Describimos el uso de ultrasonidos de alta frecuencia con imágenes de contraste como un método para medir el volumen de la vejiga, el grosor de la pared de la vejiga, la velocidad de la orina, el volumen del vacío, la duración del vacío y el diámetro uretral. Esta estrategia se puede utilizar para evaluar la disfunción de la anulación y la eficacia del tratamiento en varios modelos de ratón de disfunción del tracto urinario inferior (LUTD).
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Artículo de método
Ultrasonografía del tracto urinario masculino adulto para pruebas funcionales urinarias
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Resumen
Resumen
La incidencia de hiperplasia prostática benigna clínica (HBP) y síntomas del tracto urinario inferior (LUTS) está aumentando debido al envejecimiento de la población, lo que resulta en una carga económica y de calidad de vida significativa. Se han desarrollado modelos transgénicos y otros modelos de ratón para recrear diversos aspectos de esta enfermedad multifactorial; sin embargo, faltan métodos para cuantificar con precisión la disfunción urinaria y la eficacia de nuevas opciones terapéuticas. Aquí, describimos un método que se puede utilizar para medir el volumen de la vejiga y el espesor de la pared del detrusor, la velocidad urinaria, el volumen del vacío y la duración del vacío, y el diámetro uretral. Esto permitiría evaluar la progresión de la enfermedad y la eficacia del tratamiento a lo largo del tiempo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano, y la vejiga fue visualizada por ultrasonido. Para las imágenes sin contraste, se tomó una imagen 3D de la vejiga para calcular el volumen y evaluar la forma; el espesor de la pared de la vejiga se midió a partir de esta imagen. Para obtener imágenes mejoradas por contraste, se colocó un catéter a través de la cúpula de la vejiga utilizando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa mediante un tubo PE50. Se infunde un bolo de 0,5 ml de contraste en la vejiga hasta que se produjo un evento de micción. El diámetro uretral se determinó en el punto de la ventana de muestra de velocidad Doppler durante el primer evento de anulación. La velocidad se midió para cada evento posterior, lo que produjo un caudal. En conclusión, el ultrasonido de alta frecuencia demostró ser un método eficaz para evaluar las mediciones de vejiga y uretración durante la función urinaria en ratones. Esta técnica puede ser útil en la evaluación de nuevas terapias para la HPB/LUTS en un entorno experimental.
Introducción
La hiperplasia prostática benigna (HBP) es una enfermedad que se desarrolla en los hombres a medida que envejecen y afecta a casi el 90% de los hombres mayores de 80 años de edad1,2. Aunque el desarrollo de la HPB se asocia generalmente con el envejecimiento, otros factores como la obesidad y el síndrome metabólico pueden conducir a la HPB en hombres relativamente más jóvenes3,4. Muchos hombres con HPB desarrollan síntomas del tracto urinario inferior (LUTS, por sus dados) que disminuyen significativamente su calidad de vida, y algunos experimentan complicaciones que pueden incluir sangrado, infección, obstrucción de la salida de la vejiga (BOO), cálculos en la vejiga e insuficiencia renal. El costo del tratamiento para la HPB supera los $4 mil millones anuales5,6,7. El diagnóstico de LUTS causado por la HPB generalmente se basa en el uso de la puntuación delíndice de síntomas de la AUA (AUASI), la uroflujometría y la evaluación del tamaño de la próstata 8. La etiología de la HPB/LUTS es compleja y multifactorial, y el desarrollo y progresión de la enfermedad se ha asociado con hiperplasia prostática (proliferación de próstata), contractilidad muscular lisa y fibrosis. Los tratamientos actuales incluyen el uso de bloqueadores adrenérgicos para regular el tono muscular liso dentro de la vejiga y la próstata para aliviar los inhibidores de LUTS y/o 5o-reductasa para disminuir el metabolismo de los andrógenos y disminuir el tamaño de la próstata. Mejores modelos de enfermedad, murinos y otros, para permitir el estudio preciso de los efectos de factores causales y terapéuticos variados en este proceso de enfermedad con el tiempo es altamente deseable9.
