Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

Resumen

Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.

Resumen

La necrosis de las fibras musculares (mionecrosis) desempeña un papel central en la patogénesis de varias afecciones musculares, incluyendo distrofias musculares. Se espera que las opciones terapéuticas que abordan las causas de la patogénesis de la distrofia muscular alivien la degeneración muscular. Por lo tanto, se necesita un método para determinar y cuantificar el alcance de la muerte celular en las biopsias musculares. Los métodos convencionales para observar la degeneración de la miofibra in situ son poco cuantitativos o dependen de la inyección de distos vitales. En este artículo, se describe un protocolo de inmunofluorescencia que mancha las miofibers necróticas al atacar la admisa de inmunoglobulina G (IgG) por miofibers. El método de admisión de IgG se basa en características celulares que caracterizan la muerte necrótica, incluyendo 1) la pérdida de integridad de la membrana plasmática con la liberación de patrones moleculares asociados al daño y 2) la adopción de proteínas plasmáticas. En las secciones transversales murinas, el co-inmunoetiquetado de miofibers, proteínas de matriz extracelular e IgG de ratón permite una identificación limpia y directa de las miofibers con el destino necrótico. Este método simple es adecuado para el análisis cuantitativo y aplicable a todas las especies, incluidas las muestras humanas, y no requiere la inyección de tinte vital. La tinción de miofibers necróticas por la suación de IgG también se puede emparejar con otro co-inmunoetiquetado.

Introducción

El músculo esquelético estriado consiste principalmente en fibras musculares (miofibers), que son responsables de la característica función contráctile voluntaria. Estas células son estructuras multinucleadas y postmitoticas que soportan el estrés mecánico que ocurre durante la contracción. La estabilidad estructural de la membrana de la miofiber (sarcolemma) y su matriz extracelular son cruciales para la homeostasis tisular. Las células satélite comprenden la población principal de progenitores musculares en el músculo esquelético maduro y existen en un estado de reposo en músculos sanos. Después de la muerte de la miofibra, la regeneración muscular es apoyada por cé....

Protocolo

Los experimentos se realizaron de conformidad con la legislación francesa y comunitaria (número de licencia 11-00010).

1. Preparación de las encías tragacanth

1. En un vaso de precipitados de vidrio, disolver 6 g de polvo de tragacanth en 100 ml de agua desionizada. Cubrir con papel de aluminio y dejar durante al menos 3 h. Revuelva ocasionalmente manualmente con una espátula metálica a medida que la mezcla se vuelve rápidamente viscosa.
2. Dejar la mezcla de tragacanto a 60oC durante la noche en un baño de agua o en el horno. Selle cuidadosamente el vaso de precipitados para evitar el secado. Revuelva al menos una vez antes d....

Resultados

Las miofibers están rodeadas por una matriz extracelular que contiene laminina. La tinción roja delimita la periferia de miofibras y permite su identificación. IgG se muestra en verde. Los núcleos se tiñen con DAPI y se encuentran en azul bajo el microscopio. Sin embargo, los núcleos se muestran en blanco aquí (Figura 1). Se espera una inmunoreactividad IgG débil en el compartimento extracelular, que puede aumentarse en caso de inflamación. La tinción verde d.......

Discusión

La necrosis de miofibra es una consecuencia común del ejercicio traumático en los músculos normales. Está bien compensado por una poderosa capacidad regenerativa de los progenitores musculares locales. Sin embargo, en varias condiciones musculares como en los D, la capacidad regenerativa de las células satélite se ve comprometida por la mionecrosis crónica y la fibrosis excesiva. Los hallazgos recientes muestran que las fibras musculares pueden morir por necroptosis, una forma regulada de necrosis. Más específicamente, l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos circulares de corcho	Pyramid Innovation	R30001-E	No olvide etiquetar claramente el corcho para que se pueda determinar el ID de la muestra después de la congelación
Criostato	Leica	CM3050 sn34	La criosección muscular debe realizarse entre -20 y -25 °C. Espesor: 7-10 micrómetros.
Dakopen	Dako	S2002	Una barrera hidrofóbica alrededor de las secciones musculares. Evita la dispersión del medio durante la incubación
Pinzas	FST	91117-10	/
Anticuerpo anti-Mouse IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilución: 1/500
Anticuerpo IgG (H+L) anti-Conejo de cabra Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilución: 1/500
Suero de cabra	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	En el paso de bloqueo, use una dilución del 10% en PBS. Para la incubación de anticuerpos, utilice una dilución al 5% en medio de
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	. Debe enfriarse en un vaso de precipitados colocado en nitrógeno líquido.
Ratón mdx	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Los ratones Mdx están mutados para el gen de la distrofina. A partir de las tres semanas de edad, los músculos se caracterizan por una degeneración crónica
Microscopio	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Matriz de inclusión
PFA (Paraformaldehído)	ThermoFischer Scientific	28908	Se utiliza para la fijación de la criosección (se puede utilizar PFA al 2% o al 4%)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01 Medio de	dilución para inmunomarcaje
Tijeras de precisión	FST	fst 14001-12 y fst 14001-14	Utilizadas para la recolección de músculo
Anticuerpo de conejo contra la pan-Laminina de ratón	Sigma Aldrich	L9393	Dilución: 1/1000
Tragacanto	Sigma Aldrich	G1128	Alícuotas para mantener a +4° C

congelación PBS