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Summary

El objetivo de este método es generar un modelo in vivo de angiogénesis tumoral mediante células tumorales de mamíferos xenografting en un embrión de pez cebra que tiene vasos sanguíneos marcados fluorescentemente. Mediante la toma de imágenes del xenoinjerto y los vasos asociados, se puede obtener una medición cuantitativa de la respuesta angiogénica.

Abstract

La angiogénesis tumoral es un objetivo clave de la terapia contra el cáncer y este método ha sido desarrollado para proporcionar un nuevo modelo para estudiar este proceso in vivo. Un xenoinjerto de pez cebra se crea implantando células tumorales de mamíferos en el espacio perivitelina de dos embriones de pez cebra de post-fertilización de días, seguido de medir la extensión de la respuesta angiogénica observada en un punto final experimental de hasta dos días postimplantación. La ventaja clave de este método es la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica del huésped de pez cebra al injerto. Esto permite un examen detallado de los mecanismos moleculares, así como de la contribución del huésped contra el tumor a la respuesta angiogénica. Los embriones xenoinjerados pueden ser sometidos a una variedad de tratamientos, como la incubación con posibles fármacos anti-angiogénesis, con el fin de investigar estrategias para inhibir la angiogénesis tumoral. La respuesta angiogénica también puede ser imagen en vivo con el fin de examinar procesos celulares más dinámicos. La técnica experimental relativamente poco exigente, los costos de mantenimiento baratos del pez cebra y la breve línea de tiempo experimental hacen que este modelo sea especialmente útil para el desarrollo de estrategias para manipular la angiogénesis tumoral.

Introduction

La angiogénesis es una de las señas de identidadclásicas del cáncer y representa un objetivo de la terapia contra el cáncer 1,^2. Para estudiar este proceso, se han creado modelos de xenoinjerto de cáncermediante la implantación de células tumorales de mamíferos en animales como ratones 3. También se ha desarrollado un modelo de xenoinjerto de pez cebra, que implica la implantación de células tumorales en 2 días después de la fertilización (dpi) peces cebra que resulta en el crecimiento rápido de los vasos sanguíneos del pez cebra en el xenoinjerto⁴.

Este protocolo describe un modelo de xenoinjerto tumoral de embrión de pez cebra in vivo en el que la respuesta angiogénica se puede cuantificar con precisión en todo el xenoinjerto. Este método permite al investigador examinar, in vivo, los mecanismos moleculares que sustentan la respuesta angiogénica tumoral. La traibilidad genética del pez cebra permite interrogar la contribución del huésped, mientras que la selección de diferentes líneas celulares tumorales permite examinar también la contribución tumoral a la angiogénesis^5,6,7. Además, como las larvas de pez cebra son permeables a moléculas pequeñas, se pueden utilizar inhibidores de víaespecíficos específicos o se pueden analizar bibliotecas de medicamentos para identificar nuevos inhibidores de la angiogénesis tumoral^{8,9,10, 11}.

El modelo de xenoinjerto de embrión de pez cebra presenta ventajas únicas en comparación con otros modelos de xenoinjerto de mamíferos. Los xenoinjertos de pez cebra son más baratos y fáciles de realizar,se puede examinar un gran número de animales y las imágenes de células vivas permiten un examen detallado del comportamiento celular 4. A diferencia de otros modelos in vivo, que requieren hasta varias semanas para observar un crecimiento significativo de los vasos, se puede observar angiogénesis en xenoinjertos de peces cebra dentro de las 24 horas después de la implantación^3,4. Sin embargo, la falta de un sistema inmunitario adaptativo en el pez cebra embrionario, aunque beneficioso para mantener el xenoinjerto, significa que no se puede examinar la respuesta inmune adaptativa y su contribución a la angiogénesis tumoral. Además, la falta de células estromales tumorales, la incapacidad para implantar ortotótopopicamente el tumor y la diferencia en la temperatura de mantenimiento entre el pez cebra y las células de mamíferos son posibles debilidades de este método. Sin embargo, la amenabilidad de este modelo para la toma de imágenes en vivo y la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica hace que sea excepcionalmente beneficioso para el estudio de los procesos celulares que regulan la angiogénesis tumoral in vivo.

