Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer los sitios endógenos de unión al ARN o "huellas" de los complejos de ARN:proteína (RNP) de células de mamíferos. Este enfoque implica dos inmunoprecipitaciones de subunidades RNP y por lo tanto se denomina inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT).
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT) es un método para enriquecer las huellas de ARN de un par de proteínas dentro de un complejo de ARN:proteína (RNP). RIPiT emplea dos pasos de purificación. En primer lugar, la inmunoprecipitación de una subunidad RNP etiquetada es seguida por una digestión leve de RNase y una posterior elución de afinidad no desnaturalizante. Una segunda inmunoprecipitación de otra subunidad RNP permite el enriquecimiento de un complejo definido. Después de una eliminación desnaturalización de ARN y proteínas, las huellas de ARN se convierten en bibliotecas de secuenciación de ADN de alto rendimiento. A diferencia del más popular reticulación ultravioleta (UV) seguido de enfoque de inmunoprecipitación (CLIP) para enriquecer los sitios de unión RBP, RIPiT es independiente de la reticulación UV. Por lo tanto, RIPiT se puede aplicar a numerosas proteínas presentes en el interactome de ARN y más allá que son esenciales para la regulación del ARN, pero no contactan directamente con el ARN o UV-crosslink mal al ARN. Los dos pasos de purificación en RIPiT proporcionan una ventaja adicional de identificar sitios de unión donde una proteína de interés actúa en asociación con otro cofactor. La estrategia de doble purificación también sirve para mejorar la señal limitando el fondo. Aquí, proporcionamos un procedimiento paso a paso para realizar RIPiT y generar bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de huellas de ARN aisladas. También describimos las ventajas y aplicaciones de RIPiT y discutimos algunas de sus limitaciones.
Introducción
Dentro de las células, el ARN existe en complejos con proteínas para formar complejos de ARN:proteínas (RNPs). Los RRP se ensamblan alrededor de proteínas de unión al ARN (RBP, aquellas que unen directamente el ARN) pero también comprenden los RBP no (aquellos que unen los PBP pero no el ARN), y a menudo son dinámicos en la naturaleza. Los BBP y sus cofactores funcionan colectivamente dentro de los RNP para ejecutar funciones regulatorias. Por ejemplo, en la vía de descomposición del ARNm mediado por tonterías (NMD), las proteínas UPF (UPF1, UPF2 y UPF3b) reconocen el ribosoma terminado prematuramente. Cada una de las proteínas UPF puede unirse al ARN, pero es sólo cu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Establecimiento de líneas de celda hek293 estables que expresan proteína de interés con etiqueta FLAG con etiqueta DE TETRA (POI)
- Células HEK293 semillas con un objetivo de recombinación Flp establemente integrado (FRT) a una densidad de 10 x 104 células/ml en medio de crecimiento (medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM] + 10% suero bovino fetal [FBS] + 1% penicilina-estreptomicina [penn/strep]) en 6- platos de pozo. Permitir que las células crezcan durante la noche en una incubadora humidificada a 37oC y 5% de CO2 (condiciones de crecimiento estándar para todos los pasos posteriores).
- Al día siguiente, las células de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Un RIPiT exitoso resultará en la inmunoprecipitación de proteínas de interés y otras proteínas interactuantes conocidas, y la ausencia de proteínas no interactúas. Como se ve en la Figura 3A,magoh y EIF4AIII se detectaron en la elución RIPiT, pero HNRNPA1 no lo fue (carril 6). Paralelamente, las huellas de ARN que se han copurificado con los complejos RNP se detectaron mediante autoradiografía (Figura3B) o bioanalizador (Figura<.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí analizamos algunas consideraciones clave para realizar correctamente RIPiT. En primer lugar, las IP individuales deben optimizarse para lograr la máxima eficiencia posible en cada paso. La cantidad de perlas de agarosa FLAG para el número de entrada de células descritas aquí ha demostrado ser robusta para una amplia gama de proteínas que hemos probado. Dado que sólo una pequeña fracción de las proteínas asociadas se coinmunopreciada con la proteína FLAG, la cantidad de anticuerpos necesarias para una segunda IP efic.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención de NIH GM120209 (GS). Los autores agradecen al Núcleo de Recursos Compartidos de OSUCCC Genomics por sus servicios (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gel de afinidad anti-FLAG | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3.000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µ Ci | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Jeringas Desechables con Puntas Luer-Lok (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaína 5M | Sigma | B0300 | |
| biotina-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotina-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sónico, modelo SSE-1 | Branson | ||
| CirLigasa I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligasa I |
| DMEM, alta glucosa | ThermoFisher | 11995-065 | |
| Tampón de carga de ADN NEB NEB | |||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Línea celular | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Escalera | de ADN de rango bajoThermoScientific | FERSM1203 | |
| Higromicina B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 pocillo | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| adaptador miRCAT-33 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| Mirus transIT-X2 reactivo de transfección | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligasa | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ | Cualquiera | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerasa | NEB | M0491S/L | |
| RNasa I, E. coli, 1,000 | U Eppicenter | N6901K | |
| Columna SPIN-X | Corning | CLS8160-24EA | |
| Perlas de estreptavidina | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | enzima transcriptasa inversa |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | oro tinción de gel de ácido nucleico |
| T4 Polinucleótido quinasa-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetraciclina | Sigma | 87128 | |
| Termoestable 5&agudo; Aplicación ADN/ARN ligasa | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCTCTCTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCTCTGGGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquier | protocolo de este protocolo solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCTCTTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCTCTTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCTCTTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCTCTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera | de estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAAG CGTCGTTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ | Cualquiera de | estos protocolos solo es compatible con la plataforma de secuenciación Illumina | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager GE | Healthcare Life Science | 29187191 |
Referencias
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
