Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

Resumen

Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Resumen

Además de los ARNm lineales, muchos genes eucariotas generan ARN circulares. La mayoría de los ARN circulares se generan uniendo un sitio de empalme de 5' con un sitio de empalme ascendente de 3' dentro de un pre-mRNA, un proceso llamado back-splicing. Esta circularización es probablemente ayudada por estructuras secundarias en el pre-mRNA que acercan los sitios de empalme. En los genes humanos, se piensa que los elementos Alu promueven estas estructuras secundarias de ARN, ya que los elementos Alu son abundantes y exhiben complementariedades de base entre sí cuando están presentes en direcciones opuestas en el pre-ARNm. Aquí, describimos la generación y el análisis de grandes elementos Alu que contienen genes de reportero que forman ARN circulares. A través de la optimización de los protocolos de clonación, se pueden generar genes de reportero con una longitud de inserción de hasta 20 kb. Su análisis en experimentos de co-transfección permite la identificación de factores regulatorios. Por lo tanto, este método puede identificar secuencias de ARN y componentes celulares involucrados en la formación de ARN circular.

Introducción

RNA circulares
Los ARN circulares (arnar circ) se cierran covalentemente en ARN de una sola trenza que se expresan en la mayoría de los organismos. Se generan uniendo un sitio de empalme descendente de 5' a un sitio de empalme ascendente de 3', un proceso llamado back-splicing(Figura 1A)¹. Las secuencias en el pre-mRNA que exhiben base complementaria tan corta como 30-40 nt llevan los sitios de empalme hacia atrás en la alineación adecuada para la formación de ARN circn.². En los seres humanos, los elementos Alu ¹, que rep....

Protocolo

1. Diseño de las construcciones

1. Utilice el navegador del genoma^{CPSC 24} para identificar los elementos repetitivos necesarios para la formación de ARN circular e incorporarlos en las construcciones. Es importante destacar que las imprimaciones para amplificación deben estar fuera de los elementos repetitivos.
2. Pegue la secuencia de ARN circular(Figura suplementaria 1 es una secuencia de prueba) en https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start y seleccione el organismo adecuado. Envíe la secuencia y vaya a la vista del nav....

Resultados

Los genes reporteros permiten determinar factores reguladores que influyen en la formación circular de ARN. Sin embargo, estos genes reporteros son grandes y contienen elementos repetitivos que a menudo hacen que las construcciones de ADN sean inestables. Debido a su gran tamaño, a menudo es necesario eliminar partes de los intrones, lo que se logra mediante la amplificación de piezas genómicas que contienen los exons y partes intrónicas de flanqueo más pequeñas. Estas piezas de ADN se ensamblan enzimáticamente, permitie.......

Discusión

En general, los ARN circulares son de bajo abundante¹, lo que complica el estudio de su función y formación. Al igual que los ARN lineales^13,el uso de minigenes de reportero permite la identificación de cis y factores de acción trans que regulan la formación de ARN circulares. Por lo tanto, este enfoque genera hipótesis que se pueden probar aún más utilizando los genes endógenos.

El paso más crítico es el diseño del gen reportero. El conjunto enz.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(PEI) Clorhidrato	Polysciences	24765-1
	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.	Clare Chemical Research
Kit de montaje de ADN enzimático	NEB	E2621S
limpieza de gel y PCR	Promega	A9282
Glyco Blue	Thermo Fisher	AM9516
pcDNA3.1 sitio de clonación	Sitio de		policlonaciónhttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polimerasa 1	NEB	M0491L	Q5 ADN polimerasa
2	Biorad	1725310	polimerasa de largo alcance (NEB), iproof (BioRad)
Polimerasa 2	Qiagen	206402	Kit de polimerasa de largo alcance Qiagen
Transcriptasa inversa	Thermo Fisher	18080044
kit de aislamiento de ARN	Life Technologies	12183025	Ambion de Life Technologies
RNAse R	Lucigen	RNR07250	Epicenter/Lucigen
Células competentes estables	NEB	C3040H	Células estables NEB
Clonación estándar	NEB	C2988J	NEB5-alpha Herramienta
web competente para diseñar cebadores	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Cálculos de temperatura basados en la web	NEB		https://tmcalculator.neb.com/#!/main

Herramienta constructora Kit de