Protocol

1. Preparación de agujas de microinyección

1. Encienda un tirador de micropipeta y ajuste los siguientes parámetros (calibrados para el modelo de tirador de micropipeta enumerados en Tabla de materiales:Calor, 680; Tire, 75; Velocidad, 40; Tiempo, 55; Presión: 530.
2. Asegure un capilar de vidrio borosilicato en el tirador de micropipetas y tire del capilar para hacer dos agujas. Repita el procedimiento para tantas agujas como desee.

2. Cultivo celular para la implantación

NOTA: Cuando se utiliza este protocolo, cualquier línea celular de cáncer de mamífero sin trabajo se puede utilizar para la implantación en embriones de pez cebra como xenoinjertos. Sin embargo, hay mucha variación en larespuesta angiogénica inducida entre las diferentes líneas celulares 5,^11,12. Se ha demostrado que las células de melanoma murino B16-F1 inducen una fuerte respuesta angiogénica en los embriones de pez cebra¹¹ y, por lo tanto, son adecuadas para su uso en este protocolo.

1. Cultivar células B16-F1 a 37 oC en un matraz de 75 cm² utilizando medios MEM-o complementados con suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de 10% (v/v) y penicilina /Estreptomicina, cada una a una concentración final de 100 g/ml.
2. Retire el medio de un matraz de 75 cm² de células B16-F1 confluente al 95-100% de las células B16-F1 y lave las células en 5 ml de solución salina con fosfato a temperatura ambiente (PBS).
3. Retirar el PBS de 5 ml, añadir 2 ml de ácido trypsin/etilendiaminetetraacético a temperatura ambiente (EDTA) e incubar a 37oC durante 60 s.
4. Toque el lado del matraz para determinar si las células están empezando a perder su fijación a la parte inferior del matraz.
5. Añadir 8 ml de temperatura ambiente MEM-o con 10% FBS en el matraz, pipeta contra el interior del matraz para llevar las células que permanecen adheridas a la parte inferior del matraz en suspensión y pipeta la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
6. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min, aspirar el medio y proceder al etiquetado de las células con tinte.

3. Etiquetado de células B16-F1 con tinte fluorescente

NOTA: Para diferenciar entre las células tumorales implantadas y otras células del embrión, las células tumorales deben estar etiquetadas con un tinte fluorescente adecuado antes de la implantación. Este paso se puede omitir si las celdas ya expresan reporteros fluorescentes.

1. Incubar 2 ml de medios MEM-o libres de suero a 37 oC.
2. Preparar una solución en stock del tinte elegido y diluirla en 2 ml preincubados de medios MEM-o libres de suero para realizar una concentración viable (ejemplos de tintes y concentraciones apropiadas para las células B16 F1 se proporcionan en la Tabla de Materiales).
3. Pipetear 1 ml de la solución de tinte en el pellet celular (del paso 2.6), mezclar a fondo mediante pipeteo, luego añadir el otro 1 ml de solución de tinte y mezclar.
4. Incubar las células y la mezcla de colorante a 37oC durante 40 min, mezclando suavemente agitando a 20 min.
5. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min.
6. Aspirar el sobrenadante y lavar las células etiquetadas pipeteando con 5 ml de PBS.
7. Centrifugar la suspensión celular de nuevo a 800 x g, 4-8 oC durante 5 min, aspirar el sobrenadante y colocar las células sobre hielo hasta que estén listas para la implantación.
   NOTA: El gránulo celular del tumor final debe tener un volumen de 20-40 l.

4. Preparación de embriones para la implantación

NOTA: Elija una línea transgénica de peces cebra que tenga vasos sanguíneos etiquetados fluorescentemente (por ejemplo, kdrl:RFP, fli1a:EGFP, etc.) ^{13 , 14}.

