Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Resumen

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Resumen

La inmunoterapia adoptiva es prometedora para el tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas. Describimos un enfoque simple para transducir células T humanas primarias con receptor de antígeno quimérico (CAR) y expandir su progenie ex vivo. Incluimos ensayos para medir la expresión CAR, así como la diferenciación, la capacidad proliferativa y la actividad citolítica. Describimos ensayos para medir la producción de citoquinas efector y la secreción inflamatoria de citoquinas en células CAR T. Nuestro enfoque proporciona un método fiable y completo para el cultivo de células T CAR para modelos preclínicos de inmunoterapia adoptiva.

Introducción

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) proporcionan un enfoque prometedor para redirigir las células T contra antígenos tumorales distintos. Los CAR son receptores sintéticos que unen un objetivo de antígeno. Aunque su composición precisa es variable, los RCA generalmente contienen 3 dominios distintos. El dominio extracelular dirige la unión a un antígeno objetivo y normalmente se compone de un fragmento de anticuerpo de cadena única vinculado a la CAR a través de una bisagra extracelular. El segundo dominio, comúnmente derivado de la cadena CD3 del complejo del receptor de células T (TCR), promueve la activación de la célula T después de la participación de la C....

Protocolo

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania.

1. Activación, transducción y expansión de células T

1. Active células T humanas primarias frescas o crioconservadas mezclando con cuentas magnéticas anti CD3/CD28 (por ejemplo, cuentas de dinadas) a una proporción de 3 perlas por célula T en platos de cultivo celular de 6 polos. Células T de cultivo en x-VIVO 15 medio suplementado con 5% de suero AB humano normal, 2 mM de L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/ml). Mantenga las células T a una concentración de 10⁶ células T/ml duran....

Resultados

Usando los métodos descritos anteriormente, estimulamos y expandimos las células T durante 3 o 9 días(Figura 1A,B). También analizamos su perfil de diferenciación, como lo indica la estrategia de medición esbozada en la Figura 1C,midiendo la abundancia de glicoproteínas distintas expresadas en la superficie celular. Mostramos un cambio progresivo hacia la diferenciación del efector a lo largo del tiempo durante el cultivo ex viv.......

Discusión

Aquí describimos enfoques para medir la función y eficacia de las células T CAR cosechadas a intervalos variables a lo largo del cultivo ex vivo. Nuestros métodos proporcionan una visión completa de los ensayos diseñados para evaluar la capacidad proliferativa, así como la función del efector in vitro. Describimos cómo medir la actividad de los linfocitos T después de la estimulación a través de la CAR y los modelos de xenoinjerto de detalle de la leucemia utilizando células T CAR cosechadas en el día 3 frente al día 9 d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dynabeads anti CD3/CD28	Thermo Fisher	40203D
Ratón APC Anti-Humano CD8	BD Biosciences	555369	RRID:AB_398595
APC-H7 Anticuerpo anti-CD8 Humano	BD Biosciences	560179	RRID:AB_1645481
BD FACS Solución de lisis 10X Concentrado	BD Biosciences	349202
BD Trucount Tubos de conteo absoluto	BD Biosciences	340334
Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo CD4	BioLegend	317444	RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-humano Anticuerpo CD3	BioLegend	317322	RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Kit de Proliferación Celular Life	Technolohgies	C34554
CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen		C36950
FITC anti-humano CD197 (CCR7) Anticuerpo	BD Pharmingen	561271	RRID:AB_10561679
FITC Ratón anti-humano CD4	BD Biosciences	555346	RRID:AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
Suero AB humano	Valley Biomedical	HP1022
IL-2 IS humano, grado premium	Miltenyi	130-097-744
L-glutamina	Gibco	28030-081
Contador de centelleo líquido, MicroBeta trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD Sondas moleculares violetas fijables		L34964
Multisizer Contador Coulter	Beckman Coulter
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
Pacific Anticuerpo CD14 antihumano	azul BioLegend	325616	RRID:AB_830689
Anticuerpo CD19 antihumano azul	BioLegend	302223
PE antihumano Anticuerpo CD45RO BD	Biosciences	555493	RRID:AB_395884
PE/Cy5 antihumano CD95 (Fas) Anticuerpo	BioLegend	305610	RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-humano Anticuerpo CD27	Beckman Coulter	A54823
Medio sin rojo de fenol	Gibco	10373-017
Solución SDS ultrapura, 10%	Invitrogen	15553027
Via-Probe	BD Biosciences	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-Luciferina - K+ Sal	Perkin Elmer	122799