Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Artur Fernandes; Niele  Dias Mendes; Glaucia  Maria Almeida; Giovanna  Orlovski Nogueira; Carla de Moraes Machado; Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior; João  Alberto Assirati Junior; Norberto Garcia-Cairasco; Luciano Neder; Adriano Sebollela

doi:10.3791/59845

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Artículo de método

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

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DOI:

10.3791/59845

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5 de noviembre de 2019

Artur Fernandes¹^,² , Niele Dias Mendes¹^,³ , Glaucia Maria Almeida¹ , Giovanna Orlovski Nogueira¹ , Carla de Moraes Machado⁴ , Jose de Anchieta de Castro Horta-Junior⁴ , João Alberto Assirati Junior⁵ , Norberto Garcia-Cairasco² , Luciano Neder³ , Adriano Sebollela¹

¹Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ²Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ³Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, ⁴Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, ⁵Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Resumen

Las culturas organotípicas, o de rebanadas, se han empleado ampliamente para modelar aspectos del sistema nervioso central que funcionan in vitro. A pesar del potencial de los cultivos de rebanadas en neurociencia, estudios que utilizan tejido nervioso adulto para preparar tales cultivos son todavía escasos, particularmente los de sujetos humanos. El uso de tejido humano adulto para preparar cultivos de rebanadas es particularmente atractivo para mejorar la comprensión de las neuropatologías humanas, ya que poseen propiedades únicas típicas del cerebro humano maduro que carece de rodajas producidas a partir de roedores (generalmente neonatales) tejido nervioso. Este protocolo describe cómo utilizar el tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva para preparar cultivos de rebanadas a corto plazo y flotantes. También se presentan procedimientos para mantener y realizar ensayos bioquímicos y de biología celular utilizando estos cultivos. Los resultados representativos demuestran que la laminación cortical humana típica se conserva en rodajas después de 4 días in vitro (DIV4), con la presencia esperada de los principales tipos de células neurales. Además, las rodajas en DIV4 se someten a una muerte celular robusta cuando se les reta con un estímulo tóxico (H₂O₂), lo que indica el potencial de este modelo para servir como plataforma en los ensayos de muerte celular. Este método, una alternativa más simple y rentable al protocolo ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana, se recomienda principalmente para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de enfermedades cerebrales asociadas a la edad. Por último, aunque el protocolo se dedica al uso de tejido cortical recogido de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico de epilepsia del lóbulo temporal farmacorresistente, se argumenta que el tejido recogido de otras regiones/condiciones cerebrales también debe considerados como fuentes para producir cultivos similares de sectores flotantes.

Introducción

El uso de muestras humanas en la investigación es inequívocamente una gran opción para estudiar las patologías cerebrales humanas, y las técnicas modernas han abierto nuevas formas de experimentación robusta y ética utilizando tejido derivado del paciente. Métodos como cultivos organotípicos/rebanadas preparados a partir del cerebro humano adulto se han utilizado cada vez más en paradigmas como la optogenética¹, la electrofisiología²^,³^,⁴^,⁵, plasticidad ⁶^,⁷