El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.
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Artículo de método
Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E
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Resumen
Resumen
El intestino es el hogar del mayor número de células inmunitarias en el cuerpo. Los sistemas inmunitarios intestinales pequeños y grandes controlan la exposición a antígenos exógenos y modulan las respuestas a potentes estímulos inmunes derivados microbianamente. Por esta razón, el intestino es un sitio objetivo importante de la desregulación inmune y la inflamación en muchas enfermedades, incluyendo pero, no limitado a enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) después de hueso hueso trasplante de médula (BMT), y muchas afecciones alérgicas e infecciosas. Los modelos murinos de inflamación gastrointestinal y colitis se utilizan en gran medida para estudiar las complicaciones gastrointestinales y para optimizar previamente las estrategias para la prevención y el tratamiento. Los datos obtenidos de estos modelos a través del aislamiento y el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino son fundamentales para una mayor comprensión inmune que se puede aplicar para mejorar los trastornos inflamatorios gastrointestinales y sistémicos. Este informe describe un protocolo altamente eficaz para el aislamiento de células mononucleares (MNC) del colon utilizando una interfaz de gradiente de densidad basada en sílice mixta. Este método aísla reproduciblemente a un número significativo de leucocitos viables al tiempo que minimiza los desechos contaminantes, permitiendo el fenotipado inmune posterior por citometría de flujo u otros métodos.
Introducción
Aunque el tracto gastrointestinal (GI) se dedica principalmente al procesamiento y reabsorción de nutrientes de los alimentos, el tracto gastrointestinal también mantiene roles centrales en la integridad de los sistemas vascular, linfático y nervioso y de numerosos otros órganos a través de su sistema inmunológico mucoso y submucoso1. El sistema inmunitario GASTROINTESTINAL tiene un papel influyente en la salud gastrointestinal y sistémica debido a su exposición constante a antígenos extraños de alimentos, bacterias comensales o patógenos invasores1,2. Por lo tanto, el sistema inmunitar....
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Protocolo
Todos los estudios se llevaron a cabo bajo protocolos de investigación de roedores revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina Miller de la Universidad de Miami, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la Asociación Americana para Ciencias Animales de Laboratorio (AALAS).
1. Preparación de soluciones
- Como se describe en la Tabla 1, prepare el búfer de colon, los medios de separación de densidad basados en sílice 100%, los medios de separación de densidad basados en sílice 66%, los medios de separación de densidad basados en sílice 44%....
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Resultados
Cuando se trabaja con modelos de enfermedad de colon murino, es útil ser capaz de cuantificar y evaluar cualitativamente, entre el MNC del colon, múltiples subconjuntos de células inmunitarias implicados en el proceso inflamatorio. La suspensión de una sola célula de MNC obtenida a través de la aplicación de este protocolo facilita dicha caracterización fenotípica de una manera robusta y reproducible. Como prueba de principio para la aplicación de este método de aislamiento bajo diversos .......
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Discusión
Este protocolo visual describe métodos bien tolerados para el aislamiento de células mononucleares colónicas, incluidos linfocitos de lamina propria (LPL). Dado que este protocolo se optimizó en la evaluación de modelos graves de colitis de ratón post-trasplante donde las citoquinas inflamatorias y las lesiones tisulares se prestan a la mala viabilidad de la MNC recuperada, anticipamos que estos métodos pueden traducirse a otros aplicaciones que requieren análisis fenotípicos del MNC colonico. Estos incluyen pero, no se .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones #1K08HL088260 y #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), y la Fundación Batchelor para la Investigación Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Los ratones C57BL/6 y BALB/c utilizados en este estudio fueron criados en nuestras instalaciones o proporcionados por Jackson Labs o Taconic.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tarjeta de Petri de 60 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Pipeta serológica desechable | Corning | 4100 | |
| Jeringa de 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Tubos cónicos no estériles | TruLine | TR2002 | |
| 18 g aguja roma | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL pipeta serológica desechable | Corning | 4250 | |
| 40 μ Tamaño de poro m Filtro de células | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Tampón de fijación | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Colagenasa E de Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0,5 m estéril Solución | Amresco | E177-500ML | |
| Suero Fetal Bovino | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Ciencias de la Vida | 1708901 | |
| RPMI Medio | Corning | 17-105-CV | |
| Azida de sodio | VWR Ciencias de la vida Amresco | 97064-646 | |
| Azul Trypan | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Referencias
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation<....
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Reimpresiones y permisos
