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Artículo de método

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

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DOI:

10.3791/59845

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5 de noviembre de 2019

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1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Resumen

Las culturas organotípicas, o de rebanadas, se han empleado ampliamente para modelar aspectos del sistema nervioso central que funcionan in vitro. A pesar del potencial de los cultivos de rebanadas en neurociencia, estudios que utilizan tejido nervioso adulto para preparar tales cultivos son todavía escasos, particularmente los de sujetos humanos. El uso de tejido humano adulto para preparar cultivos de rebanadas es particularmente atractivo para mejorar la comprensión de las neuropatologías humanas, ya que poseen propiedades únicas típicas del cerebro humano maduro que carece de rodajas producidas a partir de roedores (generalmente neonatales) tejido nervioso. Este protocolo describe cómo utilizar el tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva para preparar cultivos de rebanadas a corto plazo y flotantes. También se presentan procedimientos para mantener y realizar ensayos bioquímicos y de biología celular utilizando estos cultivos. Los resultados representativos demuestran que la laminación cortical humana típica se conserva en rodajas después de 4 días in vitro (DIV4), con la presencia esperada de los principales tipos de células neurales. Además, las rodajas en DIV4 se someten a una muerte celular robusta cuando se les reta con un estímulo tóxico (H2O2), lo que indica el potencial de este modelo para servir como plataforma en los ensayos de muerte celular. Este método, una alternativa más simple y rentable al protocolo ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana, se recomienda principalmente para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de enfermedades cerebrales asociadas a la edad. Por último, aunque el protocolo se dedica al uso de tejido cortical recogido de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico de epilepsia del lóbulo temporal farmacorresistente, se argumenta que el tejido recogido de otras regiones/condiciones cerebrales también debe considerados como fuentes para producir cultivos similares de sectores flotantes.

Introducción

El uso de muestras humanas en la investigación es inequívocamente una gran opción para estudiar las patologías cerebrales humanas, y las técnicas modernas han abierto nuevas formas de experimentación robusta y ética utilizando tejido derivado del paciente. Métodos como cultivos organotípicos/rebanadas preparados a partir del cerebro humano adulto se han utilizado cada vez más en paradigmas como la optogenética1, la electrofisiología2,3,4,5, plasticidad 6,7,8,9, neurotoxicidad/neuroprotección10,11,12,13, terapia celular14, cribado de drogas15,16,17, genética y edición genética12,18,19,20, entre otros, como estrategia para mejorar la comprensión de las enfermedades neurológicas durante la edad adulta.

La comprensión de los mecanismos subyacentes a las patologías cerebrales humanas depende de estrategias experimentales que requieren un gran número de sujetos. Por el contrario, en el caso de los cultivos de rebanadas, aunque el acceso a muestras humanas sigue siendo difícil, la posibilidad de generar hasta 50 rebanadas a partir de una sola muestra cortical elude parcialmente el requisito de reclutar múltiples voluntarios número de réplicas y ensayos realizados por tejido recogido21.

Se han descrito varios protocolos para cultivos organotípicos y de corte cerebrales, que van desde los clásicos borradores de oculo22,23 hasta el tubo de rodillo24,25,26, membranas semipermeables interfaz27,28,29,30y rebanadas flotantes31,32. Dependiendo de las particularidades de un diseño experimental, cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas. Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo de cerebros humanos adultos es en algunos casos ventajoso sobre el método utilizado por Stoppini et al.27, si se tiene en cuenta el hecho de que aunque la supervivencia celular a largo plazo in vitro suele ser una preocupación importante a la hora de evaluar un método de cultivo, en muchos experimentos sólo se necesitan períodos cortos de tiempo en el cultivo12,31,32,33,34,35. En estas condiciones, el uso de cultivos flotantes presenta la ventaja de ser más simple y más rentable, así como se asemeja con mayor precisión a la condición original del tejido humano que las rodajas mantenidas en cultivo durante 2-3 semanas.

