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Artículo de método

Tomografía fotoacústica de escritorio basada en diodos láser pulsada para monitoreo de lavado y lavado de tinte en rata cortical vasculatura

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DOI:

10.3791/59764

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30 de mayo de 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

En este artículo

Resumen

Se ha demostrado un sistema compacto de tomografía fotoacústica de sobremesa (PLD-PAT) basado en diodos láser pulsado para obtener imágenes dinámicas in vivo de alta velocidad de la vasculatura cortical de animales pequeños.

Resumen

Las imágenes por tomografía fotoacústica (PA) son una modalidad de imagen biomédica emergente útil en diversas aplicaciones preclínicos y clínicas. Los transductores circulares basados en matrices de anillo circular y los láseres de gran volumen convencionales Nd: YAG/OPO inhiben la traducción del sistema PAT a las clínicas. Los diodos láser pulsados ultracompactos (PLDs) se están utilizando actualmente como una fuente alternativa de excitación de infrarrojo cercano para imágenes de PA. La imagen dinámica in vivo de alta velocidad se ha demostrado utilizando un sistema de sobremesa PAT compacto basado en PLD (PLD-PAT). Un protocolo experimental visualizado utilizando el sistema de sobremesa PLD-PAT se proporciona en este trabajo para imágenes cerebrales dinámicas in vivo. El protocolo describe la configuración del sistema PLD-PAT de sobremesa, la preparación de animales para la imagen vascular cerebral y el procedimiento para la visualización dinámica de la captación y el proceso de aclaramiento de verde indoyanino (ICG) en la vasculatura cortical de rata.

Introducción

La tomografía computarizada fotoacústica (PACT/PAT) es una prometedora modalidad de imagen biomédica no invasiva que combina un rico contraste óptico con una alta resolución de ultrasonidos1,2,3,4, 5. cuando un láser pulsado nanosegundo deposita energía en los cromóforos que absorben la luz presentes dentro de cualquier tejido biológico, los aumentos de temperatura locales conducen a la expansión y contracción termoelástica del tejido, lo que resulta en la generación de ondas de presión. Estas ondas de presión se conocen como ondas de ultrasonido o ondas fotoacústicas (PA), que se pueden detectar mediante transductores de ultrasonido alrededor de la muestra. Las señales PA detectadas se reconstruyen utilizando varios algoritmos de reconstrucción6,7,8,9 para generar imágenes de PA de sección transversal. La imagen de PA proporciona información estructural y funcional de órganos macroscópicos a orgánulos microscópicos debido a la dependencia de la longitud de onda de los cromos endógenos presentes en el interior del cuerpo10. La toma de imágenes PAT se ha utilizado con éxito para la detección de cáncer de mama1, diagnóstico de ganglios linfáticos centinela11, mapeo de oxihemoglobina (HbO2), desoxihemoglobina (HBR), concentración total de hemoglobina (HBT), saturación de oxígeno (SO 2) 12 , 13, angiogénesis tumoral14, imagen del cuerpo entero de un animal pequeño15, y otras aplicaciones.

Los láseres Nd: YAG/OPO son fuentes de excitación convencionales para sistemas PAT de primera generación que son ampliamente utilizados en la comunidad fotoacústica para imágenes de animales pequeños y imágenes de tejidos profundos16. Estos láseres proporcionan ~ 100 mJ pulsos de energía a bajas tasas de repetición de ~ 10-100 Hz. Los sistemas de imágenes PAT que utilizan estos láseres costosos y voluminosos no son adecuados para imágenes de alta velocidad con transductores de ultrasonido de un solo elemento (SUTs), debido a la tasa de repetición de pulso limitada. Esto inhibe la monitorización en tiempo real de los cambios fisiológicos que ocurren a altas velocidades dentro del animal. Utilizando transductores basados en arreglos de discos como matrices lineales, semicirculares, circulares y volumétricas con excitación láser Nd: YAG, es posible la creación de imágenes de alta velocidad. Sin embargo, estos transductores de matriz son caros y proporcionan sensibilidades más bajas en comparación con los SUTs; sin embargo, la velocidad de imagen está limitada por la baja tasa de repetición del láser. Los sistemas PACT de impulso único de vanguardia con transductor de matriz de anillo completo personalizado obtienen los datos de PA a una velocidad de fotogramas de 50 Hz17. Estos transductores de matriz necesitan dispositivos electrónicos de recepción de back-end complejos y amplificadores de señal, lo que hace que el sistema general sea más costoso y difícil para el uso clínico.

