Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.
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Artículo de método
Purificación de plaquetas de la sangre del ratón
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Resumen
Resumen
Las plaquetas se purifican de la sangre entera para estudiar sus propiedades funcionales, que deben estar libres de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y proteínas plasmáticas. Describimos aquí la purificación de las plaquetas de la sangre del ratón usando un medio degradado de tres veces más iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La recuperación/rendimiento de las plaquetas purificadas fue de 18.2-38.5%, y las plaquetas purificadas estaban en un estado de reposo, que no contenía ningún número significativo de RBC y WBC. Las plaquetas purificadas tratadas con trombina mostraron hasta el 93% de activación, indicando su viabilidad. Confirmamos que las plaquetas purificadas son lo suficientemente puras utilizando citometría de flujo y evaluación microscópica. Estas plaquetas se pueden utilizar para la expresión génica, activación, liberación de gránulos, agregación y ensayos de adherencia. Este método se puede utilizar para la purificación de las plaquetas de la sangre de otras especies, así.
Introducción
Las plaquetas son un componente de la sangre que funciona como un iniciador de la coagulación de la sangre en respuesta al daño en el vaso sanguíneo. Se reúnen en el lugar de la lesión para tapar la pared del recipiente1. Las plaquetas son fragmentos de anucleato de citoplasma derivados de los megacuariocitos de la médula ósea bajo la influencia de la trombopoyetina y entran en la circulación2. Se consideran como metabólicamente activos y capaces de detectar el entorno extracelular activando las cascadas de señalización intracelulares que resultan en la propagación de plaquetas, la agregación y la formación de tapón hemostático1,3. Además de la hemostasia/trombosis y la cicatrización de heridas4, las plaquetas desempeñan un papel importante en las respuestas inflamatorias del huésped, angiogénesis y nódulos3,5,6,7, 8.
Las plaquetas se purifican de la sangre para estudiar sus propiedades bioquímicas y fisiológicas, que deben estar libres de otros componentes de la sangre. Dado que los glóbulos rojos (RBC) y los glóbulos blancos (WBC) contienen significativamente más ARN y proteínas que las plaquetas9,10, la presencia de incluso un pequeño número de estas células puede interferir con análisis transcriptómicos y proteómicas de ARN y proteínas derivadas de las plaquetas. Descubrimos que las plaquetas purificadas se activaron con anticuerpos de enlace de trombina como anti-GPIIb/IIIa (JON/A) y anti-P-selectin de manera más eficiente que las plaquetas sanguíneas enteras.
Dado que las plaquetas son frágiles, es importante tratar las muestras de la forma más leve posible. Si las plaquetas están activadas, liberan su contenido de gránulo y finalmente se degradan. Por lo tanto, para mantener intactas las propiedades funcionales de las plaquetas, es importante mantener la quiescencia plaquetaria durante el aislamiento. Varios protocolos han descrito el aislamiento de las plaquetas de humano, perro, rata y primates no humano por varios métodos1,10,11,12. Algunos de los métodos requieren múltiples pasos como la recolección de plasma rico en plaquetas por centrifugación, filtración por columna de separación, selección negativa de plaquetas con anticuerpos específicos de RBC y WBC conjugados con cuentas magnéticas, y así sucesivamente, que son consume mucho tiempo y puede degradar las plaquetas y su contenido.
Ford y sus colegas describieron la purificación plaquetaria de sangre humana usando iohexol medio11. Este método utiliza un volumen similar de muestra de sangre y medio durante la purificación. Dado que los seres humanos producen un mayor volumen de sangre, es relativamente fácil purificar las plaquetas.
Iohexol es un medio inerte de gradiente de densidad universal que es libremente soluble en agua y utilizado en el fraccionamiento de ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos, y nucleoproteínas13,14. Tiene baja osmolalidad y no es tóxico, por lo que es un medio ideal para la purificación de las células vivas intactas11. Es un medio no particulado; por lo tanto, la distribución de las células en un degradado se puede determinar mediante hemocitómetro, CITOMETRO de flujo o espectrofotómetro. No interfiere con la mayoría de las reacciones enzimáticas o químicas de las células o fragmentos celulares después de la dilución.
El ratón sirve como un modelo animal importante para muchas enfermedades humanas15,16,17,18. Hay algunos artículos publicados que describen la purificación de las plaquetas del ratón19,20. Sin embargo, el ratón produce un volumen de sangre relativamente más pequeño, lo que dificulta la purificación de las plaquetas. Si se utiliza el mismo volumen pequeño de medio degradado y muestras de sangre, la capa plaquetaria no puede separarse claramente de la capa de RBC-WBC después de la centrifugación. En este artículo, hemos descrito un método rápido y simple de purificación de plaquetas de ratón con tres veces más medio degradado iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación de baja velocidad. También hemos activado las plaquetas purificadas con trombina e investigado su calidad con citometría de flujo y microscopía.