A pesar del potencial de los cultivos de rebanadas a la neurociencia, estudios que utilizan tejido nervioso adulto para preparar tales cultivos son todavía escasos, particularmente de los sujetos humanos. Este artículo describe un protocolo para usar el tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva para preparar cultivos de rebanadas flotantes libres. Se detallan los procedimientos para mantener y realizar ensayos bioquímicos y de biología celular utilizando estos cultivos. Este protocolo ha demostrado ser valioso para analizar la viabilidad y la función neuronal en investigaciones sobre los mecanismos de las neuropatologías vinculadas a la edad adulta.

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Protocolo

Se obtuvieron tejidos cerebrales adultos vivos de pacientes sometidos a neurocirugía resectiva para el tratamiento de la epilepsia del lóbulo temporal farmacorresistente(Figura 1A). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética del Hospital de Clínicas de la Escuela de Medicina Ribeir-o Preto (17578/2015), y los pacientes (o su persona legal responsable) aceptaron y firmaron los términos de consentimiento informado. La recolección del tejido fue realizada por el equipo de neurocirugía del Centro de Cirugía de La Epilepsia (CIREP - Clinics Hospital de la Escuela de Medicina Ribeir-o Preto, Universidad de Sao Paulo, Brasil).

1. Esterilización de materiales

NOTA: Todo el material y las soluciones deben esterilizarse antes de su uso.

  1. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas y el material de corte del vibratome (soporte de cuchillo, disco de la muestra, bandeja tampón) en un horno de esterilización en seco durante 4 h a 180 oC.
  2. Esterilizar material o equipo sensible a la temperatura mediante irradiación UV o gamma.
  3. Esterilice los medios y las soluciones mediante autoclave o filtración a través de membranas de poro de 0,22 m.

2. Preparación de soluciones

  1. Preparar 15-20 ml de solución de transporte: 50% v/v Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) pH 7,4, 50% v/v medio basal para el mantenimiento de neuronas cerebrales postnatales y adultas(Tabla de Materiales),complementado con 10 mM 4-(2-hidroxietilo)-1- ácido piperazineethanesulfónico (Hepes), 3 mg/ml de glucosa y 33 g/ml de gentamicina.
    NOTA: La solución de transporte debe estar refrigerada y oxigenada (burbujeando con gas carbegeno) durante al menos 20 minutos antes de la recogida de la muestra.
  2. Preparar 300 ml de solución de corte (HBSS complementado con 10 mM de HEPES y 3 mg/ml de glucosa) y enfriarlo en un congelador hasta el punto de la formación inicial del cristal.
  3. Preparar 20 ml de medio de cultivo: medio basal para el mantenimiento de las neuronas cerebrales postnatales y adultas(Tabla de Materiales)complementado con 1% derivado de L-glutamina (Tabla de Materiales),2% suplemento para el cultivo neural(Tabla de Materiales),1% penicilina/estreptomicina y 0,25 g/ml de anfotericina B.

3. Configuración del aparato de corte

NOTA: Este protocolo se realiza idealmente con la ayuda de un colega debido a la logística de la recogida de muestras en la sala quirúrgica.

  1. En un cubo de hielo con sal añadida, deje reposar la solución de corte bajo la mezcla de carbogen burbujeante (95% O2, 5% CO2) durante al menos 20 minutos antes de su uso.
  2. Preparar un bloque de 3% de agarosa (aproximadamente 2 cm x 2 cm x 2 cm) y supercolarlo en el disco de la muestra de vibratome para crear soporte mecánico adicional a la muestra de tejido durante el corte(Figura 1E).
  3. Ajuste el vibratomo para el corte: espesor de sección de 200 m, frecuencia de vibración de 100 Hz, y velocidad de corte entre 0,5-1,0 mm/s.
  4. Bloquee la bandeja tampón del vibratome en la base del vibratome y agregue hielo para mantenerla refrigerada antes de recibir la solución de corte y la muestra, y durante todo el procedimiento de corte.

4. Recogida de muestras

NOTA: En este protocolo, el tejido neocortical humano fue recogido en la sala quirúrgica y transportado al laboratorio.

ADVERTENCIA: Cuando trate con muestras humanas, siga los protocolos de seguridad adecuados establecidos por la Institución.

