Summary
نحن نبرهن على طريقة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل على أساس مورفولوجيا الحيوانات المنوية النووية في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس باستخدام مجهر الظهارة.
Abstract
النباتات المزهرة لديها نظام استنساخ جنسي فريد يسمى "الإخصاب المزدوج"، حيث كل من خلايا الحيوانات المنوية الصمامات على وجه التحديد مع خلية البيض أو خلية مركزية. وهكذا، يحدث حدثان مستقلان للإخصاب في وقت واحد تقريبا. تتطور خلية البويضة المخصبة والخلية المركزية إلى الزيجوت والحيوانات المنوية، على التوالي. ولذلك، فإن السيطرة الدقيقة على الإخصاب المزدوج أمر ضروري لتطوير البذور الناجمة عن ذلك. يحدث الإخصاب المزدوج في اللجامفيت الإناث (كيس الجنين)، والتي هي مخبأة بعمق ومغطاة بأنسجة البويضة والمبيض سميكة. هذا البناء الأنسجة pistil يجعل مراقبة وتحليل الإخصاب المزدوج من الصعب جدا، وخلق الوضع الحالي الذي العديد من الأسئلة المتعلقة بآلية الإخصاب المزدوج لا تزال دون إجابة. وللتقييم الوظيفي لمرشح محتمل لتنظيم الإخصاب، من المهم إجراء تحليل للإخصاب. للحكم على الانتهاء من الإخصاب في التلاحيّة العربية، تُستخدم أشكال إشارات الفلورة التي تصف نوى الحيوانات المنوية كمؤشرات. يشار إلى خلية الحيوانات المنوية التي تفشل في الإخصاب بإشارة الفلورة المكثفة خارج اللجام الإناث، في حين أن خلية الحيوانات المنوية التي يتم إخصابها بنجاح يشار إليها بإشارة منزوعة المكثف بسبب karyogamy مع نواة اللجام الإناث. توفر الطريقة الموضحة هنا أداة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل في ظروف الجسم الحي.
Introduction
النباتات المزهرة تنتج البذور من خلال الإخصاب المزدوج، وهي عملية يتم التحكم فيها مباشرة من خلال التفاعلات بين البروتينات المترجمة على غشاء البلازما gamete1،2. المزهرة نبات الذكور gametes، زوج من خلايا الحيوانات المنوية، وتطوير في حبوب اللقاح. أنبوب حبوب اللقاح الذي ينمو بعد التلقيح يسلم زوج من خلايا الحيوانات المنوية إلى اللجام الإناث، وخلية البيض والخلية المركزية، والتي تتطور في كيس الجنين. بعد أن يجتمع المدرس الذكور والإناث، والبروتينات على سطح gamete تعزيز الاعتراف، والتعلق، والانصهار لاستكمال الإخصاب المزدوج. في الدراسات السابقة، تم تحديد البروتينات غشاء الجاميت الذكور الخلية المولدةمحددة 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3،4 وGAMETE أعرب 2 (GEX2)5 كمنظمي الإخصاب المشاركة في اندماج gamete و المرفق، على التوالي. لقد حددنا مؤخرًا بروتين غشاء خاص بـ gamete للذكور، DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9)، كمنظم للإخصاب يشارك في تفاعل gamete. وجدنا أن انخفاض التعبير DMP9 يؤدي إلى تثبيط كبير من تخصيب خلايا البيض خلال الإخصاب المزدوج في A. thaliana6.
كما يحدث الإخصاب المزدوج في كيس الجنين، الذي هو جزء لا يتجزأ من البويضة التي هي ملفوفة أكثر مع أنسجة المبيض، فمن الصعب مراقبة وتحليل حالات عمليات الإخصاب المزدوج. ولهذا السبب، لا تزال هناك العديد من النقاط غير الواضحة التي تعوق الفهم الكامل للآلية الكاملة لمراقبة الإخصاب المزدوج. إن إنشاء تقنيات مراقبة لتتبع سلوك الغمت أثناء الإخصاب المزدوج في ظل ظروف الجسم الحي أمر لا غنى عنه للتحليل الوظيفي للمرشحين المحتملين لمنظمي الإخصاب. وقد أسفرت الدراسات الحديثة خطوط علامة حيث يتم تسمية الهياكل دون الخلوية gamete مع البروتينات الفلورية. في هذه المقالة، نقوم بإظهار بروتوكول بسيط وسريع لمراقبة الإخصاب المزدوج الذي حدث في كيس جنين مشتق من البتيلات الملقحة بشكل مصطنع. باستخدام خط علامة نواة خلية الحيوانات المنوية HTR10-mRFP7، يمكن التمييز بين حالة الإخصاب لكل غمت أنثى على أساس مورفولوجيا الإشارات النووية للنطفو. بروتوكولنا الذي يركز على مثل هذا التغيير المورفولوجي لنوى الحيوانات المنوية عند الإخصاب يمكن أن يحصل بكفاءة على كمية كافية من البيانات لإثبات الإحصائية. تم استخدام خط DMP9-الضربة القاضية مع خلفية HTR10-mRFP(DMP9KD/HTR10-mRFP)كنباتات ذكرية لإظهار نمط تخصيب واحد. كما أن البروتوكول مناسب للتحليل الوظيفي لمنظمي الإخصاب الآخرين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التلقيح الاصطناعي
ملاحظة: قبل بدء العملية، مطلوب زوج من الملقط رقم 5.