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Protocolo
La recolección de sangre del ratón debe realizarse con la aprobación apropiada de los animales institucionales y el Comité de uso.
Nota: El protocolo de purificación de plaquetas se describe en un diagrama de flujo en la figura 1.
1. recolección de sangre
- Añadir 25 μL de citrato de sodio al 3,2% (pH 7,2) como un anticoagulante y 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) en un tubo de polipropileno.
-
Recolectar aproximadamente 200 μL de sangre del ratón C57BL/6 usando sangrado retro-orbital.
Nota: la sangre se puede recoger de cualquier tipo de cepa del ratón, independientemente de la edad o el sexo.- Utilizar 2 mL de isoflurano en cualquier tipo de cámara para anestesiar el ratón.
Nota: La profundidad de la anestesia se verifica mediante signos de aumento de la respiración y disminución del movimiento. El ratón no debe responder al movimiento de la cámara de anestesia, o a ser manejado. Si el ratón es sensible al movimiento o la manipulación, entonces se requiere más tiempo para mantener en la cámara de anestesia. - 1.2.2 Abra el párpado derecho o izquierdo del ratón e inserte un tubo capilar de 7,5 cm (0,12 cm de diámetro) en el plexo vascular del ojo.
- Gire el tubo capilar una media vuelta mientras aplica presión al tubo capilar para romper los vasos e iniciar el flujo sanguíneo. Sostenga al animal boca abajo sobre el vial de la colección para ser llenado por la acción capilar.
- Una vez que se recoge el volumen adecuado de sangre, retire el tubo capilar y cierre el ojo aplicando presión leve durante 30 s en el párpado con gasa. Una vez detenido el sangrado, devuelva el ratón a su jaula y vigile el sangrado.
- Revise los ojos por trauma 1-2 días después del sangrado retro-orbital. Retire cualquier ratón del estudio mostrando signos de trauma significativo en el ojo como resultado del procedimiento y eutanasia.
Nota: El ratón no debe someterse a ningún tipo de tratamiento que pueda inhibir las plaquetas durante al menos dos semanas antes de la recolección de sangre. La muestra de sangre debe ser utilizada para la purificación de plaquetas dentro de una hora de sangrado del ratón.
- Utilizar 2 mL de isoflurano en cualquier tipo de cámara para anestesiar el ratón.
2. purificación de plaquetas
Nota: La purificación de plaquetas debe llevarse a cabo a temperatura ambiente para evitar su degradación. Asegúrese de que la temperatura de los reactivos y los instrumentos estén entre 18 y 22 ° c. Para prevenir la degradación plaquetaria, se debe evitar el pipeteo rápido y la agitación vigorosa durante el procedimiento.
- Añadir 600 μL de medio degradado de iohexol (12% polvo de iohexol en 0,85% cloruro sódico, 5 mM Tricina, pH 7,2)11 en un tubo de 1,5 ml.
- Añadir 200 μL de muestra de sangre lentamente por el costado del tubo en la parte superior del medio degradado con una punta de pipetas de diámetro ancho para que la sangre y el medio de iohexol no se mezclen (figura 2A).
- Centrifugar la muestra que contiene el tubo a 400 x g durante 20 min a 20 ° c en un rotor de cucharón oscilante con aceleración y desaceleración lentas.
- Recoja la mayor parte de la capa rica en plaquetas y una pequeña fracción de la capa pobre en plaquetas (total de 300 a 400 μL) usando una punta de pipetas de diámetro ancho sin perturbar las capas de RBC y WBC (figura 2B). Transfiera la muestra de plaquetas a un tubo nuevo.
Nota: Si el recuento de plaquetas es menor en la sangre o se utiliza un volumen más pequeño de sangre, la capa rica en plaquetas y la capa de plaquetas pobres se pueden ver como una sola capa. - Añadir 1 mL de PBS a la muestra plaquetaria, mezclar por inversión, y centrifugar a 800 x g durante 10 min a 20 ° c en un rotor oscilante del cucharón. Desechar completamente la solución y añadir 200 μL de PBS para resuspentar las plaquetas con pipeteo leve.
Nota: Este paso es opcional, ya que elimina el medio degradado y las proteínas plasmáticas y aumenta la sensibilidad de las plaquetas a los agonistas como la trombina. Dado que las diferentes centrífugas tienen diferentes programas, la lenta aceleración/desaceleración puede determinarse leyendo el manual de usuario de la centrífuga. - Transfiera 30 μL de esta muestra a un tubo nuevo para contar las plaquetas. Las plaquetas restantes se pueden utilizar para ensayos bioquímicos y fisiológicos como la activación plaquetaria, agregación, liberación de gránulos, etc.
