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Artículo de método

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

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DOI:

10.3791/59949

⸱

17 de diciembre de 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Resumen

La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.

Introducción

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la CAR. Un tercer dominio coestimulante se incluye para mejorar la función de las células T, injerto, metabolismo, y la persistencia. El éxito de la terapia con células T CAR en diversas neoplasias malignas hematopoyéticas incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y mieloma múltiple pone de relieve la promesa terapéutica de este enfoque1,2,3,4,5,6. Las recientes aprobaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para dos terapias de células T CAR específicas de CD19, tisagenlecleucel para ADULTOs pediátricos y jóvenes adultos ALL y axicabtagene ciloleucel para linfoma difuso de células B grandes, refuerza el mérito traslacional de la Terapia de células T CAR.

Los enfoques basados en T DE CAR implican el aislamiento de los glóbulos T de la sangre periférica, la activación, la modificación genética y la expansión ex vivo. La diferenciación es un parámetro importante que regula la eficacia de las células T de la CAR. En consecuencia, la restricción de la diferenciación de células T durante el cultivo ex vivo mejora la capacidad del producto infundido para injertar, expandir y persistir, proporcionando inmunovigilancia a largo plazo después de la transferencia adoptiva2,7,8,9. Las células T consisten en varios subconjuntos distintos, incluyendo: células T ingenuas (Tn), memoria central (Tcm), memoria del efector (Tem), efector diferenciado (Tte) y memoria de células madre (Tscm). Los células T diferenciadas por efector tienen una potente capacidad citolítica; sin embargo, son de corta duración y injertan mal10,11,12. Por el contrario, las células T con un fenotipo menos diferenciado, incluidas las células T ingenuas y Tcm, presentan capacidades superiores de injerto y proliferación tras la transferencia celular adoptiva13,14,15,16,17,18. La composición de las células T recogidas en el producto prefabricado puede variar entre los pacientes y se correlaciona con el potencial terapéutico de las células T CAR. La proporción de células T con un inmunofenotipo de forma ingenua en el producto de aféresis inicial está altamente correlacionada con el injerto y la respuesta clínica19.

La duración del cultivo es un parámetro importante que influye en la diferenciación en las células T CAR preparadas para la transferencia adoptiva. Recientemente desarrollamos un enfoque para generar células T CAR de calidad superior utilizando un paradigma de cultivo abreviado20. Utilizando nuestro enfoque, mostramos que el cultivo limitado da lugar a células T CAR con función efectora superior y persistencia después de la transferencia adoptiva en modelos de xenoinjerto de leucemia. Aquí, presentamos los enfoques para generar confiablemente células CART19 (células T autólogas diseñadas para expresar scFv anti-CD19 conectados a CD3 y los dominios de señalización 4-1BB) e incluir una descripción detallada de los ensayos que proporcionan información sobre la bioactividad y eficacia de CAR T antes de la transferencia adoptiva.

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Protocolo

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.