- تنمو A. thaliana (كول-0) في 22 درجة مئوية تحت 16 ساعة ضوء / 8-ساعة دورة مظلمة في غرفة النمو.
ملاحظة: قطع وإزالة أول ساق زهرة المتقدمة مع مقص لتعزيز تطوير براعم الإبط. النباتات المتنامية بقوة (2-3 أسابيع بعد قطع ساق الأولى؛ ارتفاع النبات حوالي 25 سم) هي مناسبة للتحليل. - لإزالة السبالة (الشكل 1B) ، البتلة (الشكل 1C) ، والستايمن (الشكل 1D) من براعم الزهور في المرحلة 118 (الشكل 1A) باستخدام الملقط رقم 5. برعم مع بت من بتلات ينظر في الجزء العلوي هو أفضل.
ملاحظة: استخدام مناسبة خط علامة gamete الإناث. في هذا البروتوكول، استخدمنا نبات نوع البرية كوالد الإناث. - بعد 15 إلى 18 ساعة من الإنعدام، خذ الكنات من زهرة DMP9KD/HTR10-mRFP في المرحلة 138 عن طريق الضغط على خيوط مع ملقط.
- للتلقيح، وبات بلطف وصمة العار من pistil المبتورة عدة مرات مع anther dehiscent.
2. إعداد الأوفيول للمراقبة
ملاحظة: البنود التالية مطلوبة: زجاج الشريحة مع الشريط على الوجهين المرفقة، No. 5 ملقط، إبرة حقن 27 G، والمجهر تشريح.
- 7 إلى 8 ح بعد التلقيح (HAP)، وجمع pistil ووضعها على الشريط على الوجهين، ثم اضغط بلطف مع ملقط لإصلاح pistil على الشريط (الشكل2A،A').
ملاحظة: معظم البويضات في pistil تلقي أنبوب حبوب اللقاح واحد على الأقل 10 HAP9. إذا فشل كل من أو أي من خلايا الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح الأول في الإخصاب، سيتم جذب أنبوب حبوب اللقاح الثاني من قبل البويضة بسبب نظام استعادة الإخصاب10. لتحليل مورفولوجيا نواة الحيوانات المنوية من أنبوب اللقاح الأول ، فمن المستحسن إكمال إعداد البويضة من قبل 10 HAP على أبعد تقدير. - قطع الطرفين العلوي والسفلي من المبيض باستخدام إبرة حقن تحت المجهر تشريح (الشكل2B،B').
- شق جدار المبيض على طول جانبي replum (الشكل2C،C')عن طريق تحريك غيض من إبرة الحقن.
ملاحظة: أدخل إبرة الحقن بشكل ضحل لمنع فصل البويضة من الحاجز. - Evert جدار المبيض باستخدام إبرة الحقن (الشكل2D،D').
- قرصة قاعدة الحاجز الذي ترتبط البويضات، ورفعه بعناية مع ملقط (الشكل2E).
- نقل البويضات في قطرة من الماء على زجاج الشريحة، وتغطي بلطف مع غطاء الزجاج للمراقبة تحت المجهر الفلوري (الشكل2E،E').
3. الفحص المجهري
ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمنا مجهر الظهارة مجهزة مكعب فلتر الفلورة (انظر جدولالمواد)، وكاميرا رقمية، والبرمجيات المصاحبة.
- الحصول على صور من البويضات التي تحتوي على نوى الحيوانات المنوية المسمى مع mRFP باستخدام عدسة موضوعية 20X أو 40X والكاميرا الرقمية المجهزة.