- Para la extracción de ARN o proteínas, Centrifugue la muestra de plaquetas a 800 x g durante 10 min para pelar las plaquetas. Deseche el sobrenadante completamente sin perturbar el pellet. Añadir el volumen deseado de ARN o tampón de lisis proteica para LIZAR las plaquetas.
3. contando las plaquetas
- Cuente las células sanguíneas enteras sin diluir y las plaquetas purificadas (diluida 2 a 5 veces con PBS) utilizando un analizador automatizado de células. Utilice muestras de 30 a 50 μL para el recuento.
- Calcule el número total de plaquetas multiplicando por el volumen de la muestra.
- Calcular el porcentaje de rendimiento/recuperación de las plaquetas purificadas.
- Cuente el RBC y el WBC en la muestra de plaquetas purificada (diluida 50 a 100-Fold con PBS) con un hemociómetro y un microscopio.
4. activación plaquetaria
- En un tubo, añadir de 1 a 2 millones plaquetas purificadas en hasta 100 μL de tampón de tinción (PBS con 2% suero bovino fetal, FBS).
- Para múltiples muestras, haga una mezcla maestra de anticuerpos con 1 μL (0,5 mg/mL) de los siguientes: PE-Cy7 Rat anti-Mouse TER 119, PE Rat anti-Mouse CD45, FITC Rat anti-Mouse CD41, y APC Rat anti-Mouse/Human CD62P (P-selectin) para detectar RBC, WBC, plaquetas y plaquetas activadas, respectivamente. Añadir la mezcla maestra a los tubos para la tinción de las células. No agregue trombina.
- En otro tubo, añadir 1 a 2 millones de plaquetas purificadas en hasta 100 μL de tampón de tinción, y 0,4 mM de péptido GPRP. Añadir trombina para activar las plaquetas y manchar las células siguiendo el paso 4,2.
Nota: GPRP debe añadirse a la muestra antes de agregar trombina para evitar la formación de agregados o coágulos a través de la activación plaquetaria. La concentración de trombina debe optimizarse para obtener una buena activación de las plaquetas. Después de la activación plaquetaria, los recuentos de eventos disminuyen durante la adquisición de muestras por citometría de flujo. - Como control positivo, añadir 1 μL de sangre entera en hasta 100 μL de tampón de tinción en un tubo y 0,4 mM de péptido GPRP. Agregue trombina para activar las plaquetas. Como control negativo, añadir 1 μL de sangre entera en hasta 100 μL de tampón de tinción. No agregue trombina en la muestra de control negativo. Mancha las células siguiendo el paso 4,2.
- Para el control de isotipo de citometría de flujo, etiquete 5 tubos con sin mancha, PE-Cy7, PE, FITC y APC. Añadir 100 μL de tampón de tinción, 1 μL de sangre y 1 μL del anticuerpo respectivo a los tubos etiquetados para manchar las células.
- Incubar las muestras para teñir durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las muestras añadiendo 1 mL de tampón de tinción a cada tubo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el tampón de tinción cuidadosamente sin desalojar el pellet.
- Añadir 300 μL de tampón de tinción a cada tubo, mezclar suavemente y transferirlo a un tubo FACS. Almacene las muestras manchadas en la oscuridad hasta que se analicen con un CITOMETRO de flujo.
5. Análisis de citometría de flujo de plaquetas
-
Cree un nuevo experimento y genere trazados de dispersión de puntos de dispersión en el lado del log hacia adelante y asigne puertas para las poblaciones Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquetas) y CD62P APC (plaquetas activadas) de acuerdo con la estrategia de compuerta elegida para el experimento en el software FACS DIVA.
- Abra la jerarquía de población eligiendo Mostrar jerarquía de población en la ficha poblaciones . edite la jerarquía de población comprobando la estrategia de compuerta y renombrando correctamente las puertas.
- Abra la vista de estadísticas eligiendo crear vista de estadísticas. Edite la vista de estadísticas según las preferencias del usuario haciendo clic con el botón derecho en la vista de estadísticas y seleccionando Editar vista de estadísticas.
- Elija un color para cada puerta que mejore el aspecto visual del diseño haciendo doble clic en la casilla correspondiente a la población.
- En la ventana del CITOMETRO , haga clic en la pestaña Parameters y ajuste los voltajes para los parámetros para visualizar la población de interés en las parcelas.
