Summary
Vi presenterer en protokoll for bruk av et protein Microarray konstruert ved å skrive ut influensa antigener på nitrocellulose-belagte lysbilder å samtidig sonde serum for flere antistoff isotypes mot over 250 antigener fra ulike virusstammer, og dermed som tillater måling av bredden av serum antistoffer på tvers av virus under typer.
Abstract
Influensa viruset er fortsatt en betydelig årsak til dødelighet over hele verden på grunn av den begrensede effektiviteten av for tiden tilgjengelige vaksiner. En viktig utfordring for utviklingen av universelle influensa vaksiner er høy antigen mangfold som følge av antigen drift. Overvinne denne utfordringen krever romanen forskning verktøy for å måle bredden av serum antistoffer rettet mot mange virusstammer over ulike antigen under typer. Her presenterer vi en protokoll for å analysere bredden av serum antistoffer mot ulike influensa virusstammer ved hjelp av et protein Microarray av influensa antigener.
Dette influensa antigen Microarray er konstruert ved utskrift renset hemagglutinin og neuraminidase antigener på en nitrocellulose-belagt membran ved hjelp av en Microarray skriver. Human Sera er inkubert på Microarray å binde antistoffer mot influensa antigener. Quantum-dot-bøyd sekundære antistoffer brukes til samtidig å detektere IgG og IgA antistoffer binding til hvert antigen på Microarray. Kvantitativ antistoff binding måles som fluorescens intensitet ved bruk av et bærbart Imager. Representative resultater er vist å demonstrere analysen reproduserbarhet i måling under type-spesifikke og kryss-reaktive influensa antistoffer i menneskelig Sera.
Sammenlignet med tradisjonelle metoder som ELISA, gir influensa antigen Microarray en høy gjennomstrømning multiplekset tilnærming i stand til å teste hundrevis av Sera for flere antistoff isotypes mot hundrevis av antigener i en kort tidsramme, og dermed har programmer i Sero-overvåking og vaksine utvikling. En begrensning er manglende evne til å skille binding antistoffer fra nøytralisere antistoffer.
Introduction
Influensa viruset er ansvarlig for et tap på 20 000 000 livet-år årlig ved død eller uførhet, inkludert 1% av alle dødsfall over hele verden hvert år, med uforholdsmessig innvirkning på eldre og populasjoner i tropene og utvikling av verden1, 2,3. I tillegg til sykdommen byrden av sesongmessige epidemier, fremveksten av romanen influensa stammer via genetiske re-sortiment enten naturlig i felles verter eller kunstig for bioterrorisme kan føre til verdensomspennende pandemier med rask spredning og høy dødelighet 4 andre priser , 5. mens mange influensa vaksiner er for tiden tilgjengelig, er deres effektivitet begrenset av under type spesifisitet6, skape behov for å utvikle universelle influensa vaksiner som gir langvarig immunitet mot flere virus stammer7.
En viktig utfordring for utviklingen av universelle influensa vaksiner er høy antigen mangfold på tvers av stammer. Den antigen spesifisitet av aktuelle vaksiner kombinert med antigen variasjon av sirkulerende virus skaper en konflikt mellom vaksine stammer og sirkulerende stammer. Dette gir en evolusjonær fordel favoriserer ytterligere genetisk drift bort fra vaksine stammer under en epidemi, begrense vaksine effekt ofte til mindre enn 50%8,9. En ekstra kilde til antigen ikke samsvarer er egg-adaptive viral mutasjoner generert under vaksine produksjon, noe som fører til antistoffer som binder dårlig til sirkulerende virus10,11.
Å overvinne denne utfordringen med høy antigen mangfold vil kreve nye forskningsverktøy for å karakterisere bredden av eksisterende og elicited immunresponser på tvers av klinisk relevante antigen varianter i serum og slimhinne prøver. For tiden tilgjengelige metoder, inkludert hemagglutination hemming (HAI), microneutralization (MN), og tradisjonelle ELISA, er begrenset til å påvise antistoffer mot en enkelt virus belastning om gangen, slik at deres bruk for påvisning av flere antistoff isotypes mot flere virusstammer raskt eksos tilgjengelig kliniske prøven og laboratorie ressurser. Videre, HAI og MN forlange bo virus kulturen det er bare anvendelig inne spesialisert laboratorium.
