Artículo de método

Detección de fusión genética oncogénica mediante reacción en cadena de polimerasa múltiplex anclada seguida de secuenciación de próxima generación

DOI:

10.3791/59895

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5 de julio de 2019

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

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Este artículo detalla el uso de un kit de preparación de biblioteca sin reacción en cadena de múltiples polimerasas anclada seguido de secuenciación de próxima generación para evaluar las fusiones de genes oncogénicos en muestras de tumores sólidos clínicos clínicos. Se describen los pasos de análisis de datos y de banco húmedo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las fusiones genéticas con frecuencia contribuyen al fenotipo oncogénico de muchos tipos diferentes de cáncer. Además, la presencia de ciertas fusiones en muestras de pacientes con cáncer a menudo influye directamente en el diagnóstico, pronóstico y/o selección de terapia. Como resultado, la detección precisa de fusiones genéticas se ha convertido en un componente crítico del manejo clínico para muchos tipos de enfermedades. Hasta hace poco, la detección de la fusión génica clínica se realizaba predominantemente mediante el uso de ensayos de un solo gen. Sin embargo, la lista cada vez mayor de fusiones genéticas con importancia clínica ha creado la necesidad de evaluar el estado de fusión de múltiples genes simultáneamente. Las pruebas basadas en secuenciación de próxima generación (NGS) han satisfecho esta demanda a través de la capacidad de secuenciar ácido nucleico de manera masivamente paralela. Múltiples enfoques basados en NGS que emplean diferentes estrategias para el enriquecimiento de objetivos genéticos ahora están disponibles para su uso en diagnóstico molecular clínico, cada uno con sus propias fortalezas y debilidades. Este artículo describe el uso de el enriquecimiento objetivo basado en PCR múltiple (AMP) anclado y la preparación de bibliotecas seguida de NGS para evaluar las fusiones genéticas en muestras de tumores sólidos clínicos. AMP es único entre los enfoques de enriquecimiento basados en amplificación, ya que identifica fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión. Aquí se detallan los pasos de análisis de datos y de banco húmedo que garantizan una detección precisa de la fusión genética a partir de muestras clínicas.

Introducción

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La fusión de dos o más genes en una sola entidad transcripcional puede ocurrir como resultado de variaciones cromosómicas a gran escala, incluyendo eliminaciones, duplicaciones, inserciones, inversiones y translocaciones. A través del control transcripcional alterado y/o las propiedades funcionales alteradas del producto genético expresado, estos genes de fusión pueden conferir propiedades oncogénicas a las células cancerosas1. En muchos casos, los genes de fusión son conocidos por actuar como principales motores oncogénicos mediante la activación directa de la proliferación celular y las vías de supervivencia.

La relevancia clínica de las fusiones genéticas para los pacientes con cáncer se hizo evidente por primera vez con el descubrimiento del cromosoma Filadelfia y el gen de fusión BCR-ABL1 correspondiente en la leucemia mielógena crónica (LMC)2. El inhibidor de molécula pequeña imatinib mesilato fue desarrollado para apuntar específicamente a este gen de fusión y demostró una eficacia notable en pacientes con LMC BCR-ABL13. La segmentación terapéutica de fusiones genéticas oncogénicas también ha tenido éxito en tumores sólidos, con la inhibición de los genes de fusión ALK y ROS1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas que sirven como ejemplos primarios4,5. Recientemente, el inhibidor de la NTRK larotrectinib fue aprobado por la FDA para tumores sólidos positivos de fusión NTRK1/2/3, independientemente del sitiodela enfermedad 6. Más allá de la selección de la terapia, la detección de la fusión génica también tiene roles en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Esto es particularmente frecuente en varios subtipos de sarcoma y neoplasia maligna hematológica que se definen diagnósticamente por la presencia de fusiones específicas y/o para las que la presencia de una fusión informa directamente al pronóstico7,8 , 9 , 10 , 11. Estos son sólo algunos de los ejemplos de la aplicación clínica de la detección de fusión génica para pacientes con cáncer.

Debido al papel crítico en la toma de decisiones clínicas, la detección precisa de la fusión genética a partir de muestras clínicas es de vital importancia. Se han aplicado numerosas técnicas en laboratorios clínicos para análisis de fusión o reordenamiento cromosómico, incluyendo: técnicas citogenéticas, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), hibridación flúor in situ (FISH), inmunohistoquímica (IHC), y 5'/3' análisis de desequilibrio de expresión (entre otros)12,13,14,15. En la actualidad, la lista de fusiones genéticas procesables en el cáncer, que se está expandiendo rápidamente, ha dado lugar a la necesidad de evaluar simultáneamente el estado de fusión de múltiples genes. En consecuencia, algunas técnicas tradicionales que sólo pueden consultar uno o unos pocos genes a la vez se están convirtiendo en enfoques ineficientes, especialmente si se tiene en cuenta que las muestras de tumores clínicos son a menudo muy finitas y no son susceptibles de ser divididas entre varios ensayos. La secuenciación de próxima generación (NGS), sin embargo, es una plataforma de análisis que es adecuada para pruebas multigenicas, y los ensayos basados en NGS se han vuelto comunes en los laboratorios de diagnóstico molecular clínico.