Su tamaño compacto, requisitos de menor costo y mayor tasa de repetición de pulsos (orden de KHz) hacen que los diodos láser pulsados (PLDs) sean más prometedores para la creación de imágenes en tiempo real. Debido a estas ventajas, los PLD se utilizan activamente como fuente de excitación alternativa en sistemas PAT de segunda generación. Los sistemas Pat basados en PLD se han demostrado con éxito para imágenes de alta velocidad de fotogramas utilizando transductores de matriz18, imágenes de tejido profundo y de cerebro19,20,21, diagnóstico de enfermedades cardiovasculares22 , y el diagnóstico de Reumatología23. Como los SUTs son altamente sensibles y menos costosos en comparación con los transductores de matriz, todavía se utilizan extensivamente para la toma de imágenes PAT. Se ha demostrado el sistema PLD basado en fibra para imágenes fantasma24. Un sistema portátil PLD-PAT se ha demostrado previamente mediante el montaje del PLD dentro del escáner PAT25. Con un escáner circular SUT, la imagen fantasma se realizó durante 3 s de tiempo de escaneo, y la imagen del cerebro de rata in vivo se realizó durante un período de 5 s usando este sistema PLD-PAT19.

Además, se han realizado mejoras en este sistema PLD-Pat para hacerla más compacta y crear un modelo de escritorio utilizando ocho transductores de ultrasonido de un solo elemento basados en Reflector acústico (SUTRS)26,27. Aquí, los SUTs fueron colocados en una dirección vertical en lugar de horizontal con la ayuda de un reflector acústico de 90° 28. Este sistema se puede emplear para tiempos de escaneo de hasta 0,5 s y ~ 3 cm de profundidad en imágenes de tejidos e imágenes cerebrales de animales pequeños in vivo. En este trabajo, este sistema de sobremesa PLD-Pat se utiliza para proporcionar la demostración visual de los experimentos para la imagen cerebral in vivo en animales pequeños y para la visualización dinámica de la captación y el proceso de despacho de la administración de alimentos y medicamentos (FDA)-indocianina aprobado tinte verde (ICG) en cerebros de rata.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur (número de protocolo animal, ARF-SBS/NIE-A0331).

1. Descripción del sistema

  1. Monte el láser PLD en el escáner circular y Monte el difusor óptico (OD) delante de la ventana de salida PLD para que el haz de salida sea homogéneo, como se muestra en la figura 1A. Conecte el PLD a la unidad de controlador láser (LDU).
    Nota: el PLD genera pulsos de longitud de onda de ~ 816 nm, pulsos de ~ 107 NS en duración, y hasta una velocidad de repetición de 2 KHz con una energía de pulso máxima de ~ 3,4 mJ. El LDU consiste en enfriador, fuente de alimentación de 12 V, fuente de alimentación variable de alto voltaje para controlar la potencia del láser, y el generador de funciones para cambiar la tasa de repetición de pulso.
  2. Monte los ocho SUTRs en cada soporte SUTR uno por uno de tal manera que la superficie de cada Reflector acústico se enfrente al centro del área de escaneo, como se muestra en la figura 1B. Conecte cada cable SUTR al amplificador de señal de bajo ruido con la ayuda de cables de conexión.
    Nota: la frecuencia central del transductor de ultrasonido es de 5 MHz y tiene un área activa de 13 mm de diámetro. Dos amplificadores cada uno de 24 dB de ganancia están conectados en serie para cada canal.
  3. Encienda la fuente de alimentación del enfriador y, a continuación, encienda el interruptor del enfriador para ajustar la temperatura entre 20 ° c y 25 ° c.
  4. Encienda el suministro de la fuente de alimentación de baja tensión y gire lentamente el control actual para establecer el límite de corriente en 0,3 a. Fije la tensión a 12 V. Verifique que la corriente no exceda de 0,1 A.
  5. Encienda el suministro de la fuente de alimentación de alta tensión. Pulse el botón "PRESET" y ajuste la corriente a 1 a y el voltaje a 0 V. Habilite el botón "salida": 0 V/0 A.
  6. Encienda la fuente de alimentación del generador de funciones. Presione el botón "Recall" y elija una configuración de 2 KHz para generar los pulsos de láser a esta velocidad de repetición.
  7. Coloque el tanque de acrílico dentro del escáner como se muestra en la figura 1A y llene el tanque con agua de tal manera que la superficie de detección de los SUTRS se sumerja completamente dentro del agua.
  8. Asegúrese de que todos los SUTRs que detectan superficies están dentro del medio de agua. Encienda la fuente de alimentación del amplificador de señal de bajo ruido.