- Ajuste los voltajes para cada uno de los parámetros para que la población negativa pueda distinguirse de la población positiva. Antes de grabar las muestras para el control de compensación, compruebe que los controles positivos con manchas individuales están a escala (Asegúrese de que los picos positivos son visibles y no demasiado lejos a la derecha).
Nota: Si los picos positivos están fuera de escala, los voltajes deben ajustarse para ver las poblaciones positivas. - Registre las celdas teñidas de un solo color para los controles de compensación (sin mancha, PE-Cy7, PE, FITC y APC).
- Si las puertas de control positivas no se configuran correctamente, ajústelos cambiando los voltajes.
- Vaya a experimento ≫ configuración de compensación ≫ calcular compensación. Seleccione aplicar sólo en la ventana resultante.
- Cambie a la hoja de trabajo global haciendo clic en el botón de alternar en la parte superior, a la izquierda de la ventana de la hoja de trabajo.
- Cargue la muestra de control positivo y adquiera suficientes células para ajustar la compensación y las compuertas.
- Cargue la muestra de nuevo y compruebe que cada parcela muestra la población celular esperada según el anticuerpo manchado con fluorocromo. Adquiera y registre 100.000 eventos para muestras de sangre enteras y 10.000 eventos para plaquetas purificadas. Cargue las muestras una por una hasta que se complete la adquisición.
- Analizar los datos de citometría de flujo con el software con parcelas y compuertas apropiadas (figura 3)
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Resultados
El Resumen de la purificación plaquetaria se describe en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen la recolección de sangre del ratón usando sangrado retro-orbital en presencia de un anticoagulante, adición de la muestra de sangre en el medio degradado de iohexol, centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La calidad de las plaquetas purificadas se evaluó con microscopía y citometría de flujo después de la tinción con anticuerpos para...
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Discusión
Comúnmente, las plaquetas se aíslan por centrifugación de baja velocidad que produce plasma rico en plaquetas que contiene un número significativo de células sanguíneas, desechos celulares y proteínas plasmáticas que pueden interferir con los ensayos y necesidades bioquímicos y fisiológicos purificación adicional21. Por lo tanto, es importante utilizar un método rápido y simple que puede producir plaquetas puras sin contaminantes importantes. El protocolo presentado aquí describe la purificación d...
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una financiación inicial de la Fundación de investigación infantil de Cincinnati y una subvención translacional de la Universidad de Cincinnati a M.N. Nos gustaría agradecer el núcleo de la citometría de flujo de investigación de Cincinnati children's hospital por sus servicios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| APC rata anti-ratón/humano CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 Marcador de activación de | plaquetas |
| Tubo Eppendorf | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tubo para centífugo |
| FACS DIVA software BD | Biosciences | Artículo no catalogado | Análisis de plaquetas y sangre total |
| Tubo FACS | Fisher Scientific | 352008 | Tubos para flujo citometría |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingrediente para el tampón de tinción |
| FITC rata anti-ratón CD41 | BD Biosciences | 553848 | Marcador de plaquetas |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | Artículo no catalogado | Análisis de plaquetas y sangre total |
| Software FlowJo | FlowJo, Inc. | Artículo fuera de catálogo | Análisis de plaquetas y sangre total |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevenir la formación de coágulos plaquetarios |
| Hematocrito Tubo capilar | Fisher Scientific | 22-362566 | Extracción de sangre tubo capilar |
| Hemavet | Drew Scientific | Artículo no catalogado | Analizador de células sanguíneas |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 3100 | Cámara de recuento de células |
| Isoflurano | Baxter | 1001936040 | uso para anestesiar ratones |
| Microscopio (Olympus CKX41) | Olympus | Artículo fuera de catálogo | Monitorización y recuento de células |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Medio de gradiente |
| PE rata anti-ratón CD45 | BD Biosciences | 561087 | marcador de leucocitos |
| PE-Cy7 rata anti-ratón TER 119 | BD Biosciences | 557853 | marcador RBC |
| Puntas de pipeta 200 µ L, de diámetro ancho | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferencia de muestras de sangre y plaquetas |
| Puntas de pipeta 1000 µ L, de ánima ancha | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferencia de muestras de sangre y plaquetas |
| Solución salina buffurada con fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Tampón para lavado y dilución Cloruro |
| de sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | Suero fisiológico |
| Citrato de sodio | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anticoagulante |
| Tampón de tinción | Interno | Artículo no catalogado | Tampón de lavado y dilución Agua |
| Steile | Interno | Artículo no catalogado | Solvente |
| Centrífuga de sobremesa | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Centrífuga de rotor de cubeta oscilante Laboratorio de |
| investigación enzimática | de trombina | HT 1002a | Agonista de activación plaquetaria |
| Tricina | Sigma-Aldrich | T0377 Tampón | para Nycodenz medio |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