1. Dos días antes de la implantación, engendrar el pez cebra como se describió anteriormente y recoger los embriones^15.
   NOTA: Como no estamos inyectando estos peces en una etapa temprana, no es necesario recogerlos dentro de los 20 minutos de desove como se describe en Rosen et al.¹⁵, pero pueden ser recogidos después de unas horas de apareamiento.
2. Coloque los embriones en platos de cultivo de 100 mm a una densidad de aproximadamente 100 embriones/plato.
3. Añadir 50 ml de E3¹⁶ (complementado con 5 ml de una solución acuosa de 1% p/v de azul metileno para evitar la contaminación) a cada plato, limpiar los embriones o desechos muertos y mantener el plato en una incubadora oscura a 28 oC hasta que esté listo para la inyección.
4. A 1 día después de la fertilización (dpf), añadir 1-fenil-2-tiourea (PTU) a cada plato para producir una concentración final de 30 mg/L PTU en E3. La PTU previene la pigmentación, que puede interferir con la capacidad de ver las células tumorales y los vasos sanguíneos.
5. A 2 dpf, utilice agujas o pinzas para desenrodar manualmente cualquier embrión que esté desishado. Con un microscopio fluorescente, seleccione tantos embriones transgénicos como sea necesario para la xenografting (50-200).
6. Antes de la implantación, anestesiar los embriones seleccionados en una solución de 300 g/ml de tricaína en E3 para evitar el movimiento durante el procedimiento de inyección.
7. Llene un plato de 35 mm con un 2% de metilcelulosa en Solución E3 a una cuarta parte del volumen del plato.
8. Utilice una pipeta de transferencia para colocar aproximadamente 50 embriones (minimizando el volumen de la solución E3 también transferida) a la metilcelulosa.
9. Utilice una punta de pipeta Microloader para organizar los embriones de modo que todos estén orientados verticalmente, con las cabezas hacia la parte superior y con el lado izquierdo hacia arriba.
   NOTA: Los pasos 4.7-4.9 también se pueden llevar a cabo organizando los embriones en un bloque de agarosa como se describió anteriormente^17,pero en nuestra experiencia, los embriones se organizan más fácilmente cuando se agrupan en metilcelulosa.

5. Inyección de perivelina de células cancerosas de mamíferos en embriones de 2 dpf

NOTA: Para asegurar que las células se agrupen como un injerto cuando se implantan, las células deben mezclarse junto con una mezcla de matriz extracelular (ECM). Hemos descrito los pasos para hacer una mezcla de celda/ECM al utilizar una mezcla de ECM a la que se hace referencia en la Tabla de Materiales. Si se utiliza una matriz alternativa, los pasos deben ajustarse en consecuencia.

