La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de "bola de neurona", por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.
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Artículo de método
Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante el desarrollo neuronal, la formación de sinapsis es un paso importante para establecer circuitos neuronales. Para formar sinapsis, las proteínas sinápticas deben suministrarse en el orden adecuado mediante el transporte desde cuerpos celulares y/o la traducción local en sinapsis inmaduras. Sin embargo, no se entiende completamente cómo las proteínas sinápticas se acumulan en las sinapsis en el orden correcto. Aquí, presentamos un método novedoso para analizar la formación presináptica mediante el uso de la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis. Las bolas neuronales que son agregados de células neuronales proporcionan hojas axonales lejos de los cuerpos celulares y dendritas, de modo que las señales fluorescentes débiles de las presinapciones pueden detectarse evitando señales abrumadoras de cuerpos celulares. Como perlas para desencadenar la formación de presinapsis, utilizamos cuentas conjugadas con la repetición de leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), un organizador presináptico excitatorio. Usando este método, demostramos que el transportador de glutamato vesicular 1 (vGlut1), una proteína de vesícula sináptica, acumulada en presinapciones más rápido que Munc18-1, una proteína de zona activa. Munc18-1 acumuló la traducción dependiente en la presinapsis incluso después de eliminar los cuerpos celulares. Este hallazgo indica la acumulación munc18-1 por traducción local en axónes, no el transporte desde cuerpos celulares. En conclusión, este método es adecuado para analizar la acumulación de proteínas sinápticas en presinapis y fuente de proteínas sinápticas. Como el cultivo de bolas de neuronas es simple y no es necesario utilizar aparatos especiales, este método podría ser aplicable a otras plataformas experimentales.
Introducción
La formación de sinapsis es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de los circuitos neuronales1,2,3. La formación de sinapsis especializadas compuestas por pre y post-sinapsis es un proceso complejo y multipaso que implica el reconocimiento adecuado de los axónes y dendritas, la formación de la zona activa y la densidad postsináptica, y la alineación adecuada de canales ióniónicos y receptores de neurotransmisores1,2. En cada proceso, muchos tipos de proteínas sinápticas se acumulan en estos compartimentos es....
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Protocolo
Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices descritas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso De Animales de la Universidad de la Ciudad de Yokohama.
1. Preparación de bolas de neuronas como cultivo de gota colgante (Días in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Los procedimientos descritos aquí para la preparación del cultivo de bolas de neuronas se basan en el método previamente reportado por el grupo Sasaki con algunas modificaciones9,10. También adoptamos varios procedimientos del método banquero para la cult....
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Resultados
Aquí, mostramos resultados representativos de acumulación de proteínas presinápticas en presinapciones inducidas por LRRTM2 de hojas axonales del cultivo de bolas de neuronas. Como proteínas presinápticas, analizamos la proteína de vesícula sináptica excitatoria vGlut1 y la proteína de zona activa Munc18-1. También examinamos el curso de tiempo de acumulación de vGlut1 y Munc18-1 en presinapciones, y obtuvimos resultados que indican la fuente de Munc18-1 en presinapciones utilizando axones eliminando cuerpos celulares y .......
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Discusión
Desarrollamos un método novedoso para examinar la formación de presinapnasa estimulada con LRRTM2-perlas utilizando el cultivo de bolas de neuronas. Actualmente, la mayor parte del ensayo de formación de presinapestos incluye cuentas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y cultivo disociado/cámara microfluídica20,21,22. Una de las ventajas de este método es LRRTM2-beads. Mientras que LRRTM2 interactúa con la neurexina para formar p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está respaldado en parte por JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos al Dr. Terukazu Nogi y a la Sra. Makiko Neyazaki (Universidad de la Ciudad de Yokohama) por proporcionar amablemente proteína lRRTM2 biotinilada. También damos las gracias a Honami Uechi y Rie Ishii por su asistencia técnica.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Diluyente de anticuerpos | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| ratón anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Suplemento (50X), suero gratis | Thermo Fisher Scientific 17504044 | ||
| Suero bovino Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Multiplatos tratados con cultivo celular (plato de 4 pocillos) | Nunc | 176740 | |
| Cámara CCD refrigerada | |||
| C015001 | Tamaño: 15 mm, Grosor: 0,13-0,17 mm | ||
| Citosina β-D-arabinofuranósido (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenilindol Dihidrocloruro (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Desoxirribonucleasa 1 (DNasa I) | Productos químicos puros de Wako | 047-26771 | |
| Expi293 Sistema de expresión | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Suero de caballo | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| software de adquisición de imágenes | Nikon | NIS-element AR | |
| Software de análisis de imágenes | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Microscopio fluorescente invertido | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | ||
| Medios neurobasales | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Suero de cabra normal (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| Galato de N-propilo | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina (MW > 300.000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poli (alcohol vinílico) | Sigma | P8136 | |
| Columnas PD-10 desechables preempaquetadas | healthcare | 17085101 | |
| transportador de glutamato antivesicular para conejos 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutro no fósforo detergente) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diámetro: 4-5 y micro; m |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Tripsina | Nacalai Tesque | 18172-94 |
Referencias
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5),....
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Reimpresiones y permisos