- تأكد من عدد نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
ملاحظة: يمكن تضمين البويضات التي تحتوي على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في حجم السكان للتحليل الإحصائي. - تأكد من شكل وموقع كل نواة من ونواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
ملاحظة: مباشرة بعد إطلاق سراحمن أنبوب حبوب اللقاح، يتم ترجمة زوج من نوى الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP بين البويضة والخلية المركزية. تشير نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP التي تم اكتشافها على جانب نهاية التشالازال إلى تخصيب الخلايا المركزية، على سبيل المثال. باستخدام مناسبة الإناث gamete غشاء علامة خط، كما هو مبين في الشكل التكميلي 1، ما إذا كانت خلية الحيوانات المنوية تمر plasmogamy (بعد الانصهار الغشاء ولكن قبل karyogamy) يمكن رصدها بوضوح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم جمع البويضات من pistil الملقحة مع DMP9KD/HTR10-mRFP في 7-8 HAP ولاحظ.
تحتوي معظم البويضات على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في خلية البويضة (الجانب المجهري) والخلية المركزية (الجانب الطرف الأخير من الشارازال) على التوالي (الشكل 3A)،مما يشير إلى الإخصاب المزدوج الناجح. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت البويضات التي تحتوي على نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP decondensed في نواة الخلية المركزية بالإضافة إلى نواة الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP خارج خلية البويضة (الشكل3B)،مما يشير إلى تخصيب واحد. في حالة فشل الإخصاب المزدوج، لوحظ توجد نواة الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP عند حدود خلية البويضة والخلية المركزية (الشكل3C)،كما هو الحال في خلايا الحيوانات المنوية المتحولة gcs1 (الشكل3D)3،4 .
في التحليل باستخدام حبوب اللقاح DMP9KD /HTR10-mRFP، نادرا ما لوحظت البويضات التي تحتوي على نواة الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل اسم mRFP (الشكل4A)أو ثلاثة أو أكثر من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP (الشكل4B).
الشكل 1: براعم الزهور مناسبة للاحتساء. (أ) برعم زهرة في المرحلة 11، تظهر بت من بتلات في الجزء العلوي. (باء-دال) برعم زهرة التي تم إزالتها sepals (B) وبتلات (C) والتي تم بعد ذلك emasculated تماما (D). لم يحدث الإنثر الهسة حتى الآن. شريط مقياس = 1 ملم.
الشكل 2: تدفق إعداد عينة البويضة. يتم عرض الإجراءات بواسطةالرسوم التوضيحية (A -E)والصور الفوتوغرافية(A'-E'). (أ، أ') يتم وضع pistil على شريط على الوجهين تعلق على زجاج الشريحة، ويتم قطع نهاياتها العليا والسفلى مع إبرة حقن. (ب، ب') يتم قطع جدار المبيض على طول كلا الجانبين من replum. (C, C') يتم فتح كلا الجانبين من جدران المبيض، everted، والضغط على الشريط لتحديد. (D, D') يتم الكشف عن الحاجز حيث يتم توصيل البويضات في صفائف. (E, E') يتم قرص ة نهاية واحدة من الحاجز ورفعها مع ملقط. يتم نقل الحاجز مع البويضات المتصلة إلى قطرة من الماء على زجاج الشريحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الأنماط الظاهرية للإخصاب التي يحكم عليها مورفولوجيا الإشارات النووية للنطفو في البويضة. (أ) الإخصاب المزدوج الناجح المشار إليه من قبل اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP decondensed (رؤوس الأسهم). (ب) الإخصاب واحد من قبل DMP9KD/HTR10-mRFP خلايا الحيوانات المنوية المشار إليها من قبل واحد نصف مكثف mRFP المسمى نواة الحيوانات المنوية (رأس السهم) ونواة الحيوانات المنوية وصفت mRFP مكثف (السهم). (ج) فشل الإخصاب المزدوج بواسطة خلايا الحيوانات المنوية DMP9KD/HTR10-mRFP المشار إليها من قبل اثنين من نوى الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP (الأسهم). (D) مثال على فشل الإخصاب المزدوج من