1. Activación, transducción y expansión de células T

  1. Active células T humanas primarias frescas o crioconservadas mezclando con cuentas magnéticas anti CD3/CD28 (por ejemplo, cuentas de dinadas) a una proporción de 3 perlas por célula T en platos de cultivo celular de 6 polos. Células T de cultivo en x-VIVO 15 medio suplementado con 5% de suero AB humano normal, 2 mM de L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/ml). Mantenga las células T a una concentración de 106 células T/ml durante la expansión. Cultivo de células T a 37oC, 20% O2y 95% de humedad con 5%CO2.
  2. Después de la estimulación durante la noche, agregue el sobrenadante lentiviral a las células T activadas. Calcular el volumen de sobrenadante necesario para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 3 a 5.
    NOTA: El plásmido de lentivirus CD19-BB-CAR consta de una bisagra CD8, un dominio coestimulador 4-1BB y un dominio de señalización CD3-21. CD19-BB- Supernadante lentiviral se generó como se describió anteriormente21.
  3. En el día 3, recoger una alícuota representativa de células para la criopreservación. Antes de la criopreservación, retire las perlas magnéticas mediante un suave pipeteo y separación magnética. Preparar el medio de congelación que contenga solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenar en 4 oC hasta su uso.
    1. Centrifugar las células T a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de PBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min y desechar el PBS.
    2. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de criopreservación en frío. Congele las células T en un recipiente de congelación refrigerado y guárdelas a -80 oC durante 48 h. Transfiera las células congeladas a nitrógeno líquido.
  4. Lave el resto de las células T una vez en 5 ml de PBS para eliminar el vector residual. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Decantar el PBS y resuspender el pellet celular en el medio de cultivo de células T a una concentración de 0,5 x 106 células/ml.
  5. Divida las células T en dos cultivos, designados para el día 5 y el día 9. Contar las células T por citometría de flujo utilizando cuentas de recuento(Tabla de materiales)y anticuerpos monoclonales para CD4 y CD8 humanos, así como un tinte de viabilidad (Tabla de materiales).
    1. Para medir la concentración de células T, prepare una mezcla maestra que contenga 500 ml de PBS, 5 l de perlas de conteo, 10 ml de la solución de viabilidad celular D de 7-Amino-actinomicina, 4 ml de CD4-FITC y 4 l de CD8-APC. Agregue 40 sl de células T a la mezcla maestra y mida la concentración de células por citometría de flujo en función del número de celdas T activas/recuentos de cuentas de cuentas. Realimentar para mantener los cultivos a una concentración de 0,5 x 106 células/ml cada dos días.
  6. El día 5, cuente y criopreserve las culturas del día 5 como se describe en los pasos 1.3 y 1.5.
  7. En el día 7, lave 0,5 x 106 células T en PBS y resuspenda en 100 l de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS). Detectar la expresión de proteína superficial CAR mediante inmunomanchacon un idiotipo anti-CAR19 conjugado fluorescentemente por citometría de flujo.
  8. El día 9, cuente las culturas del día 9 y criopreserve como se describe en el paso 1.3.

2. Evaluación fenotípica de la diferenciación de células T

  1. Preparar una mezcla maestra que contenga anticuerpos pretitrados para anti-CD3-BV605 (clon OKT3), anti-CD14–Pacific Blue (PB) (clon HCD14), anti-CD19–PB (clon HIB19), anti-CD4–BV510 (clon OKT4), anti-CD8–H7APC (clon SK1), anti-CCR-7-FITC (clon 15053), anti-CD45RO-PE (clon UCHL1), anti-CD27–PE-Cy7 (clon 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clon DX2) y anti-CAR19-APC.
  2. Preparar controles individuales de fluorescencia menos uno (FMO) para controles anti-CD45RO–PE, anti-CCR7–FITC, anti-CD27–PE-Cy7 y anti-CD95–PerCP-Cy5.5 para distinguir las células manchadas positivamente del fondo.
  3. Prepare la solución de tinción de células muertas diluyendo el reactivo vivo/muerto(Tabla de materiales)1:10.000 en PBS.
  4. Descongelar el día 3, día 5, y día 9 Células T que fueron previamente crioreservados. Centrifugar 1 x 106 células T de cada grupo a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante. Lave las células una vez con PBS. Centrifugar a 300 x g durante 3 min y desechar el PBS.
  5. Mezclar las células T con la solución de tinción muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), protegida de la luz.
  6. Agregue 1 ml de tampón FACS para apaciar el tinte de tinción de células muertas. Centrifugar a 300 x g durante 3 min, desechar el sobrenadante y resuspender el gránulos celulares en 100 ml de tampón FACS que contenga el cóctel de anticuerpos descrito en los pasos 2.1 y 2.2. Incubar durante 1 h a 4oC.
  7. Añadir 1 ml de tampón FACS y centrífuga a 300 x g durante 3 min para lavar el anticuerpo no unido. Repita tres veces con el búfer FACS.
  8. Resuspender las células en 1% de paraformaldehida (PFA) y almacenar a 4 oC.
  9. A medida que la expresión CD45RO disminuye después de la fijación, analice las muestras por citometría de flujo después de la inmunomancha. Para evaluar la diferenciación, puerta en el siguiente orden: singlets (FSC-H vs FSC-A), células CD3+ T en vivo (Dump [violeta vivo-muerto, CD14-PB y CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). En CD4+ y CD8+ subconjuntos, puerta en CD45RO-PE vs CCR7-FITC para definir células T ingenuas (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) y Tte (CD45RO-CCR7-). Para identificar El Tscm, la puerta en las células CD27+ T en la población de células T ingenuas. En este compartimiento, Tscm son CD95+ y Tn son CD95-.