Los ensayos NGS utilizados actualmente para la detección de fusión/reorganización varían en lo que respecta al material de entrada utilizado, las químicas empleadas para la preparación de bibliotecas y el enriquecimiento objetivo, y el número de genes consultados dentro de un ensayo. Los ensayos NGS pueden basarse en ARN o ADN (o ambos) extraídos de la muestra. Aunque el análisis basado en ARN se ve obstaculizado por la tendencia de las muestras clínicas a contener ARN altamente degradado, elude la necesidad de secuenciar intrones grandes y a menudo repetitivos que son los objetivos de las pruebas de fusión basadas en ADN, pero que han demostrado ser difíciles para el NGS análisis de datos16. Las estrategias de enriquecimiento objetivo para ensayos NGS basados en ARN se pueden dividir en gran medida en métodos híbridos de captura o de amplificación. Mientras que ambas estrategias se han utilizado con éxito para la detección de fusión, cada una contiene ventajas sobre el otro17,18. Los ensayos híbridos de captura generalmente dan como resultado bibliotecas más complejas y reducción de la caída alélica, mientras que los ensayos basados en amplificación generalmente requieren una entrada más baja y dan como resultado una secuencia menos dedestino19. Sin embargo, tal vez la principal limitación del enriquecimiento tradicional basado en amplicones sea la necesidad de imprimación para todos los socios de fusión conocidos. Esto es problemático ya que se sabe que muchos genes clínicamente importantes se fusionan con docenas de socios diferentes, e incluso si el diseño de imprimación permitiera la detección de todos los socios conocidos, nuevos eventos de fusión permanecerían sin ser detectados. Una técnica recientemente descrita denominada PCR múltiplex anclado (o AMP para abreviar) aborda esta limitación20. En AMP, un adaptador NGS "medio funcional" se liga a fragmentos de ADNc que se derivan del ARN de entrada. El enriquecimiento objetivo se logra mediante la amplificación entre imprimaciones específicas genéticas y una imprimación al adaptador. Como resultado, deben detectarse todas las fusiones con genes de interés, incluso si se trata de un nuevo compañero de fusión (ver Figura 1). Este artículo describe el uso del kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un ensayo basado en NGS que emplea AMP para el enriquecimiento objetivo y la preparación de bibliotecas, para la detección de fusiones genéticas oncogénicas en muestras de tumores sólidos (ver Tabla Suplementaria 1 para lista completa de genes). El protocolo de banco húmedo y los pasos de análisis de datos han sido rigurosamente validados en un laboratorio certificado por Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA).

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Protocolo

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1. Preparación y secuenciación de la biblioteca