Los modelos de roedores se han utilizado ampliamente para estudiar urodinámica; sin embargo, la mayoría de los estudios se centran en la micción femenina y la enfermedad10. Con el fin de examinar completamente todos los aspectos del LUTS masculino, los modelos de roedores se han desarrollado y utilizado para estudiar diferentes aspectos de la HPB, incluyendo cambios en la proliferación celular, función muscular lisa, deposición de colágeno, y la inflamación11, 12 , 13 , 14. Sin embargo, la anatomía de roedores y próstata humana difiere. Mientras que la próstata humana es compacta y encerrada por una capa fibromuscular condensada, la próstata del roedor es lobular; y estas diferencias complican las comparaciones directas de la progresión de la enfermedad y la eficacia del tratamiento. Además, LUTS son difíciles de evaluar en ratones, ya que no es posible medir directamente las molestias. En su lugar, los métodos actuales para estudiar la enfermedad correlacionan las características histológicas con las características fisiológicas (es decir, el volumen de la vejiga y el grosor de la pared con uroflujometría, ensayos de manchas vacías y datos de punto final de cistometría) que comparan el nivel de disfunción entre el modelo de HPB y los animales de control12,15,16,17,18. Las características fisiológicas se evalúan con frecuencia como puntos finales de necropsia post mortem, y hay una incapacidad dentro del mismo animal para observar BOO a lo largo del tiempo. Recientemente, hemos identificado una subdivisión de la uretra pélvica (la uretra prostática) donde los implantes hormonales exógenos causan un estrechamiento basado en las evaluaciones de la necropsia post mortem12. Los métodos actuales no permiten la evaluación directa e in vivo del estrechamiento uretral durante el vaciado.
El ultrasonido es una técnica de diagnóstico y evaluación no invasiva que se ha utilizado con éxito en otros modelos de enfermedades. Se utiliza para cuantificar el volumen de órganos y evaluar el flujo vascular19,20,21. El ultrasonido también se utiliza para visualizar y guiar las microinyecciones, lo que permite inyecciones dirigidas de células madre u otros medicamentos, y para evaluar la función cardíaca sistólica y diastólica.
Este protocolo describe el uso de ultrasonidos de alta frecuencia para evaluar la anatomía del tracto urinario inferior y evaluar la fisiología urinaria en ratones anestesiados. Describimos el uso de ultrasonido para medir el volumen de la vejiga y el grosor de la pared. También describimos el uso de ultrasonidos mejorados por contraste para medir la velocidad de la orina, el volumen de orina, la duración del vacío y el diámetro de la uretra. El uso de ultrasonido proporciona una comprensión más completa del tracto urinario inferior in vivo, determina cómo la enfermedad altera la función de vaciado normal, y nos da las herramientas para evaluar mejor la eficacia de las nuevas opciones terapéuticas. Actualmente, el protocolo de imágenes sin contraste no es terminal, mientras que el protocolo de imagen con contraste mejorado actual es un procedimiento terminal.
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Protocolo
Los procedimientos relacionados con sujetos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Wisconsin – Madison.
1. Preparación animal
- Coloque un ratón macho C57Bl6/J de 24 meses en una cámara precargada con isoflurano del 3-5% hasta que se pierda el reflejo de retorce y la frecuencia respiratoria disminuya.
- Si es necesario, use cortadores para afeitar el vello abdominal del animal para cirugía y/o imágenes. Retira todo el cabello restante con una crema depilatoria.
- Coloque el ratón en posición supina en un cono nasal con 2% de isoflurano sobre una plataforma calentada para mantener la anestesia. Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de movimiento del animal en respuesta a un reflejo de retirada del pedal (Figura1B).
2. Configuración por ultrasonido
- Conecte una sonda MV707 con frecuencia central de 30 MHz al puerto activo, con el ajuste preestablecido de la aplicación a "imágenes abdominales" (Figura1A).
- Coloque la sonda de ultrasonido paralela al eje largo de la vejiga (Figura1C).
- Las imágenes de ejes largos y cortos de la vejiga, la próstata y la uretra se hacen en modo B (Figura1D).
- Utilice los micromanipuladores "xy" para mover el ratón.
3. Protocolo de imagen sin contraste
- Mida el espesor de la pared de la vejiga utilizando la herramienta de medición de distancia lineal y trazando el borde exterior hasta el borde interior de la pared de la vejiga en modo b después de la adquisición.
- Mida el volumen 3D de la vejiga con la herramienta volumétrica en la adquisición del modo 3D trazando el interior de las paredes de la vejiga para crear un contorno. A continuación, se generan varios contornos a través del grosor de la vejiga para calcular el volumen.
