mitocondrias y la ER.

Introducción

Las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER) son orgánulos celulares ligados a la membrana. Su conexión es necesaria para su función, y las proteínas relacionadas con su red han sido descritas¹. La distancia entre las mitocondrias y la ER se ha notificado en aproximadamente 100 nm utilizando la microscopía de luz²; sin embargo, los recientes estudios de microscopía³ de superresolución y microscopía electrónica (EM)⁴ han revelado que es considerablemente más pequeño, de aproximadamente 10-25 nm. La resolución alcanzada en la microscopía de superresolución es inferior a....

Protocolo

1. Cultivo celular con plato de cultivo de rejilla estampado y transfección celular con vector de plásmido SCO1-APEX2 y HRP-KDEL

1. Semilla 1 x 10⁵ HEK293T células colocándolas en platos de cultivo con fondo de rejilla de vidrio de 35 mm en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO₂ a 37 oC en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco complementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/ml penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.
2. Al día siguiente de la sembración de las células, cuando han crecido a 50%-60% de confluencia, introducir el Plásmido SCO1-APEX2¹⁰ y HRP-KDEL¹² a las células utilizando reac....

Resultados

La figura 1 describe la programación y el flujo de trabajo de este protocolo. El protocolo requiere 7 días; sin embargo, dependiendo del tiempo dedicado a la toma de imágenes SEM, esto puede aumentar. Para la transfección celular, la confluencia de las celdas debe controlarse para no cubrir la parte inferior de toda la placa de rejilla (Figura1A). Una alta densidad celular podría impedir la identificación de la célula de interés durante el microscopio de luz y la observación EM. Utilizam.......

Discusión

Determinar la localización celular de proteínas específicas a una resolución de nanómetro utilizando EM es crucial para entender las funciones celulares de las proteínas. Generalmente, hay dos técnicas para estudiar la localización de una proteína diana a través de EM. Una es la técnica de inmunooro, que se ha utilizado en EM desde 1960, y la otra es una técnica que utiliza etiquetas genéticamente codificadas^{recientemente 16.} Las técnicas tradicionales de inmunooro han empleado partículas de oro c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glutaraldehído	EMS	16200	Uso solo en campana
Paraformaldehído	EMS	19210	Uso solo en campana
Cacodilato de sodio	EMS	12300
Tetróxido de osmio solución acuosa al 4 %	EMS	16320	Uso solo en campana extractora
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultramicrotomo Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Acetato de uranilo	EMS	22400	Producto químico peligroso
Citrato	de plomo EMS	17900
35mm Plato deslizante cuadriculado	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Descargador de incandescencia	Pelco	easiGlow
Formvar recubierto de carbono Rejilla	de cobreTed Pella	01805-F
Ácido clorhídrico	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidina (DAB)	SIGMA	D8001	Solución química peligrosa
de peróxido de hidrógeno al 30%	Merck	107210
Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato	SIGMA	P3289
0,22 mmm filtro de jeringa	Sartorius	16534
Tiocarbonildihidrazida	SIGMA	223220	Úselo solo en campana extractora
Hidróxido de potasio	Fluka	10193426
Ácido L-aspártico	SIGMA	A9256
Etanol	Merck	100983
Microscopía electrónica de transmisión	FEI	Tecnai G2
Cubreobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño (ITO)	SPI	06489-AB	vidrio frágil
Isopropanol	Fisher Bioreactivos	BP2618-1
Cuchillo de diamante	Leica	AT-4
Microscopía óptica invetada	Nikon	ECLipse TS100
Microscopía electrónica de barrido	Zeiss	Auriga

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