Un modelo basado en la línea celular murina de la inhibición crónica de CDK9 para estudiar defectos de alargamiento transcripcional no genéticos generalizados (TEdefinitivamente)en cánceres

Resumen

El protocolo detalla un modelo de carcinoma murino in vitro de alargamiento de transcripción defectuosa no genética. Aquí, la inhibición crónica de CDK9 se utiliza para reprimir el alargamiento productivo del ARN Pol II a lo largo de genes de respuesta proinflamatoria para imitar y estudiar el fenómeno te definitivamente clínicamente sobrecumplido, presente en^{aproximadamente} el 20% de todos los tipos de cáncer.

Resumen

Hemos informado previamente que un subconjunto de cánceres se define por la desregulación transcripcional global con deficiencias generalizadas en el alargamiento de transcripción de ARNm (TE), llamamos cánceres como TE^{definitivamente.} En particular, los cánceres TE^{definitivamente} se caracterizan por la transcripción espuria y el procesamiento defectuoso de ARNm en un gran conjunto de genes, como las vías de interferón/JAK/STAT y TNF/NF-B, lo que conduce a su supresión. El TE^{definitivamente} subtipo de tumores en pacientes con carcinoma de células renales y melanoma metastásico se correlaciona significativamente con una respuesta y un resultado deficientes en_{inmunoterapia.} Dada la importancia de investigar los cánceres^{DE, ya} que augura un obstáculo significativo contra la inmunoterapia, el objetivo de este protocolo es establecer un modelo in vitro de ratón TE^para estudiar estos modelos generalizados y no genéticos anormalidades transcripcionales en los cánceres y obtener nuevos conocimientos, nuevos usos de medicamentos existentes, o encontrar nuevas estrategias contra tales cánceres. Detallamos el uso de la inhibición crónica mediada por flavopiridol CDK9 para abrogar la fosforilación de residuos de serina 2 en el dominio de repetición C-terminal (CTD) de ARN polimerasa II (RNA Pol II), suprimiendo la liberación de ARN Pol II en transcripción productiva Alargamiento. Dado que los cánceres TE^{definitivamente} no están clasificados bajo ninguna mutación somática específica, un modelo farmacológico es ventajoso, y mejor imita los defectos transcripcionales y epigenéticos generalizados observados en ellos. El uso de una dosis subletal optimizada de flavopiridol es la única estrategia eficaz para crear un modelo generalizable de alteración generalizada no genética en defectos de elongación de transcripción y procesamiento de ARNm, imitando estrechamente el TE clínicamente observado ^{características definitivamente.} Por lo tanto, este modelo de TE^{definitivamente} se puede aprovechar para diseccionar, factores autónomos celulares que les permiten resistir el ataque celular mediado inmune.

Introducción

Un paso clave que limita la tasa en la expresión de casi todos los genes activos es la transición del ARN polimerasa II (RNA Pol II) de la pausa promotor-proximal a la elongación productiva^1,2. Dado que la desregulación epigenética de la elongación transcripcional ayuda en la progresión de múltiples neoplasias malignas humanas definidas como TE^{definitivamente,}lo que conduce a una señalización subóptima en las vías de respuesta proinflamatoria que equivalen a una respuesta deficiente y el resultado de la inmunoterapia³, el objetivo general de este protocolo es establecer un mo....

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y el Comité Institucional de Bioseguridad de la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati aprobaron todos los procedimientos experimentales de animales (protocolo #2017-0061 del IBC y protocolo IBC #IBC2016-0016), y estos Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Inhibición crónica del ARN Pol II por tratamiento con flavopiridol— estrategia básica

1. Células de melanoma de ratón serie B16/F10 en baja densidad (0,2 x 10⁶) en una placa de cultivo de 10 cm en su ....

Resultados

Aquí, proporcionamos un esquema detallado (Figura 1) para establecer un modelo de células TE^{definitivamente} obtenido por tratamiento crónico subletal(Figura 2) con flavopiridol a 25 nM. En la Figura 3, en 3 días de tratamiento con flavopiridol, las células OVA B16 muestran características parciales de TE^{definitivamente,} pero después de una semana de tratamiento, las células OVA .......

Discusión

El control de alargamiento del ARN Pol II ha surgido como una palanca decisiva para regular la expresión génica sensible al estímulo en beneficio de las células malignas^5,7,8. La superación de la pausa promotor-proximal al alargamiento y posterior producción de ARNm requiere la actividad quinasa de P-TEFb^9,10,11. Nuestro modelo utiliza .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
hhis6FasL	Señalización celular	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
placas de 12 pocillos	Falcon	353043
20% metanol	Fisher Chemical	A412-4
placas de 24 pocillos	Falcon	351147
4– 18% SDS gel de poliacrilamida	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehído	Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
5% leche en polvo	Bio-Rad	170-6404
7-metilguanosina anticuerpo	BioVision	6655-30T
Placas de 96 pocillos	Cellstar	655180
AF647 ratón conjugado CD8	Biolegend
antibiótico y antimicótico	Gibco	15240-062
anti-His anticuerpo	Cell Signaling	2366  P
Señalización	de células antirrabit	7074	Dilución 1:5000
Señalización de células	anti-rata	7077S	Dilución 1:5000
Kit de ensayo Bradford	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421 ratón conjugado CD45	Biolegend	109831
violeta	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Tinte para tinción vivo/muerto fijable e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilución 1:2000
IFN-y alfa;	R& Sistemas D	12100-1
IFN-γ	R& D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminiscent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Kit de aislamiento	Biolegend	480007
NF-κ	Señalización de células	8242s	Dilución 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κ	Señalización de células	3033s	Dilución 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Motivo activo	61083	Dilución 1:500
p-Ser5-RNAPII	Motivo activo	61085	Dilución 1:1000
p-STAT1	Señalización celular	7649s	Dilución 1:1000
RiboMinu Eucariota Kit	Ambion	A10837-08
Tampón RIPA	Santa Cruz Biotecnología	sc-24948
RNAPII	Motivo activo	61667	Dilución 1:1000
STAT1	Señalización celular	9175s	Dilución 1:1000
TNF-α	R& Sistemas D	410-MT-010
total H3	Señalización	4499	Dilución 1:2000
Tri reactivo	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Señalización celular de actina		12620S	Dilución 1:5000
β-ME	G Biociencias	BC98

100727 cristal B B celular