Protein Microarrays, potensielt bestående av opptil tusenvis av antigener trykt på nitrocellulose-belagte lysbilder som vist i figur 1, kan fylle dette behovet12. Disse Microarrays kan produseres og analysert i en høy gjennomstrømming måte mens forbruker små mengder av kliniske prøver for å bestemme kvantitative antistoff isotype/under type nivåer mot hvert enkelt antigen på matrisen. Denne tilnærmingen til antigen funn har blitt brukt til diagnostiske og vaksine utvikling mot flere smittsomme patogener13. Hittil har vi produsert protein Microarrays for over 35 patogener inkludert over 60 000 totalt uttrykt proteiner og brukte dem til å granske over 30 000 menneskelige Sera fra infiserte og kontrollere individer. En nylig utviklet Portable Imaging plattform for Microarray lysbilder har gjort denne metodikken mer tilgjengelig for sluttbrukeren14.
Bygge på omfattende tidligere arbeid av flere bidragsytere i feltet15,16,17,18,19, et influensa protein Microarray ble nylig utviklet som inneholder over 250 renset hemagglutinin (ha) antigen varianter med representasjon av alle 18 under typer12,20. Ved hjelp av denne metodikken, ble en naturlig influensa infeksjon vist å generere bredt reaktive IgG og IgA antistoffer mot phylogenetically relaterte HA undergrupper, mens en intramuskulær influensa vaksinasjon generert bare under type-spesifikke IgG antistoffer21. Men å legge en adjuvant som aktiverer toll-lignende reseptorer til influensa vaksiner ble vist å utvide elicited IgG antistoffrespons over HA undergrupper i dyrestudier22.
Denne Microarray brukes for tiden til å granske Sera samlet inn fra en potensiell kohortstudie av studenter som ble fulgt for influensa infeksjon. Her er metodikken av influensa antigen Microarray med demonstrasjon av analysen reproduserbarhet for å oppdage under type-spesifikke og kryss-reaktive antistoffer i en undergruppe av prøver fra denne studien er rapportert.
Protocol
Alle menneskelige Sera håndteres og avhendes i henhold til godkjente institusjonelle protokoller for biosafety med bruk av beskyttende personlig utstyr. Alt laboratoriepersonell som deltar i denne protokollen har fått opplæring i biosafety og forskningsetikk.
1. Produser influensa antigen Microarrays
-
Design og få antigen satt for Microarray
- Få uttrykt og renset protein antigener som lyofilisert pulver.
-
Skrive ut antigener på Microarray lysbilder
- Rekonstituer hver lyofilisert antigen til en konsentrasjon på 0,1 mg/mL i fosfat-bufret saltvann (PBS) med 0,001% mellom-20 (T-PBS). Overfør 10 μL av hvert rekonstituert antigen til individuelle brønner av en ubehandlet 384-brønn flat bunnplate.
- Skriv ut antigener ved hjelp av en Microarray skriver (den Microarray skriveren som brukes i denne studien er ikke lenger kommersielt tilgjengelig, se diskusjon) med lavt volum Microarray spotting pins som aspirer antigen i prøven kanalen og innskudd via direkte kontakt og kapillær handling på 16-pad nitrocellulose-belagt glass lysbilder.
- Programmere utskriftsprogram varen (f.eks. Gridder) med konfigurasjons-og utskriftsparametrene for kildeplaten.
- Bruk rullegardinmenyen til å velge navnet på platetypen som skal brukes med denne utskriftsmetoden. For denne studien, bruk en ubehandlet 384-brønn flat bunnplate.
