Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.
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Artículo de método
Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias
En este artículo
Resumen
Resumen
Las investigaciones de factores que influyen en la división celular y la forma celular en las bacterias se realizan comúnmente junto con la microscopía de fluorescencia de alta resolución, ya que las observaciones realizadas a nivel de población pueden no reflejar realmente lo que ocurre a un nivel de célula única. La microscopía timelapse de células vivas permite a los investigadores monitorear los cambios en la división celular o la morfología celular que proporcionan información valiosa sobre la localización subcelular de proteínas y el momento de la expresión génica, como sucede, para ayudar potencialmente a responder preguntas biológicas importantes. Aquí, describimos nuestro protocolo para monitorear los cambios fenotípicos en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus usando un microscopio de desconvolución de alta resolución. El objetivo de este informe es proporcionar un protocolo simple y claro que pueda ser adoptado por otros investigadores interesados en llevar a cabo experimentos de microscopía de fluorescencia para estudiar diferentes procesos biológicos en bacterias y otros organismos.
Introducción
El campo de la biología celular bacteriana se ha visto significativamente mejorado por los recientes avances en las técnicas de microscopía1,2. Entre otros instrumentos, los microscopios que son capaces de realizar experimentos de microscopía de fluorescencia timelapse siguen siendo una herramienta valiosa. Los investigadores pueden monitorear varios eventos fisiológicos en tiempo real utilizando proteínas fluorescentes tales como, fusión de reporteros transcripcionales y traslacionales basados en proteínas fluorescentes verdes (GFP), fluorescentes D-aminoácidos (FDAA)3,o usar otras man....
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Protocolo
1. Condiciones generales de crecimiento
- Inocular 2 ml de medio de crecimiento adecuado suplementado con antibióticos (cuando sea necesario) con una sola colonia de la(s) cepa(s) a la imagen. Incubar estos cultivos de semillas durante la noche a 22 oC en una incubadora de temblores.
NOTA: Las condiciones específicas de crecimiento bacteriano utilizadas en este artículo se proporcionan en la sección de resultados representativos. - Diluir los cultivos nocturnos 1:20 en medios frescos en un matraz de 125 ml, suplemento con antibióticos (cuando sea necesario).
- Cultivar el cultivo(s) a 37 oC en una incubadora de temblores hasta la fase logarí....
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Resultados
Fenotipos GpsB
Anteriormente hemos demostrado que Sa-GpsB es una proteína esencial ya que el agotamiento de GpsB utilizando un ARN antisentido da como resultado la lisis celular9. Aquí describimos cómo la aparición de varios fenotipos de división celular y cambios en la localización de proteínas podrían capturarse utilizando el protocolo de microscopía timelapse descrito en este artículo. Para ello, las cepas de S. aureus RB143 [SH1000 que albergan pEPSA5 (vector vacío.......
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Discusión
La microscopía ha seguido siendo un pilar en los estudios relacionados con organismos microbianos. Dado su tamaño de célula a escala de micrones, los estudios a nivel de una sola célula se han basado tradicionalmente en la microscopía electrónica (EM). Aunque EM se ha convertido en una técnica bastante poderosa en los últimos años, tiene sus propias limitaciones intrínsecas además del acceso limitado de los usuarios16. Las mejoras en las técnicas de microscopía de fluorescencia y el desarrollo de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio por sus comentarios sobre este artículo. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de la Universidad del Sur de Florida (PE).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Fisher BioReactivos | BP160-100 Grado de | Biología Molecular - Baja EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopía |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopía |
| Plato con fondo de vidrio | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopía |
| IPTG | Fisher BioReactivos | BP1755-10 | Sin |
| Microscopio | GE | DeltaVision Elite | Soporte de microscopio invertido Olympus IX-71 personalizado; Torre de iluminación personalizada y módulo iluminador de luz transmitida. Objetivos: PLAPON 60X (N.A. 1,42, WD 0,15 mm); ACEITE OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm); DIC Prisma Nomarski para 100X Objetivo; Cámara CoolSnap HQ2; Montaje SSI 7 colores; Cámara de control ambiental - opaca. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | Inhibidor de FtsZ |
| SoftWorx | GE | Software de imagen suministrado por el fabricante |
Referencias
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
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Reimpresiones y permisos