  1. Consideraciones generales sobre el ensayo y las medidas previas a la prueba
    1. Las ejecuciones de ensayos suelen consistir en siete muestras clínicas y un control positivo (aunque el número de muestras por ejecución de preparación de la biblioteca se puede ajustar según sea necesario). Utilice un control positivo que contenga al menos varias fusiones genéticas (que los objetivos del ensayo) que hayan sido confirmadas por un fabricante y/o hayan sido confirmadas por una metodología ortogonal. Un control no-plantilla (NTC) debe incluirse como una muestra adicional en cada ejecución de ensayo, pero sólo se lleva a través de la síntesis de adNC de segunda hebra y el control de calidad de presecuenciación (Pre-Seq QC; para garantizar que no haya síntesis de ADNc). Utilice diluyente de muestra (10 mM Tris HCl pH 8.0) para el NTC.
    2. Realizar la extracción total de ácido nucleico (TNA) del tejido de parafina incrustada en parafina fija de formalina (FFPE).
    3. Cuantifique el componente de ARN del TNA utilizando un ensayo fluorométrico.
      NOTA: Evite la degradación del ARN en las muestras limitando los ciclos de congelación por congelación, manteniendo el ácido nucleico descongelado a baja temperatura (bloque frío, hielo o alternativa) y previniendo la contaminación por RNase (uso de guantes, utilizando un spray descontaminante RNase).
  2. Cebado aleatorio
    NOTA: La entrada deseada para el ensayo es 200 ng ARN (basado en la cuantificación fluorométrica del TNA). Se pueden utilizar entradas más bajas si no se pueden lograr 200 ng. Si el ejemplo falla en la secuencia de control de calidad posterior a la secuenciación, la repetición con una entrada más alta puede dar lugar a métricas de control de calidad aceptables.
    1. Diluir TNA en 10 mM Tris HCl pH 8.0 para lograr la concentración deseada de ARN. Para cada muestra, transfiera 20 l de la dilución a los tubos de tira de reactivo de cebado aleatorio (colocados en bloque de aluminio preenfriado) y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces. Gire brevemente hacia abajo y transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pocillos y selle con película RT.
    2. Inserte la placa en el bloque termociclador, cubra con la almohadilla de compresión y cierre la tapa. Incubar a 65oC durante 5 min (tapa calentada).
    3. Retire la placa del termociclador y colóquela en hielo durante 2 min.
  3. Síntesis de ADNc de primera hebra
    1. Transfiera todo el volumen del producto de cebado aleatorio a los tubos de tira del primer reactivo de hebra (colocados en bloque sorcalizado de aluminio). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o 8 veces. Gire brevemente hacia abajo, transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pocillos y selle con película RT.
    2. Inserte la placa en el bloque termociclador, cubra con la almohadilla de compresión y cierre la tapa. Ejecutar el programa de termocicladores: 25 oC 10 min, 42 oC 30 min, 80 oC 20 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
  4. Síntesis de ADNc de segunda línea
    1. En un nuevo conjunto de tubos de tiras de PCR, cree una dilución 1:10 del primer producto de hebra añadiendo 1 l de producto de primera hebra a agua libre de nucleasas de 9 l. Deje la dilución a un lado para utilizarla en el ensayo Pre-Seq QC.
    2. Añadir 21 l de agua libre de nucleasas al producto restante de la primera hebra. Transfiera 40 l del primer producto de hebra y nucleaste agua libre al tubo de tira del reactivo de la segunda hebra (colocado en bloque de aluminio pre-enfriado). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o 8 veces. Gire hacia abajo, transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pocillos y selle con película RT.
    3. Inserte la placa en el bloque termociclador, cubra con la almohadilla de compresión y cierre la tapa. Ejecutar el programa de termocicladores: 16 oC 60 min, 75 oC 20 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
      NOTA: Este es un punto de parada aceptable. La placa se puede almacenar a -20 oC.
  5. Pre-Seq QC
    NOTA: Este ensayo de control de calidad (QC) se utiliza principalmente para la verificación de la no síntesis de ADNc de la NTC. Sin embargo, los datos también pueden ser informativos en la resolución de problemas de ensayo. Por ejemplo, si una muestra tiene un buen valor de control de calidad anterior a la seq, pero las métricas de ensayo deficientes (véase más adelante), podría ser una indicación de un problema en la ejecución del ensayo, lo que requiere una repetición.
    1. Ejecute cada muestra y el NTC por duplicado. También incluir en el pre-Seq QC ejecutar una reacción NTC, que es agua libre de nucleasa (también se ejecuta por duplicado). A cada pozo aplicable de una placa óptica de 96 pocillos añadir 5 ml de la mezcla maestra de ensayo, 1 l de imprimación VCP de 10x y 4 l de la dilución 1:10 del primer producto de hebra que se creó en el paso 1.4.1.
    2. Selle la placa con película RT, gire hacia abajo y cargue en un instrumento pcR cuantitativo (qPCR). Ejecutar el programa: preamplificador: 1 ciclo 95 oC 20 s, amperio: 35 ciclos 95 oC 3 s (4,4 oC/s de velocidad de rampa) a 60 oC 30 s (2,2 oC/s de velocidad de rampa).
    3. Confirme la falta de un valor de umbral de ciclo (Ct) tanto para el ensayo NTC como para el NTC de reacción.
      NOTA: Si no se observa ct en el ensayo NTC, ya no se llevará adelante en el ensayo. La observación de un valor Ct en la reacción NTC requiere una repetición del ensayo pre-Seq QC. La observación de un Ct en el ensayo NTC sugiere contaminación de la muestra en algún momento antes del ensayo, lo que requiere que se inicie todo el ensayo (todas las muestras). El valor de Pre-Seq QC Ct para una muestra de calidad adecuada debe estar por debajo de 30 (los valores ct más bajos se correlacionan con más producto y, por lo tanto, ARN de mayor calidad). Los valores superiores a 30 no son indicadores absolutos de fallo y estos ejemplos deben continuar en el ensayo. Sin embargo, todos los datos derivados de estas muestras deben revisarse cuidadosamente, especialmente en los casos para los que no se llama a ninguna fusión.
  6. Reparación final y purificación de cuentas
    1. Transfiera 40 l del producto de la segunda hebra al tubo de tira del reactivo de reparación final (colocado en un bloque de aluminio preenfriado). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o8 veces, girar hacia abajo y colocar en el bloque termociclador (manteniendo la tapa calentada abierta) y ejecutar el programa de termociclador: 25 oC 30 min, 4 oC de retención.