- Velg tekstboksen ved siden av antall plater og skriv inn antall prøveplater som skal brukes i denne utskriftsprotokollen. For denne studien, bruk 1 plate.
- Velg en PIN-konfigurasjon som skal brukes med denne metoden. For denne studien, kan du bruke en 8-pinners konfigurasjon.
- Sørg for at Opprinnelses forskyvninger er avstandene (i X-og Y-retningene) mellom lysbilde opprinnelsen (som er kalibrert i administrativ-delen) og plasseringen der utskrift pinnene vil begynne å skrive ut på lysbildene.
- Ved hjelp av kategorien utforming av matrise definerer du størrelsen og formen på matriser (punktavstand og antall punkt per subarray). For denne studien, print 324 flekker (180 μm diameter med 300 μm mellomrom) på 16-pad lysbilder i en 18x18 format ved hjelp av 8 pins.
- Velg parameterne for hvordan utskrift pinnene skal plukke opp og dispensere prøver. For denne studien, hver PIN prøvemålingsaspirasjoner 250 nL av antigen løsning og utskrifter 1 nL på hver av 40 flekker (totalt 20 lysbilder for alle 8 pins)
- Konfigurer PIN rengjørings protokollen og blotting protokollen. For denne studien, hver PIN utskrifter antigen, er dyppet i steril ddH2O i sonikert vaske beholderen, og deretter prøvemålingsaspirasjoner neste antigen.
- Definer sekvensen der eksempel blokkene skal skrives ut på lysbildene. Array-programvaren vil lage en kommentert rutenett indeksfil (. gal) for å beskrive plasseringen av antigener i hver Microarray.
Merk: den øverste raden brukes til fiducials (med fluorescens i alle bølgelengder som brukes i bildebehandling, for eksempel blanding av Qdot 585 NM streptavidin bøye og Qdot 800 NM streptavidin bøye i denne studien) for å orientere rutenett under Imaging. For lang utskrift går, antigener i kildeplaten kan periodevis re-suspendert av pipettering opp og ned og deretter sentrifugering, eller ny kilde plate kan tilberedes og brukes.
- Programmere utskriftsprogram varen (f.eks. Gridder) med konfigurasjons-og utskriftsparametrene for kildeplaten.
- Plasser un-analysert Microarray lysbilder i en Lystett boks og oppbevar i et desikator skap ved romtemperatur for langtidslagring.
Merk: protokollen kan stoppes på ubestemt tid på dette tidspunktet.
-
Utføre kvalitetskontroll sjekk (krever Poly-histidin koder)
- Fest lysbildet til undersøkelser kamre og rehydrate med blokkering buffer som beskrevet i trinn 2.1.1-2.1.2 og vist i figur 2.
- Fortynne musen monoklonale Poly-His antistoff 1:100 i filtrert 1x blokkering buffer.
Merk: Hvis ikke-renset protein antigener (f. eks, uttrykt i in vitro transkripsjon og oversettelse system) er direkte brukes til å skrive ut Microarrays, legge til komponenter av proteinet uttrykket system (f. eks e. coli lysat) i et forhold på 1:10 med blokkerings buffer som brukes for fortynning av serum for å blokkere eventuelle antistoffer rettet mot disse komponentene. - Tilsett 100 μL av fortynnet Poly-hans antistoff mot hvert lysbilde kammer som inneholder array pad etter aspirasjon og ruge for 2 t ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer som beskrevet i trinn 2.2.1. Fortynne biotin-bøyd geit anti-mus IgG sekundært antistoff 1:200 i blokkering buffer, tilsett 100 μL per brønn etter aspirasjon, og ruge for 1 t ved romtemperatur på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer.
- Fortynne Qdot 585 NM streptavidin bøye til 4 nM i blokkering buffer, tilsett 100 μL per brønn etter aspirasjon, og ruge for 1 t ved romtemperatur på shaker. Vask 3x med T-TBS buffer, og deretter en gang med TBS buffer (uten mellom).
