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Artículo de método

Purificación de plaquetas de la sangre del ratón

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DOI:

10.3791/59803

7 de mayo de 2019

En este artículo

Resumen

Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.

Resumen

Las plaquetas se purifican de la sangre entera para estudiar sus propiedades funcionales, que deben estar libres de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y proteínas plasmáticas. Describimos aquí la purificación de las plaquetas de la sangre del ratón usando un medio degradado de tres veces más iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La recuperación/rendimiento de las plaquetas purificadas fue de 18.2-38.5%, y las plaquetas purificadas estaban en un estado de reposo, que no contenía ningún número significativo de RBC y WBC. Las plaquetas purificadas tratadas con trombina mostraron hasta el 93% de activación, indicando su viabilidad. Confirmamos que las plaquetas purificadas son lo suficientemente puras utilizando citometría de flujo y evaluación microscópica. Estas plaquetas se pueden utilizar para la expresión génica, activación, liberación de gránulos, agregación y ensayos de adherencia. Este método se puede utilizar para la purificación de las plaquetas de la sangre de otras especies, así.

Introducción

Las plaquetas son un componente de la sangre que funciona como un iniciador de la coagulación de la sangre en respuesta al daño en el vaso sanguíneo. Se reúnen en el lugar de la lesión para tapar la pared del recipiente1. Las plaquetas son fragmentos de anucleato de citoplasma derivados de los megacuariocitos de la médula ósea bajo la influencia de la trombopoyetina y entran en la circulación2. Se consideran como metabólicamente activos y capaces de detectar el entorno extracelular activando las cascadas de señalización intracelulares que resultan en la propagación de plaquetas, la agregación y la formación de tapón hemo....

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Protocolo

La recolección de sangre del ratón debe realizarse con la aprobación apropiada de los animales institucionales y el Comité de uso.

Nota: El protocolo de purificación de plaquetas se describe en un diagrama de flujo en la figura 1.

1. recolección de sangre

  1. Añadir 25 μL de citrato de sodio al 3,2% (pH 7,2) como un anticoagulante y 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) en un tubo de polipropileno.
  2. Recolectar aproximadamente 200 μL de sangre del ratón C57BL/6 usando sangrado retro-orbital.
    Nota:
    la sangre se puede recoger de cualquier ....

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Resultados

El Resumen de la purificación plaquetaria se describe en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen la recolección de sangre del ratón usando sangrado retro-orbital en presencia de un anticoagulante, adición de la muestra de sangre en el medio degradado de iohexol, centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La calidad de las plaquetas purificadas se evaluó con microscopía y citometría de flujo después de la tinción con anticuerpos para.......

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Discusión

Comúnmente, las plaquetas se aíslan por centrifugación de baja velocidad que produce plasma rico en plaquetas que contiene un número significativo de células sanguíneas, desechos celulares y proteínas plasmáticas que pueden interferir con los ensayos y necesidades bioquímicos y fisiológicos purificación adicional21. Por lo tanto, es importante utilizar un método rápido y simple que puede producir plaquetas puras sin contaminantes importantes. El protocolo presentado aquí describe la purificación d.......

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Divulgaciones

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una financiación inicial de la Fundación de investigación infantil de Cincinnati y una subvención translacional de la Universidad de Cincinnati a M.N. Nos gustaría agradecer el núcleo de la citometría de flujo de investigación de Cincinnati children's hospital por sus servicios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
APC rata anti-ratón/humano CD62P (P-selectin)Thermoscientific17-0626-82 Marcador de activación deplaquetas
Tubo EppendorfFisher Scientific14-222-166Tubo para centífugo
FACS DIVA software BDBiosciencesArtículo no catalogadoAnálisis de plaquetas y sangre total
Tubo FACSFisher Scientific352008Tubos para flujo citometría
Suero fetal bovino (FBS)Invitrogen26140079Ingrediente para el tampón de tinción
FITC rata anti-ratón CD41BD Biosciences553848Marcador de plaquetas
Citómetro de flujoBD BiosciencesArtículo no catalogadoAnálisis de plaquetas y sangre total
Software FlowJoFlowJo, Inc.Artículo fuera de catálogoAnálisis de plaquetas y sangre total
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)EMD Millipore03-34-0001Prevenir la formación de coágulos plaquetarios
Hematocrito Tubo capilarFisher Scientific22-362566Extracción de sangre tubo capilar
HemavetDrew ScientificArtículo no catalogadoAnalizador de células sanguíneas
HemocitómetroHausser Scientific3100Cámara de recuento de células
IsofluranoBaxter1001936040uso para anestesiar ratones
Microscopio (Olympus CKX41)OlympusArtículo fuera de catálogoMonitorización y recuento de células
Nycodenz (Histodenz)Sigma-AldrichD2158Medio de gradiente
PE rata anti-ratón CD45BD Biosciences561087marcador de leucocitos
PE-Cy7 rata anti-ratón TER 119BD Biosciences557853marcador RBC
Puntas de pipeta 200 µ L, de diámetro anchoThermoFisher Scientific21-236-1ATransferencia de muestras de sangre y plaquetas
Puntas de pipeta 1000 µ L, de ánima anchaThermoFisher Scientific21-236-2CTransferencia de muestras de sangre y plaquetas
Solución salina buffurada con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific14040-117Tampón para lavado y dilución Cloruro
de sodioSigma-AldrichS7653Suero fisiológico
Citrato de sodioFisher Scientific02-688-26Anticoagulante
Tampón de tinciónInternoArtículo no catalogadoTampón de lavado y dilución Agua
SteileInternoArtículo no catalogadoSolvente
Centrífuga de sobremesaThermoFisher Scientific75253839/433607Centrífuga de rotor de cubeta oscilante Laboratorio de
investigación enzimáticade trombinaHT 1002aAgonista de activación plaquetaria
TricinaSigma-AldrichT0377 Tampónpara Nycodenz medio

Referencias

  1. de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
  2. Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.

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Etiquetas

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