Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Resumen

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Resumen

Este manuscrito describe un ensayo de incubación de monedas basado en el cultivo para detectar y caracterizar interacciones competitivas entre dos poblaciones bacterianas. Este método emplea plásmidos estables que permiten que cada población sea etiquetada diferencialmente con distintas capacidades de resistencia a los antibióticos y proteínas fluorescentes para la selección y discriminación visual de cada población, respectivamente. Aquí, describimos la preparación y la incubación de monedas de cepas Vibrio fischeri competidores, imágenes por microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de datos. Este enfoque es simple, produce resultados rápidos y se puede utilizar para determinar si una población mata o inhibe el crecimiento de otra población, y si la competencia se media a través de una molécula difusible o requiere contacto directo con células celulares. Debido a que cada población bacteriana expresa una proteína fluorescente diferente, el ensayo permite la discriminación espacial de las poblaciones competidoras dentro de una colonia mixta. Aunque los métodos descritos se realizan con la bacteria simbiótica V. fischeri utilizando condiciones optimizadas para esta especie, el protocolo se puede adaptar para la mayoría de los aislados bacterianos culturables.

Introducción

Este manuscrito describe un método basado en el cultivo para determinar si dos aislados bacterianos son capaces de interacciones competitivas. Al estudiar poblaciones mixtas, es importante evaluar en qué medida interactúan los aislados bacterianos, particularmente si los aislados compiten directamente a través de mecanismos de interferencia. La competencia de interferenciase se refiere a las interacciones en las que una población inhibe directamente el crecimiento o mata a una población competidora¹. Estas interacciones son importantes de identificar porque pueden tener efectos profundos en la estructura y función^deuna c....

Protocolo

1. Preparar cepas para la incubación de monedas

1. Elija una cepa de referencia adecuada que sirva como objetivo para la competencia bacteriana durante el ensayo de incubación de monedas. Consulte Discusión para conocer las prácticas recomendadas al seleccionar una deformación unitaria de referencia y cómo afectará la deformación unitaria de referencia a los resultados. En este protocolo, la cepa V. fischeri ES114 servirá como cepa de referencia.
2. Determinar qué métodos de selección y cribado se utilizarán para distinguir entre los aislados en la incubación de monedas
   1. Típicamente, transforme cepas c....

Resultados

Con el fin de evaluar las interacciones competitivas entre las poblaciones bacterianas, se desarrolló y optimizó un protocolo de ensayo de acuñación de monedas para V. fischeri. Este método utiliza plásmidos estables que codifican genes de resistencia a antibióticos y proteínas fluorescentes, lo que permite la selección diferencial y la discriminación visual de cada cepa. Mediante el análisis de los datos recogidos del ensayo de incubación de monedas, se puede identificar el resu.......

Discusión

El ensayo de incubación de monedas descrito anteriormente proporciona un método potente para descubrir la competencia interbacteriana. Este enfoque permitió la identificación de la competencia intraespecífica entre los aislados v. fischeri y la caracterización del mecanismo competitivo¹⁹. Aunque el método descrito fue optimizado para la bacteria marina V. fischeri, se puede modificar fácilmente para adaptarse a otras especies bacterianas, incluyendo aislados clínicos y ambientale.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher	05-408-129
10 μ L pipeta
100 μ L pipeta
300 μ L pipeta
10 μ L pipeta
20 μ L pipeta
200 μ L pipeta
1.000 μ L pipeta
placas de 24 pocillos	Fisher	07-200-84	estéril con tapa
placas de 96 pocillos	VWR	10062-900	estéril con tapa
Calculadora
Cloranfenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL en etanol); concentración final en medios (2 μ g/mL LBS)
Microscopio de disección de fluorescencia con cámara y software
Pinzas	Fisher	08-880
Sulfato de kanamicina	Fisher	BP906-5	caldo (100 mg/mL en agua, esterilizante por filtro); concentración final en medios (1 μ g/mL LBS)
Membrana de nitrocelulosa (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0.22 μ membrana de nitrocelulosa (paquete de 100)Placas de
Petri	Fisher	FB0875713	estéril con tapa
Espectrofotómetro
Semi-micro cubetas	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μ L sistema de arranque	USA Scientific	1111-3500	10 bastidores
TipOne 200 μ L sistema de arranque	USA Scientific	1111-500	10 bastidores
TipOne 1000 μ Sistema de arranque L	USA Scientific	1111-2520	10 bastidores
Vortex
Name	Company	>Número de catálogo	>Comments
>LBS media
1 M Tampón Tris (pH ~7.5)			50 mL 1 M de tampón de caldo (62 mL de HCl, 938 mL de agua desionizada, 121 g de base de Trizma)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Añadir solo para placas)
Agua			950 mL
Cloruro de sodio	Fisher	S640-3	20 g
Triptona	Fisher	BP97265	10 g
Extracto de levadura	Fisher	BP9727-2	5 g

multicanalmulticanalmulticanalmonocanalmonocanalmonocanalmonocanalde imagen desionizada