- Dissemble og kvantifisere lysbildene som beskrevet i trinn 2.2.5 – 3.1.2.
Merk: protein antigener må inneholde hans10 koder for å bruke denne kvalitetskontroll protokollen. Alternativt, hvis en annen kode er inkludert, kan kvalitetskontroll kontrollen utføres med antistoff eller ligand for den taggen.
2. probe Sera for influensa antistoffer ved hjelp av Microarrays
-
Ruge Sera på Microarrays for antistoff binding
- Fest Microarray lysbilder til kamre ved hjelp av klipp og plasser i rammer som vist i Figur 3.
Merk: du bør alltid unngå å berøre Microarray puten med hender og instrumenter. Sørg for at lysbildene er orientert med puten side opp og det lille hakket i øvre høyre hjørne. - Rehydrate Microarray lysbilder med 100 μL per brønn av filtrert 1x blokkerende buffer, og fortynne serum 1:100 i 100 μL av blokkerende buffer (kan bruke ubehandlede 96-brønn plater eller 2 mL rør). Ruge både rehydrert Microarray lysbilder i dekket rammer og fortynnet Sera separat i 30 minutter ved romtemperatur på orbital shaker på 100-250 RPM. Utfør alle etterfølgende inkubasjons trinn på samme måte på shaker.
Merk: Sera skal være aliquoted og frosset ved-80 ° c for langtidslagring for å minimere fryse-tine sykluser og bør blåste å mikse og sentrifugert for å fjerne partikler før bruk. Observer skyver kamre nøye under og etter dette trinnet for å oppdage eventuelle lekkasjer som krever re-montering Slide kamre. - Bruke pipette tips koblet til en vakuum linje med sekundær samling kolbe, nøye aspirer blokkerende buffer fra hjørne av hvert kammer uten å berøre pads. Utføre alle etterfølgende aspirasjon trinn på samme måte. Legg fortynnet Sera til pads raskt etter aspirasjon for å ikke tillate pads å tørke.
- Plasser dekket rammer i skuffer inne i en sekundær beholder omgitt av fuktige papirhåndklær og forseglet for å hindre fordampning. Ruge over natten ved 4 ° c på rocking shaker (alternativt kan ruge for 2 t ved romtemperatur på orbital shaker ved 100-250 RPM).
- Fest Microarray lysbilder til kamre ved hjelp av klipp og plasser i rammer som vist i Figur 3.
-
Label bundet serum antistoffer med Quantum-dot-bøyd sekundære antistoffer
- Aspirer Sera fra kamre nøye som beskrevet ovenfor, tilsett 100 μL per brønn av T-TBS buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% mellom-20 i ddH2O justert til pH 7,5 og filtrert, kan fås kommersielt), og ruge i 5 min på orbital shaker på 100-250 RPM. Gjenta denne vasketrinn totalt 3x (alle etterfølgende vasketrinn utføres på samme måte).
- Forbered blanding av sekundære antistoffer fortynnet til 1 μM i blokkerings buffer og bland godt av pipettering før og under bruk for å opprettholde homogenitet.
Merk: for å holde analysen reproduserbarhet, bør samme batch av hvert sekundære antistoff brukes for alle undersøkelser eksperimenter som kvantitative sammenligning av data på tvers av eksperimenter er planlagt. Den spesifikke konsentrasjonen av sekundært antistoff må kanskje varieres avhengig av affinitet; følger produsentens protokoller når dette er tilgjengelig. - Aspirer buffer fra kammer etter siste vask, tilsett 100 μL per brønn av sekundær antistoff blanding, og ruge for 2 timer ved romtemperatur på shaker.
- Aspirer sekundære antistoff blanding vaske 3x med T-TBS buffer, og deretter vaske en gang med TBS buffer (uten mellom).
- Dissemble Microarray glir fra kamre forsiktig for å unngå å berøre pads, skyll forsiktig med filtrert ddH2O, og tørk ved å plassere i 50 ml rør og sentrifugering ved 500 x g i 10 min.