4. Resuspensión/activación de contraste de microburbuja
- Active el agente de contraste (por ejemplo, DEFINITY) agitando en el mezclador de vórtice durante 45 s para encapsular las microburbujas en solución. Este paso es fundamental para una mejora óptima del contraste.
5. Inserción del catéter
- Con el ratón anestesiado y pegado a la plataforma calentada, exponga la vejiga con una incisión de línea media usando tijeras rectas afiladas/contundentes a través de la piel y la pared abdominal.
- Inserte una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa mediante tubos flexibles de polietileno (PE 50) en la vejiga. Rellene previamente el tubo con salina para asegurarse de que no se inyectan burbujas de aire en la vejiga.
6. Protocolo de imagen con contraste mejorado
- Para confirmar la colocación de la aguja, inculque 10 ml de salina en la vejiga mientras se observa mediante ultrasonido.
- Sustituya la jeringa salina por una jeringa que contenga contraste para mejorar la visualización de las paredes uretrales y los eventos de anulación, ya que la uretra normalmente está colapsada. Una vez que se obtenga una vista completa del eje largo de la uretra y se guarde una imagen, gire la sonda 90o para obtener una vista de eje corto y una imagen en modo M.
- Infundir un bolo de microburbujas a 0,5 ml por 3 s en la vejiga hasta que se produzca un evento de micción.
- Durante el primer evento de vaciado, mida el diámetro uretral en el punto de la ventana de muestra de velocidad Doppler utilizando la herramienta de distancia lineal y midiendo de extremo a borde.
- Con la uretra correctamente ubicada, angulo la sonda en relación con la uretra para volverse más paralela al flujo de orina.
- Infundir un segundo bolo de microburbujas en la vejiga, y medir la velocidad del evento utilizando la herramienta integral de tiempo de velocidad (VTI).
- Después de la recopilación de datos, eutanasia el ratón con luxación cervical.
7. Cálculo y análisis de datos
- Seleccione la herramienta VTI para medir la velocidad trazando las imágenes grabadas.
- Mida el diámetro de la uretra desde la imagen en modo B o M utilizando el borde delantero hasta la convención del borde de ataque.
- Calcule el área transversal (CSA) utilizando la siguiente fórmula (CSA) utilizando las mediciones de imagen obtenidas anteriormente.
- Calcular el volumen vacío utilizando el CSA de la uretra y multiplicarlo por el área bajo el trazado Doppler (tiempo de velocidad integral)(CSA x VTI - volumen).
- Calcule el volumen real de orina anulada asumiendo una densidad de gramo por centímetro cúbico.
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Resultados
El ultrasonido se puede utilizar con o sin mejora de contraste dependiendo del diseño experimental y la medición de punto final. Los ratones son anestesiados con isoflurano y afeitados y todos los restos de pelo eliminados con una crema depilatoria. Los animales anestesiados se colocan en una plataforma calentada con la sonda de ultrasonido colocada a lo largo del eje largo de la vejiga (Figura1).
La Figura 2 muestra imágenes de ultra...
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Discusión
Las técnicas actuales para evaluar el tracto urinario inferior de los roedores están limitadas por su capacidad de correlacionar directamente los cambios en la fisiología de anulación con los cambios en la histología prostática consecuente a la progresión de la enfermedad. Los ensayos de punto vacío y la uroflujometría se pueden utilizar para evaluar eventos espontáneos de micción en roedores, y estas técnicas se pueden utilizar para evaluar los cambios durante un período de tiempo15,
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Emily Ricke, Kristen Uchtmann y el laboratorio de Ricke por su ayuda con la cría de animales y comentarios sobre este manuscrito. Nos gustaría agradecer a los NIDDK y NIEHS por su apoyo financiero para estos estudios: U54 DK104310 (WAR, JAM, PCM, CMV, DEB), R01 ES001332 (WAR, CMV), K12 DK100022 (TTL, AR-A, DH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones oficiales de los NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo transparente de 21 mm | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Aguja de calibre 27 | BD | Z192376 | |
| Colector de 4 puertos Supera | Anesthesia Innov | RES536 | |
| DEFINITY | Lantheus Medical Imaging | DE4 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| Pinzas Graefe (dentadas, Recto) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Accesorios de entrada/salida | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Isoflurano | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Vaporizador de isoflurano | Supera Anesthesia Innov VAP3000 | ||
| Sonda MV707 | Fujifilm VisualSonics Inc | ||
| Caudalímetro de oxígeno | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| Tubo de polietileno 50 | BD | 427516 | |
| Regulación de presión/manómetro | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Circuitos de reinhalación Supera | Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Ratones pequeños Cono de nariz | Supera Anesthesia Inov | ACC526 | |
| Solución salina estéril | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Inyectable |
| Tijeras rectas afiladas/romas | Fine Scientific Tools (F.S.T) | 14054-13 | |
| Jeringa | BD | 309646 | 5mL |
| Vevo 770 | Fujifilm VisualSonics Inc | ||
| VIALMIX | Lantheus Medical Imaging | VMIX |
Referencias
- Kirby, R. S. The natural history of benign prostatic hyperplasia: what have we learned in the last decade. Urology. 5, Suppl 1 3-6 (2000).
