Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Resumen

Los islotes pancreáticos comprenden células endocrinas con patrones distintivos de expresión hormonal. Las células endocrinas muestran diferencias funcionales en respuesta a condiciones normales y patológicas. El objetivo de este protocolo es generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina con el uso de una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico basada en gotas. Estos datos se pueden utilizar para construir el perfil de expresión génica de cada tipo de célula endocrina en condiciones normales o específicas. El proceso requiere un manejo cuidadoso, una medición precisa y un riguroso control de calidad. En este protocolo, describimos pasos detallados para la disociación, secuenciación y análisis de datos de islotes pancreáticos humanos. Los resultados representativos de unas 20.000 células de islet único humano demuestran la aplicación exitosa del protocolo.

Introducción

Los islotes pancreáticos liberan hormonas endocrinas para regular los niveles de glucosa en sangre. Cinco tipos de células endocrinas, que difieren funcional y morfológicamente, están implicados en este papel esencial: las células producen glucagón, insulina de células, somatostatina de células de células PP, polipéptido pancreático de células PP y células de la ghrelina¹. La generación de perfiles de expresión génica es un enfoque útil para caracterizar las células endocrinas en condiciones normales o específicas. Históricamente, todo el perfil de expresión génica del islet se generó utilizando microarray y secuenciación de ARN de próxima gene....

Protocolo

1. Disociación de isla humana

1. Obtener islotes humanos aislados de donantes de órganos cadáveres de ambos sexos, con edades entre 15 y 80 años, sin enfermedades preexistentes, a menos que se requieran islotes de donantes con datos demográficos específicos para el propósito del estudio.
   1. Después del aislamiento, haga que los islotes aislados se mantengan en la instalación de cultivo de tejidos durante 2-3 días en el proveedor. A menudo se tarda más de 1 día en hacerse visibles los daños en los islos.
   2. Coloque los islotes en una botella y sumerja completamente en el medio del isla. Llevarlo al laboratorio por envío nocturno.
   3. Obtenga ....

Resultados

El flujo de trabajo de secuenciación de ARN de una sola célula consta de tres pasos: disociar islotes humanos intactos en suspensión de una sola célula, capturar células individuales utilizando una tecnología basada en gotas y analizar datos de ARN-seq (Figura1). En primer lugar, los islotes humanos adquiridos fueron incubados de la noche a la mañana. Los islotes intactos se examinaron bajo el microscopio (Figura2A). La integrida.......

Discusión

Las tecnologías de una sola célula desarrolladas en los últimos años proporcionan una nueva plataforma para caracterizar los tipos celulares y estudiar la heterogeneidad molecular en islotes pancreáticos humanos. Adoptamos un protocolo de aislamiento microfluídico de una sola célula basado en gotas y análisis de datos para estudiar islotes humanos. Nuestro protocolo produjo con éxito datos de secuenciación de ARN de más de 20.000 células de islotes humanos individuales con variaciones relativamente pequeñas en la calidad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
30 y micro; m Filtros de pre-separación	Miltenyi Biotec	130-041-407	Filtro de células
portaobjetos de 8 cámaras	Chemometec	102673-680	Portaobjetos de ensayo de recuento Dell
Bioanalyzer Kit de ADN de alta sensibilidad	Agilent	5067-4626	para QC
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A9647	Medios unicelulares
Cromo Célula única 3' Biblioteca & Gel Bead Kit v2, 16 rxns	10X Genomics	120237	Reactivos unicelulares
Cromo Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)	10X Genomics	120236	chips microfluídicos
CMRL-1066	ThermoFisher	11530-037	Medios de islote completos
EB Buffer	Qiagen	19086	Tampón de elución
Eppendorf Placa PCR twin-tec, 96 pocillos, azul, semifaldón	VWR	47744-112 Placa de	emulsión
Suero fetal bovino	ThermoFisher	16000-036 Medios de	islotes
completos Islotes humanos	Prodo Labs	HIR	Islotes humanos aislados
L-glutamina (200 mM)	ThermoFisher	25030-081	Medios de islote completos
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 muestras)	Illumina	FC-121-1031	Library reactivos de preparación
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciclos)	Illumina	FC-404-2005	Secuenciación de
penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	ThermoFisher	15140-122	Medios de islote completos
Qubit Kit de dsDNA de alta sensibilidad	Life Technologies	Q32854	para QC
Solution 18	Chemometec	103011-420 Ensayo de	recuento de células reactivo
SPRISelect Reactivo	Fisher Scientific	B23318	Perlas de purificación
Placas de cultivo de tejidos (10 cm)	VWR	10861-594	para cultivo de islotes
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013 Solución de	disociación celular
Zymo DNA Clean & Concentrador-5, 50 reacciones	VWR	77001-152	Columnas de limpieza de bibliotecas