- Plasser analysert Microarray lysbilder i en Lystett boks og oppbevar i et desikator skap ved romtemperatur for langtidsoppbevaring.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig i opptil én uke på dette tidspunktet.
3. kvantifisere antistoff binding til antigener innen Microarray
-
Visualiser Microarray lysbilder og kvantifisere spot fluorescens intensitet for å måle antistoff binding
- Erverve profilen av Microarray lysbilder benytter det transportabel image med bygget-inne programvare.
- Velg riktig lysbilde konfigurasjon i kategorien Konfigurer imager . For denne studien, kan du bruke 16-pad lysbilder.
- I bildekontroll kategorien, Velg riktig fluorescerende kanal, og justere gevinsten, eksponeringstid, og oppkjøpet tid avhengig av reaktivitet av Sera å få optimale bilder. For denne studien, den fluorescerende kanaler for IgA og IgG var 585 NM og 800 NM henholdsvis, og Imaging innstillingene var gevinst på 50, eksponeringstid på 500 MS, og oppkjøpet tid på 1 s.
- Klikk på Capture for å starte prosessen med å anskaffe bildet.
Merk: Microarray lysbilder kan bli re-avbildet på flere innstillinger uten nedbrytning av signalet så lenge de er lagret mørkt og tørt. Andre bilde systemer kan brukes hvis de er kompatible med lysbildene.
- Merker oppstille flekker benytter gitter orientert basert på fiducial markører og mål flekk intensiteten idet median av pixel intensiteten minus miljøet målt i nærheten flekker. Utfør denne kvantifisering algoritmen i batch ved hjelp av den innebygde imager programvare, som utnytter den. gal filen konstruert i trinn 1.2.2 å koble spot intensitet til individuelle antigener på hver Microarray.
- I fil info panel, laste opp. gal-filen ved å velge fra sin mappe på datamaskinen, og angi mappen der analysen output filene skal lagres i analyse alternativer delen.
- Inne bildet administrere tab, åpen ettall av det ervervet profilen å bli kvantifisert og velge bilen knapp inne det øvre rett avkrok.
- I delen for matrise analyse i nedre høyre hjørne oppretter du en fiducial mal som instruert av programvaren.
- Klikk den satsvise analysen, Velg mappen som inneholder bildene som skal kvantifisert, og velg fiducial malen som ble opprettet i forrige trinn. Programvaren analyserer hvert bilde og kvantifiserer spot intensiteten.
Merk: dette trinnet vil generere en CSV-fil som inneholder spot intensitet kvantifisere antistoffer i hvert serum eksemplar som binder til hvert enkelt antigen på Microarray som senere kan manipuleres i regneark manipulasjon eller analyseprogramvare.
- Analyser rådata for å sammenligne antistoff binding på tvers av antigener og på tvers av serumprøver. For denne studien ble IgA-og IgG-antistoffer målt som 585 NM og 800 NM fluorescerende spot intensitet sammenlignet på tvers av alle antigener mellom to uavhengige kjøringer av eksperimentet ved hjelp av forskjellige lysbilder på forskjellige dager, og korrelasjons analyse ble utført for å måle analysen reproduserbarhet.
Merk: for ikke-renset proteiner trykt som uttrykk blanding, dataanalyse bør begynne med bakgrunn subtraksjon av en ingen DNA-kontroll.
- Erverve profilen av Microarray lysbilder benytter det transportabel image med bygget-inne programvare.
Representative Results
Som en demonstrasjon av protokollen, Baseline Sera var analyseres fra 16 personer i en potensiell kohortstudie av studenter fulgt for influensa infeksjon på influensa antigen Microarray. Disse prøvene ble analysert to ganger, på forskjellige lysbilder og i forskjellige dager, for å demonstrere analysen reproduserbarhet.