3. Análisis Funcional In Vitro

  1. Proliferación de células T CAR y secreción de citoquinas
    1. Verifique la expresión CAR así como la viabilidad de la célula como se describe en los pasos 1.5 y 1.7, por la citometría de flujo.
    2. Lavar 5 x 106 células T de cada grupo (día 3, día 5 y día 9) con PBS y resuspender en una solución de 1 M de solución de diacetato de carboxifluoresceína éster de succinimidil (CFSE) en PBS durante 3,5 min a RT.
    3. Añadir inmediatamente 10 ml de PBS que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) para saciar la reacción.
    4. Centrifugar la solución a 300 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y repita este paso de lavado tres veces. Cuente las celdas al final de la tinción CFSE utilizando un contador Coulter (Tabla de Materiales).
    5. Cosecha células teñidas cfSE (no estimuladas), resuspenden en 1% de PFA y almacenar a 4 oC para su análisis por citometría de flujo.
    6. Incubar el número deseado de células CAR T teñidas con CFSE con células de tipo K562-CD19 (objetivo) irradiadas, así como de tipo K562-wild (control) en una proporción de 1:1 para 120 h en medio de cultivo libre de citoquinas y condiciones de cultivo como se describe en el paso 1.1.
    7. Después de 24 h, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 120 l de sobrenadante celular. Evaluar la producción dependiente de la activación de IL2, IFN, TNF, GM-CSF y otras citoquinas inflamatorias (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) por luminex analiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    8. Sustituya el volumen de sobrenadante que se recopiló en el paso 3.1.7 por un volumen equivalente (120 l) de medio fresco.
    9. En el día 3 (es decir, después de 96 h), cuente y vuelva a alimentar a una concentración de 0,5 x 106 celdas/ml utilizando citometría de flujo basada en perlas como se ha incluido anteriormente en el paso 1.5.
    10. En el día 5, cuente el CD3vivo + las células y calcule el cambio de plegado de las células T vivas en relación con el recuento de células T vivas en el día 0.
    11. Realizar un análisis exhaustivo de la dilución CFSE en la división de células T CAR utilizando el software FlowJo para resaltar rondas sucesivas de la división celular.
      NOTA: Los ensayos de proliferación están bien descritos en el manual de FlowJo.
  2. Ensayo de citotoxicidad
    NOTA: La capacidad de las células CART19 para eliminar las células objetivo que expresan CD19 se evalúa mediante un ensayo de liberación de 51Cr.
    1. Etiquete las células diana mezclando 5 x 105 K562-CD19, células de control de tipo K562-wild, o células de leucemia NALM6 con 50 s de Na251CrO4 y 0,5 ml de RPMI suplementadas con 10% de FBS para 90 min en la incubadora a 37 oC.
    2. Células centrífugas a 300 x g durante 2,5 min. Deseche el sobrenadante radiactivo en recipientes de eliminación adecuados y lave las células diana en 5 ml de PBS. Repita los pasos de lavado dos veces.
    3. Resuspenda las células diana en un medio libre de rojo fenol que contenga un 5% de FBS. Utilice este medio para el resto del procedimiento para reducir el fondo.
    4. Después de evaluar la expresión CAR y la viabilidad celular por citometría de flujo (como se describe en la sección 5.1), mezcle las células T CAR con las celdas de destino etiquetadas en las relaciones effector:target (E:T) de 10:1, 3:1 y 1:1, por triplicado. Transfiera a una placa inferior U de 96 pocillos.
    5. Paralelamente, incluya las células diana solas y las células diana con 1% de sulfato de dodecilo sódico (SDS), para determinar la liberación espontánea (S) y máxima (M) 51Cr, respectivamente.
    6. Células centrífugas a 300 x g durante 5 min e incubar durante 4 h o 20 h en una incubadora de 37oC con 5% deCO2.
    7. Después de la hora designada, centrifugar el recipiente de cultivo a 300 x g durante 5 min. Recoger 35 l de sobrenadante celular y transferirlo a una placa lectora. Evite las burbujas. Deje que el plato se seque durante la noche.
    8. Sellar la placa con un sello de placa estándar y contar con un contador de centelleo líquido. La abundancia de cromo en el sobrenadante proporciona un proxy de la matanza de células objetivo. Calcule el porcentaje de lisis específica de la siguiente manera: 100 x (cuenta por minuto [cpm] versión experimental – liberación cpm S)/ (liberación cpm M – liberación cpm S).