قبل خلايا الحيوانات المنوية gcs1HTR10-mRFP. تم استخدام خط علامة حيث تم تسمية نواة خلية البيض (EN) مع RFP. يتم القبض على اثنين من النوى الحيوانات المنوية التي تحمل اسم mRFP (الأسهم) دون تخصيب في 18 HAP. (هـ)رسم تخطيطي لالبويضة. EC = خلية البيض، CC = الخلية المركزية، SC = الخلايا التآزرية، ES = كيس الجنين، MP = micropyle، CHZ = نهاية chalazal. قضبان مقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إمكانات أخرى الإخصاب الأنماط الظاهرية. نادراً ما تحتوي البويضات من التلقيح مع DMP9KD/HTR10-mRFP على نواة الحيواناتالمنوية ذات العلامات mRFP المكثفة (A) أو ثلاثة أو أكثر من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP (B) (الأسهم). قضبان مقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: نواة الحيوانات المنوية المكثفة عند اللطافة أثناء الإخصاب، التي يتم الحكم عليها بمزيج مع خط علامة غشاء البلازما الأنثوي. pFWA::GFP-PIP حيث يتم تصور غشاء البلازما الخلية المركزية كان يستخدم كوالد الإناث (GFP). GFP-PIP أيضا تسميات الأغشية الداخلية12. يحتوي البويضة على اثنين من نوى الحيوانات المنوية ذات العلامات mRFP المكثفة (الأسهم; RFP). تظهر إشارة RFP في الجانب الطرف charazal (السهم) في الخلية المركزية (دمج)، مما يشير إلى أن نواة الحيوانات المنوية في plasmogamy (بعد الانصهار غشاء الجاميت، ولكن قبل karyogamy). اللوحة على اليمين هي تكبير للمنطقة المحاطة بخطوط متقطعة في الصورة المدمجة. وتتطابق المساحة الفارغة التي تحمل علامة نجمية مع موضع نواة الخلية المركزية. يشير الخط المتقطع إلى الخطوط العريضة للخلية المركزية التي تواجه خلية البيض. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mRFP تسميات الكروماتين الأبوي (أي، تصور نوى خلايا الحيوانات المنوية)، وقد تم الإبلاغ عن ديناميات في الإخصاب المزدوج7. مباشرة بعد الإفراج عن أنبوب حبوب اللقاح، لا تزال تتكثف نواة الحيوانات المنوية HTR10-mRFP المسمى. ومع ذلك، يتم إزالة المكثفات كل من نوى الحيوانات المنوية عند الاندماج مع نواة الجاميت الإناث المخصبة في karyogamy ثلاث إلى أربع ساعات بعد الانصهار غشاء gamete7. تبقى خلايا الحيوانات المنوية غير المخصبة مكثفة، كما هو موضح في كيس الجنين الذي يتم القبض على خلايا الحيوانات المنوية gcs1 دون تخصيب (الشكل 3D). عادة، عندما يتم استخدام HTR10-mRFP الخصبة كوالد حبوب اللقاح، 57.9٪ ± 17.8٪ (يعني ± s.d.؛ n = 16 pistils) من البويضات في pistil في 7-8 HAP تحتوي على اثنين من إشارات ننويالحيوانات المنوية المسمى mRFP، وجميع الإشارات تقريبا (97.2٪) هي decondensed، مما يعكس الإخصاب المزدوج الناجح (يظهر نمط إشارة مماثل في الشكل 3A). في حالة DMP9KD/HTR10-mRFP، لوحظت البويضات التي تحتوي على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP على تردد مماثل لتردد HTR10-mRFP، ولكن 17.6٪ منها أظهرت تخصيب واحد6. اعتمدنا ديناميات HTR10-mRFP لمراقبة عدد كبير من البويضات تحت في ظروف الجسم الحي باستخدام مجهر الظهارة. البروتوكول بسيط وسريع، مما يتيح جمع بيانات كافية لإثبات الإحصاءات. باستخدام هذا البروتوكول كحالة أولى، تم إثبات أهمية الإخصاب الوحيد للخلية المركزية بواسطة خلايا الحيوانات المنوية DMP9KD/HTR10-mRFP 6.
استناداً إلى الاختلافات المورفولوجية لنوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة HTR10-mRFP المستمدة من أنبوب حبوب اللقاح الواحد، يتم تصنيف أنماط الإخصاب إلى ثلاثة أنماط ظاهرية: (1) الإخصاب المزدوج الناجح، والذي يتميز باثنين من المكثفات HTR10-mRFP المسمى ننوي الحيوانات المنوية (الشكل3A)؛ (2) الإخصاب واحد، والذي يتميز واحد مكثف HTR10-mRFP المسمى نواة الحيوانات المنوية وواحدة decondensed HTR10-mRFP المسمى نواة الحيوانات المنوية (الشكل3B)؛ و(3) فشل الإخصاب المزدوج، الذي يحتوي على اثنين من النوى HTR10-mRFP وصفت الحيوانات المنوية (الشكل3C).