For denne studien, renset influensa antigener inneholder hans10 kodene ble innhentet fra kommersiell leverandør (se tabell over materialer) og samarbeidspartnere. Disse antigener inkluderer 251 total HA-antigener, med 63 globular hode domener (HA1) og 186 full-length proteiner (HA0), inkludert 96 monomere HA0 proteiner og 90 trimerized HA0 proteiner som inneholder smeltet trimerization ("foldon") domene23. En fullstendig liste over antigener og kontroller som brukes i denne studien er inkludert som en supplerende fil. For denne studien var sekundære antistoffer som brukes geit anti-humant IgG bøyd til Quantum dot emitting på 800 NM (GAH-IgG-Q800) og geit anti-menneskelige IgA bøyd til Quantum dot emitting på 585 NM (GAH-IgA-Q585) for multiplex påvisning av IgG og IgA antistoffer som vist i Figur 3. IgG og IgA antistoff binding til ulike under typer og molekylære former av influensa HA antigener ble sammenlignet for Sera innhentet fra den kliniske kohort beskrevet ovenfor.
Det resulterende varmekartet vises i Figur 4 med grafisk representasjon i figur 5. I disse tallene er bare de klinisk relevante undertypene med høy representasjon på matrisen merket for å spare plass, med "+" som betegner alle gjenværende under typer av høyere tall, og mindre eller mindre godt representert under typer inkludert som bestilt (f. eks H2 i mellom H1 og H3). En fullstendig liste over stammer og under typer på matrisen er inkludert som tilleggsfil. Disse dataene viser at antistoffer mot hode gruppen HA er under type spesifikk med forventet høy mengde antistoffer mot klinisk utbredte belastninger (H1N1, H3N2 og B) og lavt antall antistoffer mot andre stammer. Men antistoffer mot hele HA, som inkluderer stilken domenet, er mer tvers reaktive på tvers av undergrupper, og denne effekten ser ut til å være forsterket når hele HA er trimerized. Dette resultatet er ikke uventet, som hele HA inkluderer stammen regionen, som er svært bevart på tvers av under typer. Derfor vil antistoffer mot hele HA-molekyler fra ikke-kliniske under typer (f.eks. H5 og H7) sannsynligvis representere anti-Stem-antistoffer som opprinnelig elicited mot kliniske under typer (f.eks. H1 og H3) som er kryss-reaksjon med Stam regionene i de andre HA-undertypene på matrisen. Dette punktet illustrerer viktigheten av å inkludere både hode HA og hele molekylet HA på array å skille mellom antistoffer mot hodet og stammen regioner som viser ulike reaktivitet profiler.
Analysen demonstrerer god reproduserbarhet på tvers av undersøkelser. Den andre kjøringen viser noe lavere IgG-antistoffer på tvers av alle stammer, selv om mønsteret mellom stammene er konsistent. Denne over-The-Board liten reduksjon skyldes sannsynligvis batch-til-batch variasjon i sekundære antistoff, som ble endret mellom kjøringer for IgG, men ikke for IgA. Således, som nevnt i protokollen, anbefales det å bruke samme batch av hvert sekundære antistoff for eventuelle eksperimenter mellom kvantitativ sammenligning er planlagt. Hvis ulike grupper av antistoff er nødvendig på grunn av et høyt antall prøver som skal testes, anbefaler vi å inkludere delte prøver mellom eksperimentelle kjøringer med forskjellige antistoff partier for å muliggjøre kvantitativ sammenligning med korreksjon.