  1. Configurar el aparato de transporte(Figura 1C)que consta de: un cilindro de gas portátil con mezcla de carbeo conectado a una válvula de presión/flujo que controla la salida de gas conectada a un tubo de silicio que conecta la salida de gas al transporte buque; un buque de transporte, generalmente un tubo centrífugo cónico de 50 ml con tapa perforada para la entrada de gas, que contiene la solución de transporte; y hielo para el enfriamiento de la muestra durante el transporte.
  2. Recoger y transportar el espécimen(Figura 1B)inmediatamente al laboratorio. Sumerja la muestra en solución de transporte en frío (constantemente burbujeando con mezcla de carbogenes).

5. Cortar

  1. Transfiera la muestra a una placa Petri (100 mm x 20 mm) que contenga solución de corte y, con herramientas quirúrgicas finas, retire cuidadosamente en la medida de lo posible las meninges restantes de la muestra(Figura 1D).
  2. Elija la mejor orientación de la muestra para producir rodajas con las características particulares del diseño experimental, y con una hoja de bisturí n.o 24, recorte una superficie plana para que sea la base pegada al disco de la muestra.
  3. Usando una cuchara de plástico desechable y delicados pinceles, recoja el fragmento de la placa Petri y seque el exceso de solución usando papel de filtro (seco por capilaridad y evite tocar el fragmento de tejido con papel).
  4. Usando superpegamento, conecte el tejido al disco de la muestra de vibratome hasta que se adhiera firmemente al disco y en contacto con el bloque de agarosa(Figura 1E).
  5. Coloque el disco de la muestra de vibratome (con el tejido correctamente unido) en la bandeja tampón del vibratome lleno de solución de corte que debe estar burbujeando durante todo el proceso.
  6. Fije el soporte del cuchillo en su lugar con la cuchilla de afeitar firmemente fijada.
  7. La solución de corte debe cubrir tanto la muestra como la cuchilla, sólo entonces comenzar a cortar(Figura 1F).
  8. Cortar la muestra en rodajas de 200 m.
    NOTA: Aunque algunos vibratomes cortan las muestras automáticamente, la observación cercana y los pequeños ajustes en la velocidad de corte durante el proceso pueden ayudar a producir mejores rodajas. Deseche las rodajas irregulares iniciales.
  9. Transfiera las rodajas de la bandeja tampón a una placa Petri con solución de corte y recorte los bordes sueltos y el exceso de mater blanco a una proporción de alrededor del 70% de corteza/30% de materia blanca.

6. Cultura

NOTA: Realice este paso en un gabinete de flujo laminar bajo un entorno estéril.

  1. Añadir 600 s l de medio de cultivo por poca (en una placa de 24 pocillos) e incubar durante al menos 20 min a 36oC y 5% deCO2 antes de chapar las rodajas.
  2. Placa una rebanada por pozo usando un pincel (Figura 1G).
  3. Si hay pozos no utilizados en la placa, llénelos con 400 ml de agua estéril.
  4. Incubar la placa a 36oC, 5%CO2.
    NOTA: El primer reemplazo medio debe hacerse entre 8-16 h después del enchapado dependiendo del tamaño de la rebanada.
  5. Suplemento 10 mL del medio de cultivo previamente preparado con factor neurotrófico derivado del cerebro de 50 ng/ml (BDNF).
    NOTA: Durante las primeras 8-16 h, las rodajas se incuban en 600 ml de medio para evitar la privación de nutrientes y la acidificación, ya que se acelera el consumo medio en esta fase. A partir del siguiente paso, el volumen de medio por pozo se ajusta a 400 s.
  6. Retire 333 ml del medio acondicionado de cada poca y agregue 133 ml de medio fresco suplementado con BDNF.
  7. Repita el proceso de reemplazo medio cada 24 horas reemplazando un tercio del medio acondicionado por un medio fresco complementado con BDNF.

7. Evaluar la salud, la morfología y la función en las rodajas cultivadas

NOTA: Para inducir la muerte celular con el propósito de la ilustración en los resultados representativos, algunas rodajas se sometieron a un tratamiento de 24 horas con el inductor de estrés oxidativo H2O2. Los pasos 7.1.2 y 7.1.3 describen el uso de H2O2 para inducir la muerte celular.

