Method Article

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

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La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Abstract

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La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.

Introduction

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La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas1,2,3,4, 5,6,7. Esto, en combinación con nuevos pro....

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Protocol

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Todo el trabajo ha sido aprobado por la junta de revisión interna de la Universidad de Michigan.

1. Optimización de anticuerpos primarios y preparación de diapositivas

  1. Determinar la concentración ideal de anticuerpos para multiplex utilizando IHC convencional.
    1. Pruebe los anticuerpos para el multiplex mediante inmunohistoquímica convencional manual (IHC)13.
    2. Utilice tejidos específicos que tengan un tipo de célula abundante para cada anticuerpo analizado, como el uso de tejido de amígdala para pruebas de anticuerpos CD3.
    3. Utilice la concentración de referencia para IHC recomendada por....

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Results

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El proceso general de obtención de un ensayo multiplex de 7 colores sigue un patrón repetitivo. La Figura 1 describe el proceso en forma diagramamática. Una vez que los portaobjetos se cortan y secan o se reciben del laboratorio y se hornean en un horno de hibridación a 60 oC durante 1 h, luego proceder a la desfinación y rehidratación, fijar los portaobjetos en formalina de nuevo seguido de recuperación de antígeno. Cada ronda de multiplexación comienza en la recuperación del antígeno y ter.......

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Discussion

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Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido la evaluación .......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Los autores quieren agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por su ayuda con la configuración y optimización de la tinción multiplex original. Los autores también quieren agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por consejos de uso del software de análisis. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Cáncer bajo el Premio Número P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficia....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% etanolFisherHC8001GAL
70% etanolFisherHC10001GL
95% etanolFisherHC11001GL
Software de análisisAkoya BiosciencesCLS135783 inForm versión 2.3.0
Montaje antidecoloraciónThermoFisherP36961ProLong Solución
bloqueo de diamanteVectorSP-6000Bloxall
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
CubreobjetosFisher12-548-5E
Toallita para tareas delicadasKimberly-Clark34120
Diluyente fluorescenteAkoya BiosciencesARD1A01EAÓpalo Diluyente TSA
Fluoróforo 520Akoya BiocienciasFP1487001KT1:100
Fluoróforo 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluoróforo 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluoróforo 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluoróforo 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluoróforo 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluoróforo DAPIAkoya BiosciencesFP14903 gotas en TBST o PBS
Caja resistente al calorTissue-Tek25608-904Caja portaobjetos de plástico-verde
Cámara humidificadaIbi ScientificAT-12
Horno de hibridaciónFisherBiotech
Bolígrafo de barrera hidrofóbicaMicroscopio VectorH-4000ImmEdge
Perkin ElmerCLS140089Mantra estación de trabajo de patología cuantitativa
MicroondasPanasonicNN-A661Scon tecnología inverter
Formalina tamponada neutraFisher ScientificSF100-410% formalina tamponada neutra
Tampón de recuperación de antígenos pH 6Akoya BiosciencesAR600AR6
Tampón de recuperación de antígenos pH 9Akoya BiosciencesAR900AR9
Solución salina tamponada con fosfatoFisherBP3994PBS
Caja portaobjetos de plásticoTissue-Tek25608-906
Envoltura de plásticoFisherNC9070936
Polisorbato 20FisherBP337-800Tween 20
Primario anticuerpo CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Anticuerpo primario CD3DakoA04521:400
Anticuerpo primario CD8Spring BioM53901:400
Anticuerpo primario FOXP3DakoM35151:400
Anticuerpo primario pancitoqueratinaCell Signaling126531:500
Anticuerpo primario PD-L1Cell Señalización136841:200
Anticuerpo secundarioAkoya BiosciencesARH1001EAPolímero de ópalo
Juego de tinción de portaobjetosMicroscopía electrónica Ciencias6254001
solución salina tamponada TrisCorning46-012-CMTBS
Gradilla de portaobjetos verticalCiencias de la Microscopía Electrónica50-294-72
XilenoFisher
de X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

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