Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Summary

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Abstract

Las plantas con flores tienen un sistema de reproducción sexual único llamado "doble fertilización", en el que cada una de las células espermáticas se fusiona con precisión con una célula de óvulo o una célula central. Por lo tanto, dos eventos de fertilización independientes tienen lugar casi simultáneamente. La célula fértil del óvulo y la célula central se desarrollan en cigota y endospermo, respectivamente. Por lo tanto, el control preciso de la doble fertilización es esencial para el desarrollo de semillas subsiguientes. La doble fertilización ocurre en el gametofito femenino (sac embrionario), que está profundamente oculto y cubierto con tejidos gruesos de ovulo y ovario. Esta construcción de tejido pistilo hace que la observación y el análisis de la doble fertilización sean bastante difíciles y ha creado la situación actual en la que muchas preguntas sobre el mecanismo de doble fertilización permanecen sin respuesta. Para la evaluación funcional de un candidato potencial para el regulador de la fertilización, el análisis fenotípico de la fertilización es importante. Para juzgar la realización de la fertilización en Arabidopsis thaliana, las formas de señales de fluorescencia que etiquetan núcleos espermáticos se utilizan como indicadores. Una célula espermática que no fertiliza se indica mediante una señal de fluorescencia condensada fuera de los gametos femeninos, mientras que una célula espermática que fertiliza con éxito está indicada por una señal decondensada debido a la karyogamía con el núcleo de los gametos femeninos. El método descrito aquí proporciona una herramienta para determinar la fertilización exitosa o fallida en condiciones in vivo.

Introduction

Las plantas con flores producen semillas a través de la doble fertilización, un proceso que se controla directamente mediante interacciones entre proteínas localizadas en la membrana plasmática gameto^1,2. La floración de los gametos masculinos de las plantas, un par de espermatozoides, se desarrollan en el polen. Un tubo de polen que crece después de la polinización entrega un par de espermatozoides a gametos femeninos, una célula de óvulo y una célula central, que se desarrollan en un saco embrionario. Después de que los gametos masculinos y femeninos se encuentran, las proteínas en la superficie del gameto p....

Protocol

1. Polinización artificial

NOTA: Antes de iniciar el proceso, se requiere un par de fórceps No. 5.

1. Crecer A. thaliana (Col-0) a 22oC bajo un ciclo oscuro de 16h de luz/8-h en una cámara de crecimiento.
   NOTA: Corta y retira el primer tallo de flor desarrollado con tijeras para promover el desarrollo de cogollos axilares. Las plantas de crecimiento vigoroso (2-3 semanas después del corte del primer tallo; altura de la planta alrededor de 25 cm) son adecuadas para el análisis.
2. Para emascular, retire el sépalo (Figura1B),el pétalo (Figura

Results

Los ovules de un pistilo polinizado con DMP9^{KD/HTR10-mRFP} fueron recogidos a 7-8 HAP y observados.

La mayoría de los óvulos contenían dos núcleos de espermatozoides descondensados etiquetados con mRFP en las posiciones del núcleo de la célula del óvulo (lado micropylar) y de la célula central (lado final del carácter), respectivamente (Figura3A),lo que indica una fertilización d.......

Discussion

Etiquetas HTR10-mRFP cromatina paterna (es decir, visualiza núcleos de células espermáticas), y la dinámica en la fertilización doble se han reportado⁷. Inmediatamente después de la liberación de un tubo de polen, los núcleos de espermatozoides con etiqueta HTR10-mRFP todavía se condensan. Sin embargo, cada uno de los núcleos espermáticos se descondensa al fusionarse con un núcleo de gameto femenino fertilizado en karyogamy de tres a cuatro horas después de la fusión de la membrana del gameto

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Microscopio de epifluorescencia	Olympus
Cubierta de vidrio	Matsunami	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP antecedentes Takahashi et al. (2018)6
Cinta	adhesiva de doble caraNichiban	NW-15S	15 mm de ancho
DP72	Cámara Olympus		Degital
Pinzas	Vigor		Cualquier pinza No. 5 está disponible
Cámara de crecimiento	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
em>HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia-0 (Col-0) antecedentes Ingouff et al. ( 2007)7
Aguja de inyección	Terumo	NN-2719S	27 G
Vidrio	deslizante Matsunami glass	S9443
SZX9	Microscopio de disección	Olympus
U-MRFPHQ	Olympus		Cubo de filtro de fluorescencia (Excitación: BP535-555, Emisión: BA570-625, Espejo dicromático: DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Lente de objetivo (NA 1.3), inmersión en aceite
UPlanSApo 20x	Lente de objetivo Olympus		(NA 0.75), seco