4. Análisis funcional in Vivo

  1. Obtenga ratones DE10 semanas de edad de NOD-SCIDc–/– (NSG), que carecen de un sistema inmunitario adaptativo, y asígnelos al grupo de tratamiento/control aleatoriamente.
  2. Inyectar animales por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 1 x 106 células NALM6 en PBS estéril de 0,1 ml.
  3. Después de 5 a 7 días, confirme el injerto tumoral por imágenes de bioluminiscencia (BLI). Inyectar 150 mg/kg de D-luciferina a ratones que han sido anestesiados con isoflurano (el volumen depende de la masa corporal).
  4. Mida los valores de bioluminiscencia utilizando un sistema de imágenes. Cuantifique el flujo total utilizando el software correspondiente dibujando rectángulos de área idéntica alrededor de ratones, alcanzando desde la cabeza hasta el 50% de la longitud de la cola. Restar el fondo de cada imagen individualmente.
  5. Después de establecer la leucemia, inyectar 3 x 106 día 9 células CART19, 0,5 x 10 6 día3 células T CAR, o las correspondientes células T humanas no transducidas (NTD) a través de la vena de cola en un volumen de 100 ml de PBS estéril/Ca2+.
    NOTA: Como la bioactividad de las células cosechadas a varios intervalos durante el proceso de cultivo es diferente, la concentración elegida de células del día 3 es inferior al día 9.
  6. Para determinar la progresión de la enfermedad, mida los valores de bioluminiscencia dos veces por semana como se describe anteriormente en el paso 4.3.
  7. Para determinar el injerto de células T CAR, recoja sangre de 75 ml mediante sangrado retroorbital en un tubo recubierto con EDTA. Transfiera 50 s de sangre a tubos de conteo absolutos.
  8. Sangre de mancha con anticuerpos contra CD45, CD4, CD8 y CAR durante 30 min a RT. Añadir 400 l de 1x solución de leite FACS a los tubos y vórtice a fondo. Después de la tinción, analice la expresión del marcador de superficie por citometría de flujo.
    NOTA: Otros marcadores de superficie se pueden utilizar para evaluar la diferenciación y el estado de agotamiento de los glóbulos T en la sangre.
  9. Para medir los niveles de citoquinas en la sangre, centrifugar la sangre a 1.200 x g durante 30 min a 4 oC para separar el suero de la capa superior de sangre.
  10. Recoja el suero y mida las citoquinas con una placa de lectura designada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Resultados

Usando los métodos descritos anteriormente, estimulamos y expandimos las células T durante 3 o 9 días(Figura 1A,B). También analizamos su perfil de diferenciación, como lo indica la estrategia de medición esbozada en la Figura 1C,midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Mostramos un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector a lo largo del tiempo durante el cultivo ex viv...

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Discusión

Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 frente al día 9 d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte a través de fondos proporcionados por Novartis Pharmaceuticals a través de una alianza de investigación con la Universidad de Pensilvania (Michael C. Milone) así como el Premio Académico de la Fundación St. Baldrick (Saba Ghassemi).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dynabeads anti CD3/CD28Thermo Fisher40203D
Ratón APC Anti-Humano CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 Anticuerpo anti-CD8 HumanoBD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS Solución de lisis 10X ConcentradoBD Biosciences349202
BD Trucount Tubos de conteo absolutoBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo CD4BioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-humano Anticuerpo CD3BioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Kit de Proliferación Celular LifeTechnolohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC anti-humano CD197 (CCR7) AnticuerpoBD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Ratón anti-humano CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Suero AB humanoValley BiomedicalHP1022
IL-2 IS humano, grado premiumMiltenyi130-097-744
L-glutaminaGibco28030-081
Contador de centelleo líquido, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD Sondas moleculares violetas fijablesL34964
Multisizer Contador CoulterBeckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific Anticuerpo CD14 antihumanoazul BioLegend325616RRID:AB_830689
Anticuerpo CD19 antihumano azulBioLegend302223
PE antihumano Anticuerpo CD45RO BDBiosciences555493RRID:AB_395884
PE/Cy5 antihumano CD95 (Fas) AnticuerpoBioLegend305610RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-humano Anticuerpo CD27Beckman CoulterA54823
Medio sin rojo de fenolGibco10373-017
Solución SDS ultrapura, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferina - K+ SalPerkin Elmer122799

Referencias

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