Figur 1: skjematisk av protein Microarray. Hvert lysbilde inneholder flere pads hver med en enkelt array, som består av hundrevis av antigener trykt på flekker arrangert i et rutenett, med hvert punkt som inneholder ett antigen adsorberes på 3-dimensjonale topografi av nitrocellulose overflaten som antistoffer fra serum er bundet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk av influensa antigen Microarray utskrift og verifiserer protokollen. Fra venstre til høyre, Microarray skrives ut med på nitrocellulose-belagte lysbilder, som brukes til å granske Sera for IgG og IgA antistoffer ved hjelp av Quantum-dot-bøyd sekundære antistoffer, med lysbilder avbildet ved hjelp av en bærbar imager, og resultater analysert for å generere et varme kart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: prosedyre for å feste undersøkelser kammer til Microarray lysbilde. Fra A til F, den undersøkelser Chamber er plassert på toppen av lysbildet i riktig retning, festet til lysbildet ved hjelp av horisontale klipp på sidene, og plassert i undersøkelser skuffen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater av influensa antigen Microarray. Heat kart representerer antigen-spesifikke antistoff responser, med hver rad som representerer et enkelt antigen arrangert av molekyl, under type og belastning, og hver kolonne representerer en undersøkelser kjøring av en enkelt prøve, arrangert av antistoff isotype og kjøre (a, hvit = 0, svart = 20000, rød = 40000 fluorescens intensitet). Antigen under typer inkludert alle hemagglutinin under typer fra 1 til 18 og alle neuraminidase under typer fra 1 til 10 er ordnet loddrett og merket til venstre. En sammenligning av fluorescens intensitet mellom to kjøringer demonstrerer god analyse reproduserbarhet ved lineær regresjon for IgA (B) og IgG (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bredde av serum antistoffer målt på influensa antigen Microarray. Serum IgA (A) og IgG (B) er gruppert etter ha og na Molecular former og under typer for å DEMONSTRERE høy spesifisitet av ha hode gruppe antistoffer for kliniske undergrupper og høy kryss-reaktivitet av hele HA og trimerized hele ha antistoffer med inkludering av stilk regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil: liste over antigener på influensa antigen Microarray. Innholdet vises for alle 324 flekker på matrisen, inkludert blanks, fiducials, kontroller (humant IgG og IgA og anti-humant IgG og IgA ved 0,1 mg/mL og 0,3 mg/mL), og antigener med informasjon om kilde, molekylær form, under type og belastning. Forkortelser er som følger: for kilde, Sino = Sino biologiske Inc., FKL = Florian Krammer Laboratory; for molekylær form, HA1 = hode HA, HA0 = hele HA, HA2 = stengel HA, NP = nucleoprotein. For antigener Hentet fra Sino biologiske Inc., vises katalognumre; for antigener Hentet fra Krammer Laboratory, er antigen IDer oppført. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Influensa antigen Microarray protokollen er beskrevet her er tilpasningsdyktig til ethvert prosjekt som krever analysere antistoff svar på mange antigener. Den Microarray plattformen kan brukes med alle ønskede sett av protein antigener uttrykt i ethvert system som kan oppnå 0,1 mg/mL eller høyere yield med eller uten rensing som tidligere beskrevet12. Hvis ikke-renset protein antigener (f. eks, uttrykt i in vitro transkripsjon og oversettelse system) er direkte brukt til å skrive ut Microarrays, komponenter av protein uttrykk system (f. eks, e. coli lysat) bør legges 1:10 til blokkering buffer som brukes for fortynning av Sera og kvalitetskontroll antistoffer for å blokkere eventuelle antistoffer rettet mot disse komponentene. Lysbilde konfigurasjoner er tilgjengelige med et lavere antall større pads på hvert lysbilde for å imøtekomme et høyere antall antigener per array. For denne studien, brukte vi en GeneMachines OmniGrid 100 Microarray skriver som benytter pinner som direkte kontakt nitrocellulose overflaten til innskudd flekker på array. Selv om denne Microarray skriveren ikke lenger er kommersielt tilgjengelig, kan andre kommersielt tilgjengelige Microarray skrivere brukes i denne protokollen, men kan kreve tilpassede pins (enten kontakt eller ikke-kontakt) og programvare og bør ha tilstrekkelig spot oppløsning og kompatibilitet med lysbilder og Imager. Avhengig av reaktivitet av Sera, kan fortynninger fra 1:50 til 1:400 brukes. Serum fri buffer kan brukes som en negativ kontroll, mens monoklonale antistoffer kjent for å binde til antigen kan brukes som en positiv kontroll.