- Berry, S. J., Coffey, D. S., Walsh, P. C., Ewing, L. L. The development of human benign prostatic hyperplasia with age. Journal of Urology. 132 (3), 474-479 (1984).
- Lotti, F., et al. Elevated body mass index correlates with higher seminal plasma interleukin 8 levels and ultrasonographic abnormalities of the prostate in men attending an andrology clinic for infertility. Journal of Endocrinological Investigation. 34 (10), 336-342 (2011).
- Lotti, F., et al. Metabolic syndrome and prostate abnormalities in male subjects of infertile couples. Asian Journal of Andrology. 16 (2), 295-304 (2014).
- Chute, C. G., et al. The prevalence of prostatism: a population-based survey of urinary symptoms. Journal of Urology. 150 (1), 85-89 (1993).
- Isaacs, J. T., Coffey, D. S. Etiology and disease process of benign prostatic hyperplasia. Prostate Supplemental. 2, 33-50 (1989).
- Kortt, M. A., Bootman, J. L. The economics of benign prostatic hyperplasia treatment: a literature review. Clinical Therapeutics. 18 (6), 1227-1241 (1996).
- Abrams, P., et al. Evaluation and treatment of lower urinary tract symptoms in older men. Journal of Urology. 181 (4), 1779-1787 (2009).
- Roehrborn, C. G. Benign prostatic hyperplasia: an overview. Reviews Urology. 7, Suppl 9 3-14 (2005).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourology and Urodynamics. 30 (5), 636-646 (2011).
- Nicholson, T. M., et al. Estrogen receptor-alpha is a key mediator and therapeutic target for bladder complications of benign prostatic hyperplasia. Journal of Urology. 193 (2), 722-729 (2015).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153 (11), 5556-5565 (2012).
- Ricke, W. A., et al. In Utero and Lactational TCDD Exposure Increases Susceptibility to Lower Urinary Tract Dysfunction in Adulthood. Toxicological Sciences. 150 (2), 429-440 (2016).
- Bell-Cohn, A., Mazur, D. J., Hall, C. C., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Uropathogenic Escherichia coli-Induced Fibrosis, leading to Lower Urinary Tract Symptoms, is associated with Type-2 cytokine signaling. American Journal of Physiology Renal Physiology. , (2019).
- Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology Renal Physiology. , (2018).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. American Journal of Physiology Renal Physiology. 308 (12), 1369-1378 (2015).
- Leung, Y. Y., Schwarz, E. M., Silvers, C. R., Messing, E. M., Wood, R. W. Uroflow in murine urethritis. Urology. 64 (2), 378-382 (2004).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourology and Urodynamics. 29 (4), 603-608 (2010).
- Khoo, S. W., Han, D. C. The use of ultrasound in vascular procedures. Surgical Clinics of North America. 91 (1), 173-184 (2011).
- Hunter, L. E., Simpson, J. M. Prenatal screening for structural congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 11 (6), 323-334 (2014).
- Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Utility of endoscopic ultrasound in patients with portal hypertension. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14230-14236 (2014).
- Sikes, R. A., Thomsen, S., Petrow, V., Neubauer, B. L., Chung, L. W. Inhibition of experimentally induced mouse prostatic hyperplasia by castration or steroid antagonist administration. Biology of Reproduction. 43 (2), 353-362 (1990).
- Mizoguchi, S., et al. Effects of Estrogen Receptor beta Stimulation in a Rat Model of Non-Bacterial Prostatic Inflammation. Prostate. 77 (7), 803-811 (2017).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. Journal of Urology. 164 (4), 1385-1389 (2000).
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