1. Divida un stock de ECM en alícuotas de 100 ol en tubos de 500 ml y guárdelo a -20 oC hasta que sea necesario.
2. Descongelar una alícuota de ECM y añadir 100 l de PBS para diluir la mezcla al 50% (v/v).
   NOTA: El 50% ECM diluido se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
3. Mezclar el 50% de ECM bien con el pellet celular B16-F1 (del paso 3.7) pipeteando y revolviendo, para producir una mezcla de células / ECM en una proporción de 2:1 y almacenar la mezcla en hielo.
4. Con una pipeta microcapilar, tome una toma de 3-10 ml de células.
5. Inserte cuidadosamente la punta de la pipeta en una aguja y expulse la mezcla B16-F1/matriz en el extremo de la aguja.
6. Inserte la aguja en el porta agujas e incline en un ángulo de 45o con respecto al plato.
7. Romper la punta de la aguja usando pinzas para hacer un agujero lo suficientemente grande como para que las células sean expulsadas de la aguja sin apretar las células.
8. Encienda el cilindro de aire presurizado conectado al aparato de inyección y gire el inyector en modo “continuo” momentáneamente para empujar las células a la punta de la aguja.
9. Retire la aguja del plato y sustituya el plato por un hemocitómetro.
10. Coloque una gota de aceite en el hemocitómetro e inyecte la aguja una vez en esta gota.
11. Cuente el número de células expulsadas con un solo pulso utilizando el hemocitómetro y calibre la aguja para expulsar aproximadamente 150 células por pulso ajustando la duración del pulso.
    NOTA: La expulsión de esta cantidad de células por pulso requerirá varios pulsos para implantar un xenoinjerto exitoso. Esto le dará al investigador un mayor control sobre el tamaño final del xenoinjerto tumoral al permitirle ajustar moderadamente el número/ubicación de pulsos para hacer cada xenoinjerto más grande o más pequeño como lo considere conveniente.
12. Apunte la aguja hacia el saco de yema de un embrión y empújelo a través del saco de yema en dirección ventral hasta que la punta de la aguja haya salido del saco de yema y esté empujando la epidermis embrionaria en el lado ventral del embrión justo después del corazón.
    NOTA: Coloque la aguja de modo que entre en el saco de yema embrionaria anterior a la ubicación final donde se expulsarán las células. Esto asegurará que las células serán expulsadas en una dirección lejos del corazón, disminuyendo la probabilidad de inyectar las células en la vena cardinal común.
13. Empuje cuidadosamente la punta de la aguja hacia adelante un poco hasta que haya creado un espacio (espacio perivielino) entre la epidermis y la membrana del saco de yema y luego presione el inyector para expulsar parte de la mezcla celular en el espacio perivielline.
14. Repita los pulsos hasta que se hayan inyectado 500-800 células en el espacio perivelinal, creando una protuberancia visible que se extiende al menos la mitad del camino a lo largo de la parte inferior del saco de yema, luego retire la aguja del embrión.
    NOTA: Si las células bloquean la aguja o están dañadas durante la inyección, purgue la aguja cambiando momentáneamente al modo “continuo” y luego de nuevo al “pulso”. Esto debe desbloquear la aguja y permitir que las células se expulsen libremente y sin daños.
15. Continúe haciendo lo mismo para todos los embriones en el plato, cargando una nueva aguja con células tumorales cuando sea necesario.
16. Después de inyectar todos los embriones, retire la aguja y empuje todos los embriones juntos usando una punta de pipeta microcapilar para que puedan ser pipetados con la menor metilcelulosa posible.
17. Transfiera los embriones a un plato de recuperación que contenga E3 (con PTU y azul de metileno) y lávelos pipeteando suavemente E3 alrededor de los embriones.
    NOTA: En este punto, los embriones xenoinjerados pueden ser tratados con medicamentos separándolos en diferentes platos y añadiendo una solución de medicamentos a un plato y una solución de control (como el vehículo de drogas) al otro plato.
18. Incubar los embriones a 34 oC y realizar controles dos veces al día para eliminar embriones muertos o edemasos del plato.
    NOTA: Se encontró que 34 oC era la temperatura óptima para la vascularización de xenoinjertos y también ha sido utilizado por otros estudios que emplean el modelo¹⁸de angiogénesis de xenoinjerto embrionario de peces cebra. Los xenoinjertos se pueden tomar imágenes en cualquier momento hasta 48 hpi (horas después de la implantación).

6. Imágenes en vivo

1. A 48 hpi, identifique 3-5 embriones sanos sin edema. Anestetizarlos en 150 g/ml de tricaína y montarlos lateralmente en agarosa 1% Bajo Punto de Fusión (LMP) como se describió anteriormente¹⁹.
   NOTA: Como la agarosa se solidifica, utilice una punta de pipeta microcapilar para mantener los embriones posicionados lateralmente.
2. Encienda el microscopio confocal, el controlador del microscopio, los láseres y el software informático para controlar el microscopio.
3. Coloque el plato en un microscopio confocal. Usando un aumento de 20x, lente objetivo de inmersión de agua, coloque el xenoinjerto en el centro del campo usando imágenes de campo brillante.
4. Seleccione los láseres de excitación que sean apropiados para detectar el tinte utilizado para etiquetar las células tumorales y el fluoróforo utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos del pez cebra.
5. Ajuste la ganancia de cada láser a un nivel que permita la detección de las células tumorales y los vasos sanguíneos.
   NOTA: Una vez establecidos los ajustes confocales, asegúrese de que se mantengan inalterados durante todo el experimento para que se puedan hacer comparaciones entre xenoinjertos.
6. Usando el canal láser apropiado para las células tumorales, determine un volumen a fotorgarse que incluya todo el volumen del xenoinjerto, permitiendo al menos una o dos secciones ópticas a ambos lados del injerto. Utilice intervalos de sección que se encuentran a unos 5 m de distancia para crear una pila z.
   NOTA: Es esencial que la pila z contenga todo el volumen del xenoinjerto.
7. Usando imágenes de dos canales, imagenide tanto el xenoinjerto tumoral como los vasos sanguíneos. Repita los pasos 6.6-6.7 para cada larva que se va a tomar una imagen.