Brukere bør være klar over noen feilsøkingsproblemer. Formålet med kvalitetskontroll kontrollen med antistoffer mot hans tag er å se etter eventuelle antigener som utskriften ikke var vellykket. Eventuelle flekker som konsekvent gir lavt signal i kvalitetskontroll kontroll av flere matriser sannsynligvis representerer utilstrekkelig antigen skrives ut. Mulige årsaker inkluderer aggregering eller nedbør eller antigen i kilde plate eller dårlig kontakt mellom utskrift PIN og Microarray lysbilde på grunn av variabel tykkelse av nitrocellulose pad. På dette punktet, gjør vi ikke utføre analysen normalisering basert på kvantitative resultater av kvalitetskontroll sjekk, gitt at den oppdagede bindingen av anti-hans antistoffer kan bli påvirket av tilgjengeligheten av denne koden, som avhenger av 3-dimensjonale konformasjon spesifikke for hvert antigen.
Influensa antigen Microarray gir flere fordeler fremfor tradisjonelle metoder som ELISA og er komplementære til funksjonelle analyser som HAI og MN. Den 16-pad protein Microarray er en prøve-sparing teknologi med kapasitet til å måle antistoffer av flere isotypes samtidig mot ca 300 antigener fra 1 μL av serum. Antall antigener kan økes til tusener ved å redusere antall pads per slides. Den multiplekset analysen sparer også personell tid og forbruksressurser, gitt at hundrevis av Sera kan analysert for antistoffer i 2 dager, og alle materialer enn lysbilder og reagenser er gjenbrukbare så ikke generere store mengder plastavfall.
Selv om Microarray skrivere ikke kan distribueres bredt, kan Microarray lysbilder skrives ut på et sentralt sted og deretter transporteres til sluttbrukeren for undersøkelser. Det eneste utstyret som kreves for undersøkelser er den lave kostnader og bærbare Imager. Målet med å spre denne protokollen er å gjøre utnyttelse av denne teknikken mer utbredt.
De viktigste begrensningene av influensa antigen Microarray er manglende evne til å karakterisere funksjonen og Kinetics av oppdagede antistoffer. Microarray registrerer et polyklonale sett med bindings antistoffer for hvert antigen. Disse antistoffene kanskje eller kanskje ikke være funksjonell inne nøytralisere virus inne HAI og MN analyser. Imidlertid, HAI og MN analyser forlange bo virus kulturen med forbundet nød for spesialisert fasiliteter med høy-plan flate biosafety skap å test for Antistoffene imot avian undergrupper av influensa, mens derimot proteinet Microarray er ikke innvolvere bo virus komponentene slik at de kan brukes i et hvilket som helst grunnleggende laboratorium. Med hensyn til bindende Kinetics, en enkelt fortynning av serum analysert med en matrise som inneholder en enkelt konsentrasjon av hvert antigen gir et enkelt datapunkt, som representerer en sammensatt av kvantitet og affinitet summert over alle antistoffer som binder seg til antigen . For å fullt ut løse antigen-antistoff bindende Kinetics, flere antigen konsentrasjoner og/eller seriell fortynninger av Sera er nødvendig.
Til tross for disse begrensningene er influensa antigen Microarray et nyttig verktøy for å karakterisere bredden av influensa antistoffer over antigen landskapet som kan utfylle funksjonelle analyser som er mer begrenset i gjennomstrømning og tilgjengelighet.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) for å samle den menneskelige Sera under University of Maryland IRB protokollen #313842 finansiert av DARPA N66001-2-4015 P00001. Forfatterne vil også erkjenne Prof. Florian Krammer (Icahn School of Medicine, Mt. Sinai, NY, USA) for å gi trimerized HA og NA antigener finansiert av ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan er delvis støttet av National Center for Research Resources og National Center for fremmarsj translational Sciences, National Institutes of Health, gjennom stipend KL2 TR001416. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle utsikten over NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