    2. Retirar las perlas de purificación de 4 oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Conforman suficiente 70% de etanol para durar durante toda la preparación de la biblioteca. Abalorios de vórtice mucho antes de su uso y pipetee 100 l en el número adecuado de pozos de una placa inferior en U.
      NOTA: Por cada 8 muestras que se ejecutan, se necesitarán 20 ml de etanol al 70%.
    3. Agregue todo el volumen del producto de reparación final a las perlas. Pipet hacia arriba y hacia abajo 6 x 8 veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de una incubación de 5 minutos en el imán.
    4. Retire y deseche el sobrenadante y realice dos lavados de etanol de 200 l 70% con incubaciones de 30 s. Después del lavado final retire todo el 70% de etanol y deje secar al aire durante 5 min.
    5. Retirar del imán y volver a suspender las perlas en 22 ml de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubar el imán durante 3 minutos seguido de una incubación de 2 minutos en el imán. Proceda inmediatamente al paso 1 de la ligadura.
  7. Paso de ligadura 1 y purificación de cuentas
    1. Transfiera 20 l desde la placa de purificación de perlas de reparación final (teniendo cuidado de no molestar el pellet de perlas) en los tubos de tira paso 1 de ligación (colocados en bloque de aluminio pre-enfriado). Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 x 8 veces, gire hacia abajo y transfiera todo el volumen a una placa PCR de 96 pocillos.
    2. Inserte la placa en el bloque termociclador, cubra con la almohadilla de compresión y cierre la tapa. Ejecutar el programa de termocicladores: 37 oC 15 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
    3. Retirar las perlas de purificación de 4 oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Abalorios de vórtice mucho antes de su uso y pipeteo 50 l en el número adecuado de pozos de una placa inferior en U.
    4. Agregue todo el volumen de la ligadura del producto paso 1 a las perlas. Pipet hacia arriba y hacia abajo 6 x 8 veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de una incubación de 5 minutos en el imán.
    5. Retire y deseche el sobrenadante y realice dos lavados de etanol de 200 l 70% con incubaciones de 30 s. Después del lavado final retire todo el 70% de etanol y deje secar al aire durante 5 min.
    6. Retirar del imán y volver a suspender las perlas en 42 ml de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubar el imán durante 3 minutos seguido de una incubación de 2 minutos en el imán. Proceda inmediatamente al paso de ligadura 2.
  8. Paso de ligadura 2 y purificación de cuentas
    1. Retire los reactivos de tubo adaptador de código de barras moleculares (MBC) del almacenamiento de 4 oC. La numeración adecuada de la banda de adaptador MBC es de vital importancia a medida que se agregan índices específicos de la muestra en este momento. Coloque los tubos horizontalmente con las bisagras hacia atrás y utilice un marcador permanente para etiquetar los tubos 1, 2, 3... de izquierda a derecha. También es fundamental registrar los índices específicos de la muestra para fines de secuenciación (deben especificarse en la hoja de cálculo del secuenciador).
    2. Transfiera 40 l desde la placa de purificación de perlas paso 1 de la ligadura (teniendo cuidado de no molestar el pellet de perlas) a los tubos de tira del adaptador MBC (colocados en un bloque de aluminio preenfriado). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o 8 veces.
    3. Gire hacia abajo y transfiera todo el volumen a los tubos de tira de reactivos del paso de ligación 2 (también colocados en un bloque de aluminio preenfriado). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o 8 veces, gire hacia abajo y colóquelo en el bloque termociclador. Con la tapa calentada fuera, ejecute el programa de termocicladores: 22 oC 5 min, 4 oC de retención.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro y las muestras se pueden almacenar a -20 oC.
    4. Retire las perlas de limpieza de ligadura del almacenamiento de 4 oC y permita equilibrar a temperatura ambiente. Preparar 1 mL de fresco 5 mM NaOH.
    5. Vortex las perlas de limpieza de ligadura y añadir 50 l a un nuevo conjunto de tubos de tiras DE PCR. Incubar en el imán durante 1 min. Después de la incubación de 1 minuto, retire y deseche el sobrenadante. Retire los tubos de tiras del imán y vuelva a suspenderlos en 50 ml de tampón de limpieza de ligación pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces.
    6. Transfiera todo el volumen del producto paso 2 de la ligadura a los tubos de tira de perlas de limpieza de ligadura. Mezclar las muestras por vórtice e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Una vez más, mezclar muestras por vórtice e incubar a temperatura ambiente durante otros 5 min. Después de la segunda incubación de 5 minutos, mezcle las muestras por vórtice, gire hacia abajo brevemente e incubar en el imán durante 1 min.
    7. Retire y deseche el sobrenadante. Agregue 200 s de búfer de limpieza de ligación y vórtice para volver a suspender. Realice un giro rápido y colóquelo en el imán durante 1 min. Realice un segundo lavado utilizando de nuevo el tampón de limpieza de ligadura.
    8. Después de que los dos lavados con el tampón de limpieza de ligadura realizar un lavado idéntico utilizando agua ultrapura. Después del lavado de agua ultrapura, vuelva a suspender las perlas en 20 ml de NaOH de 5 mM y transfiera a una placa pcR de 96 pocillos. Coloque la placa en un bloque termociclador con una almohadilla de compresión y ejecute el programa de termociclador: 75 oC 10 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
    9. Gire hacia abajo la placa PCR una vez que las muestras se hayan enfriado a 4 oC. Coloque la placa en el imán durante al menos 3 minutos y proceda inmediatamente a la primera PCR.
  9. Primera purificación de PCR y cuentas
    1. Retire los primeros tubos de tiras de reactivos PCR de 4 oC De almacenamiento y colóquelos en un bloque de aluminio preenfriado. Además, retire las imprimaciones GSP1 de -20 oC y deje que se equilibre a temperatura ambiente.
