El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.
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Artículo de método
Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16
En este artículo
Resumen
Resumen
Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.
Introducción
La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicac....
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Protocolo
NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagación de virus, determinación de la sentenciadeda de virus y conceptos de unidades formadoras de placas (PFU) o multiplicidad de infección (MOI), se remite al lec....
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Resultados
El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de.......
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Discusión
En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El "ensayo de tiempo de adición de fármacos" permite determinar ampliamente el objetivo potencial d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos al Dr. Joshua Beckham de la Universidad de Texas en Austin por el apoyo técnico con acoplamiento molecular. Este estudio fue apoyado en parte por la financiación del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. y L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 y MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehído | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugado anti-ratón IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Anfotericina B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anticuerpo anti-VP1 | Anticuerpo Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71, reacción cruzada con Coxsackie A16, clon 422-8D-4C-4D |
| Citómetro Beckman Coulter | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Cristal violeta | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehído | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prisma | GraphPad | ||
| Sal sódica de heparina | Sigma | H3393 | |
| Kit de ensayo de toxicología in vitro, basado en XTT | Sigma | TOX2 | |
| Metilcelulosa | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrö Dinger | ||
| UCSF Chimera | Universidad de California, San Francisco |
Referencias
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 2....
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Reimpresiones y permisos