2. preparación de animales para la imagen del cerebro de rata

Nota: se utilizaron ratas hembra sanas (ver tabla de materiales) para demostrar el sistema de sobremesa PLD-Pat descrito anteriormente para la creación de imágenes de la vasculatura cortical de animales pequeños.

  1. Sostenga al animal en su espalda al detener el movimiento de la cabeza y el cuerpo. Anestesiar el animal mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 2 mL de ketamina (100 mg/mL), 2 mL de xilazina (20 mg/mL) y 1 mL de solución salina (dosis de 0,2 mL/100 g).
    Nota: después de la inyección, el dedo del pie del animal es pellizcado para probar cualquier reflejo positivo como movimientos de la pierna o del cuerpo, vocalización, o aumentos marcados en las respiraciones. La ausencia de tales acciones reflejas confirma la anestesitización exitosa del animal.
  2. Para prevenir la sequedad debida a la anestesia y a la iluminación láser, aplicar con mucho cuidado ungüento de lágrima artificial a los ojos de rata. Coloca el animal en posición propensa en el Banco de trabajo y retira el pelaje del cuero cabelludo del animal usando una podadora y aplica suavemente la crema de depilación al área afeitada y retira la piel por completo.
    1. Después de 4 – 5 min, retire la crema aplicada usando un hisopo de algodón.
  3. Monte el soporte de animal hecho a medida (ver tabla de materiales) equipado con una mascarilla respiratoria (ver tabla de materiales) en un conector de laboratorio.
  4. Colocar el animal en posición propensa en el soporte para que la cabeza se apoye en la plataforma horizontal del soporte. Utilice cinta quirúrgica para sujetar el animal al soporte.
  5. Asegúrese de que la mascarilla cubra la nariz y la boca de la rata para suministrar la mezcla de anestesia. La mascarilla de respiración se personaliza para adaptarse a la ventana de imágenes. 10% del cono de nariz comercialmente disponible se corta y luego se conecta a un pedazo de guante.
  6. Conecte la mascarilla de respiración a la máquina de anestesia antes de encenditarla.
  7. Encienda la máquina de anestesia y establezca para entregar la mezcla anestésica que contiene 1,0 L/min de oxígeno con 0,75% isoflurano a la mascarilla de respiración animal.
    1. Sujete el oxímetro de pulso a una de las patas traseras del animal para monitorear su condición fisiológica.
  8. Aplique una capa de gel de ultrasonido incoloro al cuero cabelludo de la rata utilizando un aplicador con punta de algodón. Ajuste la posición del conector de laboratorio al centro del escáner y ajuste la altura del conector de laboratorio manualmente para que el plano de imagen se sitúe en el centro del reflector acústico.

3. imágenes dinámicas in vivo del proceso de captación y despacho de ICG en el cerebro de rata