    2. Añadir 2 l de las imprimaciones GSP1 a cada pocto de los primeros tubos de tira de reactivo PCR. Transfiera 18 l del producto de limpieza de la ligadura 2 a los primeros tubos de tira de reactivo de PCR y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces.
    3. Gire hacia abajo y transfiera a una placa PCR de 96 pocillos. Colocar la placa en un bloque termociclador con una almohadilla de compresión y ejecutar el programa de termociclador: 95 oC 3 min, 15 ciclos de 95 oC 30 s a 65 oC 5 min (100% de velocidad de rampa), 72 oC 3 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
      NOTA: Este es un punto de parada seguro y las muestras se pueden almacenar a 4 oC durante la noche o a -20 oC para un almacenamiento a largo plazo.
    4. Retirar las perlas de purificación de 4 oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Abalorios de vórtice mucho antes de su uso y pipeteo de 24 ol en el número adecuado de pozos de una placa inferior en U.
    5. Transfiera 20 l del primer producto PCR a los 24 s de perlas. Pipet hacia arriba y hacia abajo 6 x 8 veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de una incubación de 2 minutos en el imán.
    6. Retire y deseche el sobrenadante y realice dos lavados de etanol de 200 l 70% con incubaciones de 30 s. Después del lavado final retire todo el 70% de etanol y deje secar al aire durante 2 min.
    7. Retirar del imán y volver a suspender las perlas en 24 ml de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubar el imán durante 3 minutos seguido de una incubación de 2 minutos en el imán. Proceda inmediatamente a la segunda PCR.
  10. Segunda purificación de PCR y cuentas
    1. Retire los tubos de tira de reactivo sin Segunda PCR de 4 oC y colóquelos en un bloque de aluminio preenfriado. La numeración adecuada de los segundos tubos de tiras de PCR es de vital importancia a medida que se agregan índices específicos de la muestra en este punto. Coloque los tubos horizontalmente con las bisagras hacia atrás y utilice un marcador permanente para etiquetar los tubos 1, 2, 3... de izquierda a derecha. Además, retire las imprimaciones GSP2 de -20 oC y deje que se equilibre na. a temperatura ambiente.
      NOTA: También es fundamental registrar los índices específicos de la muestra para fines de secuenciación (deben introducirse en la hoja de cálculo del secuenciador).
    2. Añadir 2 l de las imprimaciones GSP2 a cada pocal de los segundos tubos de tira de reactivo PCR. Transfiera 18 l del primer producto de limpieza de PCR a los segundos tubos de tira de reactivo sCP y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 6 o 8 veces.
    3. Gire hacia abajo y transfiera a una placa PCR de 96 pocillos. Colocar la placa en el bloque termociclador con una almohadilla de compresión y ejecutar el programa de termociclador: 95 oC 3 min, 18 ciclos de 95 oC 30 s a 65 oC 5 min (100% de velocidad de rampa), 72 oC 3 min, 4 oC de retención (tapa calentada).
      NOTA: Este es un punto de parada seguro y las muestras se pueden almacenar a 4 oC durante la noche o a -20 oC para un almacenamiento a largo plazo.
    4. Retirar las perlas de purificación de 4 oC y dejar equilibrar a temperatura ambiente. Abalorios de vórtice mucho antes de su uso y pipeteo de 24 ol en el número adecuado de pozos de una placa inferior en U.
    5. Transfiera 20 ml del segundo producto PCR a las perlas. Pipet hacia arriba y hacia abajo 6 x 8 veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de una incubación de 2 minutos en el imán.
    6. Retire y deseche el sobrenadante y realice dos lavados de etanol de 200 l 70% con incubaciones de 30 s. Después del lavado final retire todo el 70% de etanol y deje secar al aire durante 2 min.
    7. Retirar del imán y volver a suspender las perlas en 24 ml de 10 mM Tris HCl pH 8.0. Incubar el imán durante 3 minutos seguido de una incubación de 2 minutos en el imán. Transfiera 20 l del segundo producto de limpieza de PCR a una nueva placa pcR de 96 pocillos.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro y las bibliotecas se pueden almacenar a -20 oC para el almacenamiento a largo plazo o proceder inmediatamente a la cuantificación de la biblioteca.
  11. Cuantificación de la biblioteca
    1. Retire la mezcla maestra de cuantificación de la biblioteca y las normas de un almacenamiento de -20 oC y permita equilibrar la temperatura ambiente.
    2. Realizar 1:5 dilución de todas las bibliotecas (segundo producto PCR) utilizando 10 mM Tris HCl pH 8.0 seguido de una dilución en serie de 1:199, 1:199, y 20:80 utilizando 10 mM Tris HCl pH 8.0 0.05% polisorbato. Las dos últimas diluciones de 1:200,000 y 1:1,000,000 respectivamente se ejecutarán en triplicado.
    3. Añadir 6 l de mezcla maestra a cada pocal de una placa de pozo óptica de 96 seguida de 4 ml de dilución adecuada o estándar. Gire hacia abajo la placa y cárguelo en el instrumento qPCR. Utilice las siguientes condiciones de ciclo: 1 ciclo 95 oC 5 min, 35 ciclos 95 oC 30 s (4,4 oC/s de rampa) a 60 oC 45 s (2,2 oC/s de rampa).
    4. Una vez completada la cuantificación de la biblioteca y determinadas las concentraciones de la biblioteca (mediante el promedio de ambas diluciones probadas), normalice todas las bibliotecas a 2 nM utilizando 10 mM Tris HCl pH 8.0. Haga la piscina de la biblioteca combinando 10 ml de cada biblioteca normalizada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  12. Secuenciación de bibliotecas
    1. Retire el cartucho del reactivo del secuenciador de un almacenamiento de -20 oC y colóquelo en agua desionizada (DI) hasta la línea de llenado durante al menos 1 h. Además, retire el kit de reactivos del secuenciador a partir de 4 oC y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 1 h. El número máximo de bibliotecas que se pueden secuenciar en esta plataforma de secuenciación es 8 (una de las cuales debe ser el control positivo).
    2. Haga la piscina de la biblioteca de amplificación desnaturalizada (DAL) combinando 10 l de la piscina de la biblioteca con 10 sl de 0,2 N NaOH e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de 5 minutos añadir 10 l de 200 mM Tris HCl pH 7.0, seguido de 970 l de tampón de hibridación HT1.
    3. Realice el tubo de carga final combinando 300 s de HT1, 25 éL de 20 pM PhiX y 675 l de la piscina DAL. Vórtice y gire por el tubo de carga. Añada todo el volumen del tubo de carga al pozo de muestra del cartucho del reactivo del secuenciador y al cartucho de carga en el secuenciador que ejecuta lecturas de 2 x 151 bp con 2 x 8 lecturas de índice.