  1. Viabilidad celular
    NOTA: Un método simple y sencillo para evaluar neurotóxico/neuroprotección en cultivos de rebanadas desafiados es el 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltelium (MTT) ensayo36, que mide el porcentaje de células activas metabólicas en condiciones normales en comparación con las muestras tratadas.
    1. En el armario de flujo laminar, sustituya un tercio del medio por un medio fresco.
    2. A partir de una solución de stock de 30% H2O2, añada un volumen de2O2 por pozo para alcanzar la concentración final prevista (30 mM o 300 mM).
      NOTA: H2O2 se añadió después del cambio diario del medio para garantizar el suministro adecuado de nutrientes frescos antes del desafío.
    3. Incubar la placa durante 24 h a 36oC, 5%CO2.
      NOTA: Después del tratamiento con H2O2 (u otro estímulo tóxico de interés), los siguientes pasos describen la determinación de la viabilidad celular por el ensayo MTT.
    4. Añadir 40 l de solución MTT a una concentración final de 0,5 mg/ml a cada pocal de la placa.
    5. Incubar la placa a 36oC, 5%CO2 durante 3 h.
    6. Lave las rodajas con solución salina con fosfato (PBS) y transfiera a un microtubo.
    7. Retire cuidadosamente cualquier solución restante pipeteando.
    8. Pesar los microtubos que contienen las rodajas para determinar la masa de cada rebanada (esto es clave para normalizar las lecturas de absorbancia obtenidas).
      NOTA: Si es necesario, las muestras se pueden congelar (-20 oC) en esta etapa para su posterior procesamiento.
    9. Homogeneizar las rodajas en 200 ml de isopropanol/HCl utilizando un pestillo motorizado.
    10. Centrífuga a temperatura ambiente (RT) durante 2 min a 2600 x g.
    11. Recoger el sobrenadante y medir la absorbancia a 540 nm.
  2. Despolarización neuronal inducida por KCl
    NOTA: La fosforilación de la proteína quinasa mitógena activada (MAPK) que señala la proteína en cascada ERK, seguida de la hincha occidental, se puede utilizar para la cuantificación de la respuesta neuronal a la despolarización inducida por KCl37 .
    1. En el armario de flujo, sustituya el medio de cultivo por 300 ml de HBSS previamente equilibrado a 36 oC.
    2. Sustituya el HBSS por 300 ml de HBSS fresco previamente equilibrado a 36 oC.
    3. Incubar la placa a 36oC, 5%CO2 durante 15 min.
    4. Sustituya el HBSS por el HBSS fresco o por la solución despolarizante KCl de 80 mM (ambos a 36 oC) e incubar a 36 oC, 5% CO2 durante 15 min.
    5. Transfiera las rodajas de la placa a los microtubos. En este paso, los sectores se pueden almacenar a -20 oC para su posterior procesamiento.
    6. Preparar extractos de tejido en 150 l de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% tensioactivo no iónico; 0,1% de sulfato de dodecilo sódico; pH 7,5). Los extractos de centrífuga a 4 oC durante 10 min a 16000 x g,recogen el sobrenadante y determinan la concentración total de proteínas utilizando el método Bradford.
    7. Cargar 30 g de proteína total en una electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato sódico al 12% (SDS-PAGE).
    8. Después de la electroforesis, transfiera el contenido de gel a una membrana de nitrocelulosa.
    9. Después de bloquear la membrana con 5% de leche seca sin grasa en TBS más 0,1% de Tween, incubar con ratón anti-pERK (1:1,000) durante 16 h a 4 oC. Después del lavado, incubar durante 2 h a RT con conejo anti-ERK1/2 (1:1,000).