7. Imágenes de lapso de tiempo

NOTA: Este modelo es muy adecuado para la creación de imágenes de procesos celulares dinámicos debido a su transparencia y la disponibilidad de transgénicos de pez cebra que etiquetan fluorescentemente diferentes tipos de células. Esto hace que la creación de imágenes de lapso de tiempo sea una aplicación clave de este modelo.

1. Encienda la cámara ambiental y establézquela a 34 oC al menos 2 h antes de la toma de imágenes. Si la cámara no está humidificada, agregue platos de agua.
2. Anestetiza 3-5 embriones (usando 120 g/ml de tricaína a 2 dpf y 100 g/mL de tricaína a 3 dpf) y embistelos lateralmente en un 0,8% de agarosa LMP para imágenes de lapso de tiempo según el protocolo descrito anteriormente¹⁹.
   NOTA: Como la agarosa se solidifica, utilice una punta de pipeta microcapilar para mantener los embriones posicionados lateralmente.
3. Configure el equipo y la imagen del xenoinjerto como se describe en los pasos 6.2-6.7, adquiriendo pilas z del xenoinjerto a intervalos de 10 minutos.
   NOTA: El embrión debe mantenerse a 34 oC, ya que se está realizando la imagen, y el E3 en la parte superior de las larvas del agar debe comprobarse y complementarse ocasionalmente para asegurarse de que no se seque.

8. Cantidad de la respuesta angiogénica al xenoinjerto de pez cebra

NOTA: Los pasos siguientes utilizan el software de análisis de imágenes 3D. Los pasos específicos variarán dependiendo del software utilizado.