2. Análisis de datos

  1. Análisis y manejo de datos de secuenciación
    1. Descargue las métricas de secuenciación del instrumento NGS.
    2. Asegúrese de que los datos de secuenciación caigan en los siguientes rangos (específicos para el kit utilizado en este ejemplo). Densidad del clúster (densidad [K/mm2]): 945–1600 K; % de lecturas que pasan el filtro (clusters PF [%]): >90%; puntuaciones de calidad (% -Q30): >85%; Alineación PhiX (alineada %): 1,5-6,0%; Tasa de error de PhiX (tasa de error [%]): <1,0%; lee el filtro de paso (lee PF [M]): >22 millones.
      NOTA: Las ejecuciones de secuenciación que no cumplen estas métricas están sujetas a repetición.
    3. Revise el % de lecturas atribuidas a cada ejemplo (es decir, cada índice específico de la muestra). Para una ejecución típica en la que el spike-in de PhiX era del 5% y se secuenciaron 8 muestras, cada muestra debería representar idealmente aproximadamente el 11,9% de las lecturas. El rango aceptable para cada muestra es de 5 a 25%. Si alguna muestra no cabe dentro de este rango, repita la cuantificación y la secuenciación de la biblioteca.
  2. Envío de datos de secuencia sin procesar al algoritmo de análisis
    NOTA: La versión 4.1.1.7 del análisis de ArcherDx se describe aquí. En este ejemplo, el software de análisis se implementa como una "máquina virtual" que se ejecuta en un servidor interno. Se requiere una unidad de procesamiento central (CPU) y 12 GB de memoria de acceso aleatorio (RAM) para que cada muestra se analice simultáneamente (normalmente se procesan 8 muestras simultáneamente que requieren 8 CPU y 96 GB de RAM). El procesamiento suele tardar de 3 a 8 h.
    1. Utilice la configuración de análisis predeterminada dentro del sistema de análisis, con la excepción de MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (esto se cambia de 10 a 20) y READ_DEPTH_NORMALIZATION (se establece en 0 para evitar el muestreo descendente).
    2. Para iniciar un trabajo de análisis, haga clic en Realizar análisis en la interfaz de usuario, envíe un nombre para el trabajo y, a continuación, seleccione los archivos FASTQ necesarios (asegurándose de que ambas lecturas [R1 y R2] están seleccionadas para cada ejemplo).
    3. Seleccione RNA Fusion para los tipos de análisis de ARN, Illumina (emparejado) para plataforma y FusionPlex Solid Tumor Panel para la región de destino. A continuación, haga clic en Enviar análisis.
  3. Interpretación de datos de ensayo
    1. Abra la interfaz de usuario del sistema de análisis y seleccione el trabajo deseado. Seleccione el ejemplo de control positivo. Asegúrese de que todas las fusiones esperadas y isoformas oncogénicas se han detectado y se enumeran en la pestaña Evidencia fuerte.
      NOTA: Si alguna de las fusiones rastreadas en el control positivo no se detecta para una ejecución determinada del ensayo, puede ser una indicación de un problema en esa ejecución, que requiere una repetición (desde el comienzo del ensayo).
    2. Examine las estadísticas de lectura de cada muestra clínica en ejecución haciendo clic en la pestaña Leer estadísticas. Cada muestra debe estar representada por al menos 1 millón de fragmentos totales. Si menos de 1 millón, vuelva a secuenciar la biblioteca con consideraciones de reagrupación para asegurarse de que la cuantificación inicial no era aberrantemente alta.
      NOTA: Las muestras de buena calidad generalmente se mostrarán en el % objetivo >85%, y las bandejas moleculares de ARN deben ser >20.000 y comprender >30% de las lecturas. Sin embargo, si no se cumplen estas métricas, no se desencadena automáticamente un error de ejemplo.
    3. Inspeccione el valor de Control Medio de Inicio único por GSP2.
      NOTA: Este valor es una medida de la complejidad de la secuenciación de imprimaciones a cuatro genes de limpieza. Esta métrica es un determinante crítico de la calidad del ARN en la muestra (si la secuenciación de genes que se espera que se expresen en la muestra es deficiente, entonces la confianza en la capacidad de detectar una fusión génica expresada es baja). El límite para esta métrica es 20. Si algún ejemplo muestra un valor inferior a 20, los resultados de la muestra deben notificarse como no informativos si no se encuentra ninguna fusión de alta confianza. El estado de esta métrica también se puede determinar en la página de resumen de la ejecución (el estado aparecerá como Fusion QC: Pass o Fusion QC: Number of Unique RNA GSP2 Control Start Sites Low dependiendo de si el valor es mayor o menor que 20). Una fusión de alta confianza en una muestra que no superó esta métrica de control de calidad todavía se puede notificar si se determina que es real (ver más abajo). Generalmente, las puntuaciones de control de calidad más altas que utilizan esta métrica se correlacionan con puntuaciones PreSeq Ct más bajas, como se esperaba (Figura 2).