    10. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado en HRP adecuado a RT durante 1 h.
    11. Revelar con el sustrato hrP preferido.
  3. Evaluación morfológica
    NOTA: Además de la supervivencia celular y las evaluaciones funcionales, es importante analizar la morfología del tejido. Tenga en cuenta que la resección de la rebanada cultivada es un paso importante para producir tanto material de alta calidad como sea posible para el análisis morfológico.
    1. Fijación, crioprotección y resección de las rodajas
      1. Transfiera las rodajas de los pozos con un medio de cultivo a una nueva placa de 24 pocillos que contenga PBS.
      2. Retire el PBS y agregue 1 mL de 4% de paraformaldehído (PFA). Es importante que las rodajas se mantengan planas antes de agregar PFA. Incubar durante la noche a 4oC.
      3. Retire cuidadosamente la solución de PFA y agregue 1 ml de solución de sacarosa al 30%. Incubar durante 48 h a 4oC.
      4. Ajuste el microtome de congelación a -40 oC.
      5. Prepare una base de sacarosa en la etapa del microtome donde se deben colocar las rodajas(Figura 2A). Dejar congelar completamente y cortar cuidadosamente parte de la sacarosa congelada para producir una superficie plana sobre la que se colocará la rebanada.
      6. Coloque cada rebanada sobre una película de plástico estirada y use un pincel para aplanar el tejido.
      7. Transfiera la rebanada estirada a la base de sacarosa congelada en un solo movimiento.
        NOTA: No es posible mover la rebanada una vez que está sobre la base de sacarosa congelada. Realice este paso de transferencia con cuidado.
      8. Deje reposar la rebanada durante 5-10 min para una congelación adecuada.
      9. Cortar la rebanada en secciones de 30 m.
      10. Transfiera las secciones de 30 m a una placa de Petri que contenga PBS.
      11. Proceder al protocolo de histología más adecuado al diseño experimental.
        NOTA: Las secciones de 30 m se pueden utilizar fácilmente para la inmunohistoquímica de flotación libre, montadas en diapositivas de microscopía para su posterior histología o almacenadas en solución anticongelante a -20 oC.
    2. Immunohistochemistry
      NOTA: Los protocolos estándar de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia varían entre los laboratorios. Para obtener una versión detallada del protocolo utilizado aquí, consulte Horta et al.38. Los anticuerpos primarios utilizados para las inmunomanchas presentados en la Figura 2 incluyen núcleos neuronales (NeuN), marcador de neurona sano maduro, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), marcador de atorces, adaptador de unión de calcio ionizado (Iba-1) y microglia Marcador.
      1. Incubar los cortes en solución de bloqueo (por ejemplo, 2% de suero de burro normal en PBS) durante 40 min.
      2. Incubar durante la noche con anticuerpo primario bajo agitación leve a 4oC.
      3. Después del lavado con PBS, incubar durante 120 minutos con anticuerpo secundario biotinilado bajo agitación leve en RT.
      4. Después de lavar con PBS, incubar a RT durante 120 min con conjugado de avidina-peroxidasa(Tabla de Materiales).
      5. Revelar con DAB + 0.04% de amonio de níquel.
      6. Monte las secciones teñidas en los portaobjetos de microscopía recubiertos de gelatina y déjelos secar al aire. Deshidratar en etanol, diofonizar en xileno, terminar con medio de montaje(Tabla de Materiales),cubrir con un cubreobjetos e imagen.