1. Transfiera los archivos de imagen confocal z-stack de un xenoinjerto tumoral a una nueva carpeta en el software de análisis de imágenes 3D.
   NOTA: Con el fin de cuantificar los niveles de vascularización tumoral, los protocolos de medición deben crearse con ajustes calibrados para que puedan utilizarse para medir el volumen del tumor o el volumen del recipiente para todos los xenoinjertos.
2. Para crear el protocolo “Tumor Volume” para medir el volumen de los xenoinjertos tumorales, vaya a la pestaña “Medida” en el menú superior y, a continuación, arrastre los protocolos denominados “Buscar objetos” de la lista de protocolos que aparece en el lado izquierdo de la ventana hasta el espacio que se titula “Arrastrar tareas aquí para hacer mediciones”.
3. Asegúrese de que este protocolo está configurado para medir objetos en el canal del tumor y, a continuación, arrastre los protocolos denominados “Clip to ROIs” y “Make ROI from Population” de la lista de protocolos al espacio “Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones”. Asegúrese de que estos dos comandos se aplican a los objetos identificados por “Buscar objetos.”
4. Antes de calibrar la configuración de este protocolo, vaya al menú desplegable situado encima de la etiqueta “Modo” en la parte superior izquierda de la ventana y seleccione la vista “Enfoque extendido”.
5. Anule la selección de los canales no tumorales en el panel del extremo derecho haciendo clic en el círculo negro debajo de cada encabezado de canal, de modo que solo se pueda ver el canal tumoral. Utilice la herramienta “Mano a mano alzada” en la parte superior de la ventana para dibujar una “región de interés” (ROI) alrededor de todo el volumen del tumor.
   NOTA: Tenga cuidado de asegurarse de que ninguno de los tumores se quede fuera del ROI. Esto proporcionará una región en la que realizar el protocolo mientras calibra la configuración.
6. Seleccione la etiqueta “Resumen” en el panel debajo de la imagen y establezca la opción “Mostrar” para mostrar “Población 2”. Para calibrar, haga clic en el asterisco en la tarea Buscar objetos, que abrirá la ventana de configuración. Ajuste el “Umbral” usando “Intensidad” y determinando el umbral “Inferior” hasta que solo se seleccionen las células tumorales y no la fluorescencia de fondo.
   NOTA: Esto es importante para que sólo se detecte la fluorescencia de las células tumorales en el ROI seleccionado (dibujado en 8.5) y no se mida ninguna de las fluorescencias de fondo.
7. Determine el “Tamaño mínimo del objeto” de modo que solo se midan las celdas intactas en lugar de los elementos más pequeños de los desechos de celda (por ejemplo, estableciendo el “Tamaño mínimo del objeto” como 100 m³). Guarde este protocolo como “Volumen de tumor” haciendo clic en la pestaña Medidas en el menú superior y haciendo clic en “Guardar protocolo”, y utilice la misma configuración para medir todos los xenoinjertos.
8. Para medir el volumen de los vasos sanguíneos asociados al xenoinjerto, tendrá que crear un nuevo protocolo. Vaya al menú superior, haga clic en la pestaña Dimensiones y haga clic en “Borrar protocolo”. Arrastre las tareas “Buscar objetos” y “Recortar a ROI” al espacio que se titula “Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones” para este protocolo.
9. Asegúrese de que el primer comando está configurado para medir objetos en el canal de los vasos sanguíneos y que el siguiente comando está configurado para aplicarse a los objetos identificados por el primer comando. A continuación, anule la selección de los canales no vasculares en el panel derecho para que solo se puedan ver los vasos sanguíneos.
10. Determine la configuración del “Volumen del buque” de manera similar a la del protocolo “Volumen del tumor” y guarde este protocolo como “Volumen del buque” (véase 8.6-8.7).
11. Despeje el protocolo y dibuje un ROI alrededor del xenoinjerto, teniendo cuidado de no incluir ninguna autofluorescencia no tumoral. Mida la suma del volumen de los objetos en el canal tumoral dentro de este ROI haciendo clic en la pestaña Dimensiones, seleccionando el comando “Restaurar protocolo” y eligiendo el protocolo “Tumor Volume”.
12. Usando el nuevo ROI hecho por el protocolo “Tumor Volume”, utilice el protocolo “Vessel Volume” para medir el volumen total de objetos en el canal del buque dentro de este ROI haciendo clic en la pestaña Medidas, seleccionando el comando “Restaurar Protocolo” y eligiendo el comando “Recipiente” Volume”.
13. Divida el volumen del vaso por el volumen del tumor y multiplique la respuesta por 100 para obtener un valor porcentual de la vascularización del injerto.
14. Repita los pasos 8.11 a 8.13 para todos los demás xenoinjertos.

Representative Results

Discussion

El primer paso crítico en el protocolo es la implantación de células tumorales. Es esencial que las células se inyecten en un lugar que permita que el xenoinjerto se implante con éxito en el embrión sin hacer que el embrión sea edematoso. Una inyección demasiado anterior puede permitir que las células se muevan hacia el corazón, bloqueando el torrente sanguíneo y provocando edema, mientras que una inyección demasiado posterior dará lugar a un xenoinjerto mal implantado. Una inyección anterior se evita mejor insertando la aguja a través del saco de yema en una dirección anterior a posterior para que esté apuntando lejos del corazón a medida que se inyecta. Una inyección posterior se evita mejor inyectando las células en un lugar en la mitad anterior de la parte redonda del saco de yema. Además, las células deben inyectarse ventral al saco de yema y no lateral a él, ya que la ubicación lateral es más difícil de ver y posteriormente la imagen. Una vez que el investigador es razonablemente experto en este proceso, aproximadamente 200-300 embriones pueden ser implantados con xenoinjertos cada día. La toma de imágenes de la respuesta angiogénica tardará más tiempo debido al tiempo necesario para montar e imaginar los xenoinjertos; la imagen de 15-20 xenoinjertos tarda aproximadamente una hora en utilizar un microscopio confocal de escaneo láser estándar.