  4. Interpretación de llamadas de fusión
    1. Escudriña cuidadosamente cada fusión llamada bajo la pestaña Evidencia Fuerte (la mayoría de las fusiones de evidencia fuerte llamadas por el sistema son artifreales). También escanee el contenedor de fusión de evidencia débil, aunque la presencia de una fusión no artística en este contenedor es un evento extremadamente raro. Para evaluar la validez de una fusión, primero tenga en cuenta las métricas Lecturas (/%) e Iniciar sitios.
      NOTA: Por lo general, la confianza en una fusión llamada aumenta cuanto más altas son estas métricas. Las fusiones que son soportadas por menos de 5 sitios de inicio y por menos del 10% de las lecturas de la imprimación de apoyo deben considerarse tan sospechosas como artifas.
    2. Anote los iconos que se muestran en la columna Filtros.
      NOTA: Varios de estos iconos alertan al usuario de una fuente potencial de una llamada artística. Frecuentes entre estos (y que se encuentran principalmente en la débil papelera de las llamadas fusiones) hay casos en los que los socios son paralogs conocidos o muestran similitud entre sí en secuencia (lo que indica probable que se limite erróneamente o se haga una alineación errónea). Otra fuente común de llamadas de fusión artifreales se produce cuando las lecturas que soportan la fusión contienen una alta tasa de error que es indicativa de asignación deficiente al genoma de referencia, y esto se asocia con un icono distinto. Los eventos de lectura transcripcional se identifican a través de otro icono. Estos son comunes y generalmente se ignoran. Varios otros iconos también se utilizan en la interfaz de usuario, pero una descripción completa de todos está fuera del alcance de este artículo. Los artefactos comunes que generalmente pueden ser ignorados sin más investigación incluyen: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, y FCGR2C-MAST.
    3. Visualice las lecturas de soporte para cada fusión potencial haciendo clic en el vínculo Visualizar en la interfaz de usuario, que lleva al usuario a una vista JBrowse basada en web de montones de lecturas individuales compatibles con fusiones. Confirme que las lecturas son generalmente libres de discordancia (aunque es de esperar algo de ruido), que una proporción significativa (idealmente >30 bases) de las lecturas se alinean con el socio de fusión, y que las secuencias inmediatamente adyacentes al punto de interrupción entre los genes y los sitios de encuadernación de imprimación están libres de inserciones o eliminaciones. Confirme que la secuencia alineada incluye la parte de 3' de las secuencias de encuadernación de imprimación para imprimadores que admiten las lecturas de fusión (si no se incluyen porciones de 3', puede ser una indicación de cebado erróneo).
    4. Si las secuencias de codificación de ambos genes están involucradas en la fusión, asegúrese de que el socio de 3' permanezca en fotograma. Haga clic en el enlace Traducción en la interfaz (que dará un estado Verdadero o Falso para cada combinación de secuencia de referencia) y también confirme manualmente que la fusión está en la trama a través de la inspección de los puntos de interrupción llamados en un genoma browser. Los puntos de interrupción llamados se pueden determinar colocando el ratón sobre los puntos rojos en el esquema de fusión.
      NOTA: Dado que la mayoría (pero no todos) los puntos de interrupción genómicos para fusiones legítimas se producen en regiones intrónicas y dan lugar a la división de exons enteros, las fusiones en las que los límites de exón comprenden los puntos de interrupción para ambos socios generalmente se ven con un grado más alto de confianza. Sin embargo, dado que hay muchos ejemplos publicados de puntos de interrupción de pleno sexo medio en fusiones, esto no debe utilizarse como criterios absolutos en la interpretación de una fusión.
    5. Para cada fusión, asegúrese manualmente de que las secuencias adyacentes al punto de interrupción no sean homólogas a las siguientes bases contiguas esperadas para cada interlocutor. Inspeccione todos los posibles exons contiguos en un navegador genómio.
      NOTA: Una fuente común de fusión artifefectiva es la desalineación o el cebado erróneo debido a la homología entre dos socios genéticos, y esto no siempre es llamado por el sistema a través de los iconos descritos anteriormente.