وينبغي النظر في الأسباب المحتملة الأخرى للأنماط الظاهرية (2) و(3). وقد أفيد أن خلايا الحيوانات المنوية تبدأ على التوالي plasmogamy مع خلية بويضة أو خلية مركزية بعد عدة دقائق من إطلاقها في كيس الجنين في ظل ظروف الثقافة شبه في المختبر11. وبالإضافة إلى ذلك ، يوجد فارق زمني لبضع دقائق بين الإخصاب الأول والثاني ، على الرغم من عدم وجود تفضيل لترتيب تخصيب خلية البويضة والخلية المركزية11. لذلك، قد يشير زوج من نوى الحيوانات المنوية المكثفة ومنزوعة المكثفات في النمط الظاهري (2) إلى فارق زمني بين الإخصاب بدلاً من الإخصاب المفرد. ولتأكيد حدوث تخصيب وحيد على تردد كبير في النمط الظاهري (2)، ينبغي فحص عدد من العينات الكافية للتحليل الإحصائي. النمط الظاهري (3)، الذي يحتوي على اثنين من نوى الحيوانات المنوية المكثف (الشكل3C)،يمكن أن تعكس فترة من الجمود من خلايا الحيوانات المنوية قبل الانصهار غشاء البلازما12 أو الفترة بين plasmogamy وkaryogamy. لذلك، اثنين من نوى الحيوانات المنوية المكثففي 7-8 HAP لا تعكس تماما "فشل" الإخصاب المزدوج، وأنه من الضروري مراقبة البويضات في وقت لاحق بعد التلقيح لتقييم نجاح أو فشل الإخصاب المزدوج. في هذا الصدد، ينصح بمراقبة البويضات في 16-18 HAP، لأن معظم البويضات قد أكملت الإخصاب المزدوج مع خلايا الحيوانات المنوية التي يتم تسليمها بواسطة أنبوب اللقاح الأول، وإشارات HTR10-mRFP لننوي الحيوانات المنوية غير المخصبة ستبقى حتى القادم يوم التلقيح، كما هو مبين في الشكل 3D.
نادراً ما تم الكشف عن نمط من نواة الحيوانات المنوية ذات العلامات HTR10-mRFP (الشكل4A)،والتي كان من المرجح أن يرجع ذلك إلى الاختفاء السريع لإشارة أخرى من HTR10-mRFP الأبوية في اللجامالإناث المخصبة نتيجة للإخصاب الواحد. في هذا التحليل، تم الكشف عن ثلاثة أو أكثر من HTR10-mRFP المسمى ننوي الحيوانات المنوية كحالة نادرة (الشكل4B)،وذلك بسبب قبول أنبوب حبوب اللقاح الثاني من قبل نظام استعادة الإخصاب10. في هذا البروتوكول، تم استبعاد هذه الحالات من البيانات، لأن تتبع سلوكيات اثنين من خلايا الحيوانات المنوية المستمدة من أنبوب حبوب اللقاح واحد أمر بالغ الأهمية للتقييم الدقيق.
وبما أن القطبية لمواقف اللاعبات في كيس الجنين منظمة تنظيماً جيداً (أي أن خلية البيض والخلية المركزية تميزان في الجانب المجهري والتشالازال، على التوالي)، وهو ما يمكن الحكم عليه من قبل الأقارب. مواقف من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل اسم mRFP. ومع ذلك، هناك قيود في التمييز بين الدول غير المخصبة وplasmogamy، لأن كلا الدولتين يشار إليها من قبل إشارة نواة الحيوانات المنوية المكثفة. لتقييم ما إذا كان قد حدث الأفلاطونية بعد الانصهار غشاء gamete أم لا عندما يتم تكثيف نواة الحيوانات المنوية، فإنه مطلوب لاستخدام خطوط علامة غشاء الجاميت الإناث، كما ذكرت تاكاهاشي وآخرون (2018)6. على سبيل المثال، عندما تم استخدام نبات pFWA::GFP-PIP 12 الذي تم فيه تصور غشاء بلازما الخلية المركزية كوالد أنثى، فمن الواضح أن خلية الحيوانات المنوية المنصهرة مع الخلية المركزية كانت في plasmogamy (الشكلالتكميلي 1 ).
وباختصار، يمكن استخدام بروتوكولنا الموصوف هنا للتقييم الإحصائي لنجاح أو فشل الإخصاب في كل لعبة نسائية. على الرغم من أن استخدام علامة غشاء البلازما الإناث مطلوب للحكم على plasmogamy، أسلوبنا مفيد للتحليل الوظيفي للمنظم الإخصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل منحة كاكينجي المقدمة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JP17H05832 إلى T.I.) وبتمويل من برنامج تعزيز البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للعلوم الجزيئية النباتية الكيميائية، جامعة شيبا (اليابان).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