  1. Fije los parámetros en el software de adquisición de datos (ver tabla de materiales) para un escaneo de adquisición de 360 °.
  2. Encienda la emisión láser PLD habilitando la salida del generador de funciones (se iniciará la emisión láser). A continuación, aumente lentamente el voltaje de la fuente de alimentación variable de alta tensión a 120 V para obtener la máxima energía por pulso.
  3. Ejecute el programa de adquisición de datos (consulte la tabla de materiales) para rotar los ocho SUTRS en 360 ° durante un tiempo de escaneo de 4 s.
    Nota: por ejemplo, si los SUTRs se giran para 4S, el PLD ofrece pulsos 8.000 (= 4 x 2.000) y cada SUTR recopila 8000 líneas A. Estas 8.000 a-Lines se reducen a 400 promediando más de 20 señales (después de promediar a-Lines = 8000/20 = 400). Un programa de reconstrucción basado en el algoritmo de retroproyección de retardo y suma se utiliza para averiguar el radio de escaneo de cada SUTR.
  4. Desactive la salida del generador de funciones para apagar la emisión del láser.
  5. Utilizando el algoritmo de reconstrucción en el software de procesamiento de datos (ver tabla de materiales) averiguar el radio de escaneo de los ocho SUTRS por ensayo y error, utilizando el algoritmo de retroproyección.
  6. Fije los parámetros en el software de adquisición de datos (ver tabla de materiales) para la adquisición de 45 ° durante un tiempo de escaneo de 0,5 s.
    Nota: por ejemplo, si los SUTRs se giran para 0.5 s, el PLD ofrece pulsos 1.000 (= 0,5 x 2.000) y cada SUTR recopila 1000 líneas A. Estas 1.000 a-Lines se reducen a 400 promediando más de 20 señales (después de promediar a-Lines = 1000/20 = 50).
  7. Habilite la salida del generador de funciones para encender la emisión del láser.
  8. Ejecute el programa de adquisición de datos (ver tabla de materiales) para rotar los ocho SUTRS en 45 ° para obtener los datos de control iniciales antes de administrar ICG.
  9. Desactive la salida del generador de funciones para apagar la emisión del láser.
  10. Identificar la vena de cola del animal e inyectar 0,3 mL de ICG (ver tabla de materiales) (323 μm) en la vena de la cola de la rata.

4.

Nota: 1,25 mg de ICG en polvo se pesó con una máquina de micropesaje y se mezcló con 5 mL de agua destilada para obtener una concentración de 323 μM para la solución de ICG.

  1. Habilite la salida del generador de funciones para encender la emisión del láser.
  2. Ejecute el programa de adquisición de datos (ver tabla de materiales) para adquirir líneas a sobre un tiempo de escaneo de 0,5 s en rotación de 45 °.

5.

Nota: las líneas a adquiridas durante un tiempo de escaneo de 0,5 s se utilizan para generar una imagen de sección transversal. Hay un intervalo de tiempo de ~ 0.4 – 0.6 s entre cada escaneo.

  1. Una vez finalizada la adquisición de datos, utilizando el algoritmo de retroproyección en el software de procesamiento de datos (consulte tabla de materiales), reconstruya la imagen del cerebro de sección transversal de las líneas a guardadas.
  2. Apague el láser y luego apague la máquina de anestesia, baje el conector de laboratorio y retire el animal del escenario. Devuelva el animal a la jaula y monitoree hasta que recupere la consciencia.

figure-protocol-1
Figura 1: esquema del sistema PLD-Pat de escritorio. (A) esquema del escritorio PLD-Pat configurado. PLD: diodo láser pulsado, OD: difusor óptico, SUTR: transductor de ultrasonido de un solo elemento basado en Reflector acústico, AM: máquina de anestesia, CSP: placa de escaneo circular, SM: motor de paso, LDU: unidad de conducción láser, AMP: amplificador, DAQ: tarjeta de adquisición de datos. (B) disposición circular de ocho SUTRS alrededor del centro de escaneo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La potencialidad del sistema de sobremesa PLD-PAT descrito para la imagen cerebral dinámica in vivo ha sido exhibida en este protocolo con los resultados correspondientes. La capacidad de imagen de alta velocidad del sistema de sobremesa PLD-PAT se demostró mediante la realización de imágenes cerebrales in vivo de ratas hembra sanas. Las señales PA fueron recolectadas usando ocho SUTRs girando en 360 ° y 45 ° alrededor del cerebro de la rata a velocidades de escaneo de 4 s y 0,5 s, respec...