El segundo paso crítico es la medición de la vascularización del injerto utilizando el software de análisis de imágenes 3D. Se requiere la cuantificación por volumen tumoral, ya que es difícil obtener xenoinjertos de tamaño consistente a través de la microinyección. Es necesario calibrar cuidadosamente la configuración de los protocolos de software y utilizarlos de forma consistente para obtener mediciones cuantitativas precisas e imparciales para todos los experimentos. Establecer el umbral mínimo de intensidad (tanto para el volumen del tumor como para el volumen del tumor) es una parte importante de este paso, ya que permite que el protocolo discrimine correctamente entre la fluorescencia que forma parte del tumor/vasos y la fluorescencia de fondo. Dibujar el ROI alrededor del xenoinjerto tumoral para incluir sólo el xenoinjerto tumoral y no cualquier parte brillante de autofluorescencia del embrión (como el saco de yema) también es importante; la inclusión accidental de regiones de autofluorescencia no tumoral o vasos sanguíneos no tumorales en el ROI dará lugar a que estas partes se midan como parte de “Volumen de tumor” o “Volumen de recipientes tumorales”, creando imprecisiones significativas en el cálculo final. Siempre hay una gran variación en la respuesta angiogénica (ver Figura 1F),sin embargo, en lugar de ser una limitación del modelo, esto puede reflejar simplemente la varianza natural en la densidad de los vasos tumorales observada tanto en pacientes humanos como en xenoinjertos murinos ^{23 , 24}. La cuantificación de la vascularización del injerto en 60 xenoinjertos tomará aproximadamente 1 h.

La selección cuidadosa de la línea celular tumoral también es importante, ya que hay una amplia variación en la respuesta angiogénica inducida entre diferentes líneas celulares de mamíferos, que puede estar relacionada con los diferentes niveles de moléculas pro-angiogénicas producidas por estas células^{4 , 11}. En nuestras manos, las células de melanoma de ratón B16-F1 proporcionan una respuesta angiogénica robusta, posiblemente debido al alto nivel de secreción de VEGFA de estas células¹¹. Posibles modificaciones a este protocolo serían el uso de células de melanoma de pez cebra, lo que permitiría bajar la temperatura del ensayo a 28o y, por lo tanto, sería óptima tanto para el huésped como para el tumor²⁵ o el uso de células cancerosas que sobreexpresan factores de crecimiento pro-angiogénicos como FGF^4,7,20.

Algunas de las ventajas de este modelo se encuentran en su corto período de tiempo, bajo costo, y la relativa facilidad con la que se puede llevar a cabo el procedimiento de xenotrasplante en comparación con otros modelos in vivo como xenoinjertos murinos, todos los cuales hacen que sea altamente susceptible de ser utilizado para estudios a gran escala (es decir, pantallas químicas para compuestos antiangiogénicos²⁶). La capacidad de imaginar en vivo el modelo y la disponibilidad de peces transgénicos con vasos sanguíneos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células permite a los investigadores estudiar los detalles del proceso de angiogénesis (como la brotación de vasos) así como las células celulares interacciones (como las interacciones macrófagos-endoteliales) que tienen lugar durante la angiogénesis en este modelo^11,20,27. Como la normalización del vaso es también un objetivo clave de la terapia antiangiogénica, la imagen en vivo de alta resolución de la red vascular en los xenoinjertos significa que este modelo tiene el potencial de identificar tratamientos dirigidos a este objetivo. La tortuosidad de la red podría examinarse contando el número de puntos de rama de los buques, mientras que la morfología de los buques podría examinarse midiendo la variación en la anchura del recipiente, permitiendo probar y evaluar los tratamientos de pronormalización en este modelo^28. Además, la microangiografía por fluorescencia se puede utilizar para determinar la patencia y la integridad de los vasos tumorales^29. La traibilidad genética del pez cebra también significa que puede ser modificado genéticamente para examinar el papel de varias vías de señalización del huésped en la angiogénesis tumoral⁶. Por lo tanto, este modelo se puede utilizar para identificar nuevos compuestos antiangiogénicos que están activos en un entorno tumoral, así como para estudiar las interacciones celulares y moleculares que regulan la angiogénesis tumoral.