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Resultados

Un aspecto crítico para evaluar la calidad y la salud de las rebanadas cultivadas es la presencia y morfología típica de los tipos de células neurales, neuronas y células gliales esperadas. La arquitectura típica de la laminación cortical humana se observó en una rebanada en DIV4, revelada por inmunoetiquetado neuronal (Figura 2D). Además, también se observó la presencia esperada de microglia y astroglia(Figura 2B,C). Estos resu...

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Discusión

Este protocolo para producir cultivos de sectores flotantes y a corto plazo es un método alternativo para el cultivo de rebanadas neocorticales humanas adultas. Tal protocolo para cultivos de sectores puede ser susceptible de estudios (pero no restringido a) optogenética1,44,45, electrofisiología2,3,4,5

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. y Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) y FAEPA. G.M.A. posee una beca de maestría de FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. tiene una beca de investigación CNPq. Agradecemos a los pacientes y sus familias por donar los tejidos resecados para este estudio. Nos gustaría reconocer el apoyo de los residentes, enfermeras, técnicos y el equipo del CIREP, del Hospital Clínico de la Escuela de Medicina Ribeir-o Preto, de la Universidad de Sao Paulo, quienes ayudaron en varias etapas del proceso.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-PropanolMerck1096341000
Acrilamida/Bis-Acrilamida, solución al 30%Sigma AldrichA3449 
AgarosaSigma AldrichA9539
Persulfato de amonioSigmaA3678-25G
Anfotericina BGibco15290-018
Anticuerpo anti-ERK 2 (conejo)Santa Cruz Biotecnologysc-154Dilución 1:1.000 en BSA 2.5%
Anticuerpo anti-pERK (ratón)Santa Cruz Biotecnologysc-7383Dilución 1:1.000 en BSA 2.5%
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA7906
Bradford 1x Reactivo de coloranteBioRad500-0205
EDTASigmaT3924Utilizado en tampón RIPA
GlucosaMerck108337
GlutamaxGibco35050-061
Sales equilibradas de HankSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
Ácido clorhídricoMerck1003171000
Peróxido de hidrógeno (H2O2)Vetec194
IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (anti-ratón)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000Utilizado en tampón RIPA
Neurobasal AGibco10888-022
Leche en polvo descremada (Molico)NestléSe utiliza para el bloqueo de membranas
Tampón PBS pH 7,2Laborclin590338
Penicilina/EstreptomicinaSigma AldrichP4333
Cloruro de potasioMerck1049361000
Prime Western Blotting Reactivo de detecciónRPN2232
Rabbit IgG, Ab entero ligado a HRP (anti-conejo)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750Utilizado en tampón RIPA
TEMEDGE 17-1312-01
Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378Utilizado en tampón RIPA
Triton x-100SigmaX100Utilizado en tampón RIPA
Millipore de agua ultrapuraAgua estéril, derivada del sistema de purificación de agua MiliQ
Equipo y material
24 pocillosplacas CorningCL S3526Fondo plano con tapa
Amersham Potran Premium (membrana de nitrocelulosa) GE29047575
Mezcla de cárbogo WhiteMartins95% O2, 5% CO2
Incubadora de CO2New Brunswick ScientificCO-24Incubación de rodajas 5% CO2, 36º C
Lector de microplacasMolecular Devices
MicrotubosGreiner0016081,5mL
Microtubo Mortero motorizadoKimble Chase
Cuchara de plástico Tamañode una cuchara de postre Cuchilla de
afeitarBicCromo Platino, utilizada en el corte con vibratomo
Hoja debisturíBecton Dickinson (BD)Número 24Utilizado para cortar tejidos; recomendado del mismo tamaño o más pequeño
Superglue (Loctite Super Bonder)HenkelComposición: Etilcianoacrilato; Ácido 2-propenoico; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolímero
Vibratome Leica14047235612 - VT1000S
Nombre del material/ Equipo para inmunohistoquímica
Anticuerpo anti-NeuN (ratón)Millipore MAB377Dilución 1:1.000 en tampón de fosfato
Anticuerpo anti-GFAP (ratón)MerckMAB360Dilución 1:1.000 en tampón de fosfato
Anticuerpo anti-Iba1 (conejo)AbcamEPR16588 - ab178846Dilución 1:2.000 en tampón de fosfato
Anticuerpo IgG anti-ratón biotinilado (H+L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EtanolMerck1.00983.1000
Gelatina Synth 00G1002.02.AEUtilizado para el recubrimiento de portaobjetos
MicrotomoLeica SM2010REquipado con etapa de congelación (BFS-10MP, Physiotemp), ajustado a -40º C
Suero de burro normalJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehídoSigma Aldrich158127
IgG de conejo, Ab entero ligado a HRP (anti-conejo)GENA934-1ML
Portaobjetos (Star Frost)Knittel GlaserPortaobjetos recubiertos de gelatina
SacarosaVetec60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidasa, Estándar)VectorPK-4000, Kit Estándar
Sintetizador deXileno01X1001.01.BJ
GE

Referencias

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