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Discusión

Este trabajo presenta un protocolo para utilizar un sistema de sobremesa PLD-PAT para realizar experimentos en animales pequeños como ratas para imágenes cerebrales in vivo y proceso dinámico de captación y despacho de agentes de contraste como ICG. Los costosos y voluminosos sistemas OPO-PAT toman varios minutos (2-5 min) para adquirir una sola imagen transversal in vivo. Un sistema portátil PLD-PAT compacto, de bajo costo y de primera generación, proporciona imágenes de una sola sección transversal in vivo en 5 s. Por ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros relevantes o posibles conflictos de interés para revelar.

Agradecimientos

La investigación está respaldada por el Consejo Nacional de investigación médica del Ministerio de salud de Singapur (NMRC/OFIRG/0,005/2016: M4062012). A los autores les gustaría agradecer al Sr. Chow WAI Hoong Bobby por el apoyo de la tienda de máquinas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fuente de alimentación de 12 VVoltcraftPPS-11810Para suministrar voltaje de funcionamiento para PLD
Reflector acústicoOlympusF102Reflector de 45 grados aumentado al transductor de ultrasonidos
Tanque de agua acrílicaTaller NTU HechomedidaSe utiliza para retener agua que actúa como medio de acoplamiento acústico entre el cerebro del animal y el detector
MáquinaanestésicaMáquina de anestesia sin reinhalación Medical plus pte ltd con concentrador de oxígeno.Suministra oxígeno e isoflurano a los animales
Distribuidor de animalesIn Vivos Pte Ltd, SingapurDistribuidor de animales que suministra animales pequeños con fines de investigación
Taller de soporte para animalesNTU Hechoa medidaSe utiliza para sujetar al animal en su abdomen
Máscara de respiraciónTaller de NTUHecho a medidaSe utiliza junto con el soporte para animales para suministrar la mezcla de anestesia al animal
Escáner circularTallerde NTUEl escáner hecho a medidaestá hecho de aluminio
DAQ (adquisición de datos)EspectroM2i.4932-exp16 bits, 30 Ms/s, 8 canales, 1 Gs,
National Instruments Corporation, Austin, TX, EE. UU.)NI LabVIEW 2015 SP1 (32 bits)Programa basado en LabVIEW desarrollado en nuestro laboratorio para controlar el motor paso a paso y adquirir los sencillos de PA del detector
Procesamiento de datos softwareMatlab (Mathworks, Natick, MA, USA)Matlab R2015bCódigo Matlab desarrollado en nuestro laboratorio para la reconstrucción de imágenes transversales de PA
Generador de funcionesRIGOLDG1022Para cambiar la tasa de repetición del PLD. Proporcionará una señal TTL para sincronizar el DAQ con la excitación del láser.
Amplificador de señal de bajo ruidoGenetronHecho a medida mediante minicircuitos, ZFL-500LN-BNCPara recibir y amplificar la señal de PA de SUTR. Su ganancia es de 24 dB.
Difusor ópticoThorlabsDG-120Se utiliza para hacer que el rayo láser sea homogéneo
Diodo láser pulsadoQuantel, FranciaQD-Q1924-OIT-WATEREs la fuente láser de excitación con especificaciones de longitud de onda de 816 nm, 3,4 mJ por energía de pulso, ancho de pulso de 107 ns, tasa máxima de repetición de pulso de 2 KHz, dimensiones: 13.0 x 7.6 x 5.0 cm
RatasIn Vivos Pte Ltd, SingapurNTac: SD, Sprague Dawley / SDMujer, peso 100 y más; 10 g, cepa de ratas: Sprague Dawley, edad: 4-5 semanas
Motor paso a paso con caja de cambiosLIN Engineering (Servo Dynamics)Motor: CO-5718L-01P-RO, Caja de cambios: DPL64/1; Fuente de alimentación PW-100-24Para mover el soporte del detector en una geometría circular. Par de apriete: 2,08 N-m, Inercia del rotor: 2,6 kg-cm2
Gel de ultrasonidosProgress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000Gel de ultrasonidos transparente
Transductor de ultrasonidosOlympusV309-SU/ U8423013Sensores ultrasónicos utilizados para la detección fotoacústica. Frecuencia central 5 MHz, 0,5 in
Fuente de alimentación variable de alta tensiónElektro-AutomatikEA-PS 8160-04 TPara cambiar la potencia de salida del láser
a de tarjeta software de adquisición de datos PCIe

Referencias

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