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Resultados

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Se muestran en la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5 son capturas de pantalla de la interfaz de usuario de análisis que demuestran los resultados de una muestra de adenocarcinoma pulmonar. En la Figura 3, se muestra el resumen de ejemplo (arriba) que enumera las fusiones de evidencia fuertes llamadas, así como el estado de control de calidad (en círculo en rojo). La fusión ADCK4-NUMBL (de las ...

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Discusión

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El enriquecimiento objetivo y la preparación de bibliotecas basados en PCR múltiples anclados seguidos de secuenciación de próxima generación son adecuados para la evaluación de la fusión genética multiplexada en muestras de tumores clínicos. Al centrarse en la entrada de ARN en lugar del ADN genómico, se evita la necesidad de secuenciar intrones grandes y repetitivos. Además, dado que este enfoque amplifica las fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión, se detectan nuevas fusiones. Esta e...

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Divulgaciones

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D.L.A. ha recibido honorarios de consultoría de Bayer Oncology, Genentech, AbbVie y Bristol Myers Squibb. K.D.D ha recibido viajes patrocinados de ArcherDx.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Recurso Compartido de Patología Molecular de la Universidad de Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) y por el Centro Colorado de Medicina Personalizada.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 mM Tris HCl pH 8.0IDT11-05-01-13Utilizado para la dilución de TNA
1M Tris pH 7.0Thermo FisherAM9850GUtilizado en la agrupación de bibliotecas
25 mL Depósito de reactivos con divisorUSA Scientific9173-2000Para uso con pipetas multicanal y grandes volúmenes de reactivos
TemPlate Semifaldón de 96 pocillos 0,1 ml Placa de PCR naturalUSA Scientific1402-9700Placa utilizada para los pasos del termociclador
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881Utilizado en la purificación después de varios pasos de ensayo
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Utilizado en la extracción de TNA
Archer FusionPlex Kit de tumores sólidosArcherDXAB0005Este kit contiene la mayoría de los reactivos necesarios para realizar la preparación de bibliotecas para la secuenciación de Illumina (también hay disponibles kits para la secuenciación de Ion Torrent)
Bloque frío, 96 pocillosLight LabsA7079Se utiliza para mantener las muestras refrigeradas en varios pasos
EthanolDecon LabsDSP-MD.43Se utiliza para lavados de perlas
Cuantificación de bibliotecas para el estándar de control interno de IlluminaKapa BiosystemsKK4906Se utiliza para la cuantificación de bibliotecas
Cartones de cuantificación de bibliotecas y mezcla ROX Low qPCRKapa BiosystemsKK4973Utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Estándares de cuantificación de bibliotecasKapa BiosystemsKK4903Utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Placa magnética, 96 pocillos (grado N38)AlpaquaA32782Utilizado en los pasos de purificación de perlas
Juego de adaptadores MBCArcherDXAK0016-48Adaptadores que contienen índices específicos de la muestra para permitir la secuenciación multiplexada
Micro CentrifugeUSA Scientific2641-0016Se utiliza para girar tubos de PCR
MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de 96 pocillosThermo-Fisher4483485utilizado para la cuantificación de QClibrary Pre-Seq
Almohadilla de compresión de película óptica MicroampBiosystems aplicada4312639utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Mini Spinner de placasLabnetMPS-1000Se utiliza para recoger líquido en el fondo de los pocillos de placas
MiSeq Recomponent Kit v3 (600 ciclos)IlluminaMS-102-3003Contiene los componentes necesarios para una ejecución de secuenciación MiSeq
Sistema MiSeqDxIlluminaNGS Instrumento de secuenciación
Modelo 9700 TermocicladorBiosistemasSe utiliza para varios pasos durante Ensayo
Agua libre de nucleasaAmbion9938Se utiliza como diluyente general
ABI óptico Cubiertas de placas de PCR de 96 pocillosThermo-Fisher4311971utilizado para la cuantificación previa de QClibrary
Estación de trabajo de PCR Modelo 600Sistemas de limpieza de aireBZ10119636Pasos de ensayo de banco húmedo realizados en esta 'caja de aire muerto'Proteinasa
KQiagen1019499Utilizado en la extracción de TNA
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139instrumento de qPCR utilizado para la cuantificación de PreSeq y bibliotecas
Qubit RNA HS Assay KitTechnologiesQ32855Uso para determinar la concentración de ARN en muestras
TNA RNasa Away Fisher12-402-178Se utiliza para la descontaminación general de RNasa de áreas de trabajo
Seraseq FFPE Material de referencia de ARN de fusión tumoral Seraseq FFPE v2SeraCare0710-0129Se utiliza como control positivo
de ensayo Hidróxido de sodioFisherBP359-212Se utiliza en los pasos de limpieza y para la configuración de la secuenciación
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Componente del ensayo PreSeq QC
TempAssure PCR Tiras de 8 tubosUSA Scientific1402-2700Se utiliza para la mezcla de reactivos y muestras, etc.
Plantilla RT Película PCR EE. UU. Scientific2921-7800Se utiliza para cubrir placas de 96 pocillos
Fondo en U Microplaca de 96 pocillosLSPMP8117-RSe utiliza durante la purificación de perlas
aplicados Life de

Referencias

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