Purificación de plaquetas de la sangre del ratón

Resumen

Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.

Resumen

Las plaquetas se purifican de la sangre entera para estudiar sus propiedades funcionales, que deben estar libres de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y proteínas plasmáticas. Describimos aquí la purificación de las plaquetas de la sangre del ratón usando un medio degradado de tres veces más iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La recuperación/rendimiento de las plaquetas purificadas fue de 18.2-38.5%, y las plaquetas purificadas estaban en un estado de reposo, que no contenía ningún número significativo de RBC y WBC. Las plaquetas purificadas tratadas con trombina mostraron hasta el 93% de activación, indicando su viabilidad. Confirmamos que las plaquetas purificadas son lo suficientemente puras utilizando citometría de flujo y evaluación microscópica. Estas plaquetas se pueden utilizar para la expresión génica, activación, liberación de gránulos, agregación y ensayos de adherencia. Este método se puede utilizar para la purificación de las plaquetas de la sangre de otras especies, así.

Introducción

Las plaquetas son un componente de la sangre que funciona como un iniciador de la coagulación de la sangre en respuesta al daño en el vaso sanguíneo. Se reúnen en el lugar de la lesión para tapar la pared del recipiente¹. Las plaquetas son fragmentos de anucleato de citoplasma derivados de los megacuariocitos de la médula ósea bajo la influencia de la trombopoyetina y entran en la circulación². Se consideran como metabólicamente activos y capaces de detectar el entorno extracelular activando las cascadas de señalización intracelulares que resultan en la propagación de plaquetas, la agregación y la formación de tapón hemo....

Protocolo

La recolección de sangre del ratón debe realizarse con la aprobación apropiada de los animales institucionales y el Comité de uso.

Nota: El protocolo de purificación de plaquetas se describe en un diagrama de flujo en la figura 1.

1. recolección de sangre

1. Añadir 25 μL de citrato de sodio al 3,2% (pH 7,2) como un anticoagulante y 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) en un tubo de polipropileno.
2. Recolectar aproximadamente 200 μL de sangre del ratón C57BL/6 usando sangrado retro-orbital.
   Nota: la sangre se puede recoger de cualquier ....

Resultados

El Resumen de la purificación plaquetaria se describe en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen la recolección de sangre del ratón usando sangrado retro-orbital en presencia de un anticoagulante, adición de la muestra de sangre en el medio degradado de iohexol, centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La calidad de las plaquetas purificadas se evaluó con microscopía y citometría de flujo después de la tinción con anticuerpos para.......

Discusión

Comúnmente, las plaquetas se aíslan por centrifugación de baja velocidad que produce plasma rico en plaquetas que contiene un número significativo de células sanguíneas, desechos celulares y proteínas plasmáticas que pueden interferir con los ensayos y necesidades bioquímicos y fisiológicos purificación adicional²¹. Por lo tanto, es importante utilizar un método rápido y simple que puede producir plaquetas puras sin contaminantes importantes. El protocolo presentado aquí describe la purificación d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
APC rata anti-ratón/humano CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82 Marcador de activación de	plaquetas
Tubo Eppendorf	Fisher Scientific	14-222-166	Tubo para centífugo
FACS DIVA software BD	Biosciences	Artículo no catalogado	Análisis de plaquetas y sangre total
Tubo FACS	Fisher Scientific	352008	Tubos para flujo citometría
Suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingrediente para el tampón de tinción
FITC rata anti-ratón CD41	BD Biosciences	553848	Marcador de plaquetas
Citómetro de flujo	BD Biosciences	Artículo no catalogado	Análisis de plaquetas y sangre total
Software FlowJo	FlowJo, Inc.	Artículo fuera de catálogo	Análisis de plaquetas y sangre total
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevenir la formación de coágulos plaquetarios
Hematocrito Tubo capilar	Fisher Scientific	22-362566	Extracción de sangre tubo capilar
Hemavet	Drew Scientific	Artículo no catalogado	Analizador de células sanguíneas
Hemocitómetro	Hausser Scientific	3100	Cámara de recuento de células
Isoflurano	Baxter	1001936040	uso para anestesiar ratones
Microscopio (Olympus CKX41)	Olympus	Artículo fuera de catálogo	Monitorización y recuento de células
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Medio de gradiente
PE rata anti-ratón CD45	BD Biosciences	561087	marcador de leucocitos
PE-Cy7 rata anti-ratón TER 119	BD Biosciences	557853	marcador RBC
Puntas de pipeta 200 µ L, de diámetro ancho	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferencia de muestras de sangre y plaquetas
Puntas de pipeta 1000 µ L, de ánima ancha	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferencia de muestras de sangre y plaquetas
Solución salina buffurada con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Tampón para lavado y dilución Cloruro
de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Suero fisiológico
Citrato de sodio	Fisher Scientific	02-688-26	Anticoagulante
Tampón de tinción	Interno	Artículo no catalogado	Tampón de lavado y dilución Agua
Steile	Interno	Artículo no catalogado	Solvente
Centrífuga de sobremesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Centrífuga de rotor de cubeta oscilante Laboratorio de
investigación enzimática	de trombina	HT 1002a	Agonista de activación plaquetaria
Tricina	Sigma-Aldrich	T0377 Tampón	para Nycodenz medio