Materials

Air cylinder	BOC	011G	Xenotransplantation
B16-F1 cells	ATCC		Cell culture
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture)	Corning	356235	Xenotransplantation
Borosillicate glass capillaries	Warner Instruments	G100T-4	OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection
Cell culture dish 35 mm diameter	Thermofisher NZ	NUN153066	Fish husbandry
Cell culture dish 100 mm diameter	Sigma-Aldrich	CLS430167-500EA	Fish husbandry
Cell culture flask 75 cm<sup>2</sup>	In Vitro Technologies	COR430641	Cell culture
CellTracker Green	Invitrogen	C2925	Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 &mu;M in serum-free media)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418	Drug treatment, Cell labelling
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl<br/> <br/> 1.6 g KCl<br/> <br/> 5.8 g CaCl<sub>2</sub>&middot;2H2O<br/> <br/> 9.78 g MgCl<sub>2</sub>&middot;6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH	In house [1]		Fish husbandry
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	Xenotransplantation, Imaging
Filter tip 1,000 &mu;L	VWR	732-1491	Used during multiple steps
Filter tip 200 &mu;L	VWR	732-1489	Used during multiple steps
Filter tip 10 &mu;L	VWR	732-1487	Used during multiple steps
Fluorescence microscope	Leica	MZ16FA	Preparation of embryos
FBS (NZ origin)	Thermofisher Scientific	10091148	Cell culture
Gloves	Any commercial brand		Used during multiple steps
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer	HawksleyVet	AC1000	Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge	Thermofisher Scientific	75004500	Cell culture, Cell labelling
Hoechst 33342	Thermofisher Scientific	62249	Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 &mu;g/ml in serum-free media)
Low Melting Point, UltraPure Agarose	Thermofisher Scientific	16520050	Imaging
Methycellulose	Sigma-Aldrich	9004 67 5	Xenotransplantation
Methylene blue	sigma-Aldrich	M9140	Fish husbandry
Microloader 0.5-20 &mu;L pipette tip for loading microcapillaries	Eppendorf	5242956003	Xenotransplantation
Micropipettes	Any commercial brand		Used during multiple steps
Micropipette puller P 87	Sutter Instruments		Xenotransplantation
Microscope cage incubator	Okolab		Time-lapse imaging
Microwave	Any commercial brand		Imaging
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M3516	Xenotransplantation
Minimal Essential Media (MEM) – alpha	Thermofisher Scientfic	12561056	Cell Culture
MPPI-2 Pressure Injector	Applied Scientific Instrumentation		Xenotransplantation
Narishige micromanipulator	Narishige Group		Xenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope	Nikon		Imaging
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Fish husbandry
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	Cell culture
S1 pipet filler	Thermoscientific	9501	Cell culture
Serological stripette 10 mL	Corning	4488	Cell culture
Serological stripette 25 mL	Corning	4489	Cell culture
Serological stripette 5 mL	Corning	4485	Cell culture
Serological stripette 2 mL	Corning	4486	Cell culture
Terumo Needle 22 G	Amtech	SH 182	Fish husbandry
Tissue culture incubator	Thermofisher Scientfic	HeraCell 150i	Cell culture
Tivozanib (AV951)	AVEO Pharmaceuticals		Drug treatment
Transfer pipette 3 mL	Mediray	RL200C	Fish husbandry
Trypsin/EDTA (0.25%)	Life Technologies	T4049	Cell culture
Tweezers	Fine Science Tools	11295-10	Fish husbandry
Volocity Software (v6.3)	Improvision/Perkin Elmer		Image analysis