Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza cada vez más como un sistema modelo para descubrir los procesos biológicos y moleculares involucrados en las enfermedades humanas. Un nematodo adulto tiene una longitud corporal de poco más de 1 mm, y puede producir una gran cría de hasta 300 huevos¹. Después de la eclosión, C. elegans sólo requieren 3-4 días para llegar a la edad adulta, y vivir alrededor de 2 a 3 semanas². Debido a su facilidad de cultivo, C. elegans es actualmente uno de los modelos animales in vivo más buscados para llevar a cabo pruebas de detección rápidas y rentables de medicamentos para identificar terapias para enfermedades humanas. Además, su conservación genética, paradigmas conductuales bien definidos, cuerpo transparente para fluorescencia o microscopía ligera, y facilidad de manipulación genética hacen que el estudio de las consecuencias celulares y moleculares de las mutaciones genéticas sea fácilmente alcanzable ³. El genoma de C. elegans comparte aproximadamente 60-80% de la ortología con genes humanos, y alrededor del 40% de esos genes se sabe que están relacionados con la enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas que han sido modeladas y estudiadas en C. elegans incluyen trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth), enfermedades asociadas al músculo ( Distrofia muscular de Duchenne), y enfermedades metabólicas (hiperglucemia)^2,4. En la mayoría de los trastornos humanos, se producen la localización celular y de los orgánulos inducida por la enfermedad y los cambios morfológicos, que pueden evaluarse fácilmente en el modelo de nematodos.

Los marcadores fluorescentes se han utilizado ampliamente para etiquetar tejidos y orgánulos para la visualización dinámica bajo el microscopio. Sin embargo, en C. elegans,los métodos convencionales que evalúan las irregularidades morfológicas debidas a mutaciones genéticas se han basado en gran medida en descripciones visuales. Si bien las evaluaciones cualitativas pueden abarcar rangos más amplios de descripciones fenotípicas (morfología sináptica, aglomeración gFP, forma axonal específica, grosor de la fibra muscular, etc.) y proporcionar una visión de pájaro de los cambios morfológicos, son menos adecuadas para comparando pequeñas variaciones entre diferentes grupos. Además, las evaluaciones cualitativas se basan en evaluaciones visuales y subjetivas, lo que puede dar lugar a sobreestimaciones o subestimaciones de anomalías morfológicas. Por último, las observaciones cualitativas también pueden variar mucho entre individuos, creando dificultades con la replicación de datos.

En los últimos años, se han desarrollado una serie de algoritmos computacionales fáciles de usar y fácilmente disponibles que pueden analizar cuantitativamente imágenes. Sin embargo, la utilización de este tipo de software de análisis de imágenes para algunos estudios morfológicos, especialmente en relación con los músculos de la pared del cuerpo y las mitocondrias, en C. elegans investigación se ha quedado atrás. Para mejorar el análisis estructural subyacente en C. elegans, se probaron algunos de los softwares de análisis de imágenes de código abierto fácilmente disponibles para comparar cuantitativamente los efectos de las mutaciones genéticas en las mitocondrias musculares, el músculo de la pared corporal y el sináptico Morfología. Estos procedimientos experimentales describen en detalle cómo estos programas (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) se pueden utilizar para evaluar los cambios en el tamaño sináptico y la localización de proteínas sinápticas, el área del músculo de la pared del cuerpo y la longitud de la fibra, y el tamaño mitocondrial y la circularidad como resultado de mutaciones genéticas en el nematodo.

1. Crecimiento y mantenimiento de las cepas de C. elegans

1. Medio de crecimiento de nematodos de semillas (NGM, ver Tabla de materiales) placas de agar con 300 l de la cepa de E. coli de crecimiento lento OP50 en un armario de flujo laminar.
2. Deje las placas de agar NGM en el armario de flujo laminar para secar.
   NOTA: En ausencia de gabinete de flujo laminar, las placas se pueden dejar secar en el banco, pero son más propensas a la contaminación.
3. Transfiera al menos 20 animales a cada una de las dos placas de agar NGM con sembrados OP50 para tener existencias de trabajo. Hay dos formas principales de transferir animales.
   1. Selección: Levante suavemente los animales con un pico esterilizado por calor. Este método es eficaz para seleccionar animales individuales o múltiples de una placa de agar. Tener un pequeño rasguño de bacterias en la punta al recoger ayuda a la transferencia.
      NOTA: Un pico está hecho de un pequeño trozo de alambre de platino de unos 4 cm de largo que está incrustado en una pipeta de vidrio, con la punta de alambre aplanada para ser 'como lanza'. Esterilizar térmicamente el pico entre la recolección para evitar la contaminación cruzada.
   2. Chunking: Usando una espátula esterilizada, corte un pequeño cuadrado de agar que contenga a los animales de un plato y transferido boca abajo a un plato nuevo.
      NOTA: Este método es generalmente útil para transferir un gran número de gusanos, y para eliminar la contaminación de las placas a través de múltiples rondas de agar no contaminado de fragmentación. Evite la contaminación cruzada en flamando la espátula durante unos segundos y sumergiendo la espátula en etanol 100% entre transferencias. La transferencia de placas hambrientas no se recomienda ya que el hambre y el hacinamiento pueden afectar la salud y la morfología de las estructuras celulares y subcelulares.
4. Mantener los gusanos a temperatura de crecimiento estándar (20 oC). Para garantizar el suministro continuo de gusanos bien alimentados, transfiera los gusanos a nuevas placas de véanse OP50 cada 2 a 3 días.

2. C. elegans sincronizando la edad

1. Mantener los gusanos en 3-4 placas NGM hasta que la población esté llena pero no hambrienta.
2. Lave suavemente los gusanos de la placa NGM con la solución M9. Los huevos permanecerán en el plato ya que se adhieren a la E. coli OP50. Repita con cuatro pasos de lavado adicionales para eliminar todos los animales eclosionados.
3. Deje que los gusanos eclosionen durante 40 minutos.
4. Agregue 1-2 ml de solución M9 a la placa y gire suavemente para aflojar los gusanos recién eclosionados.
5. Recoja la solución M9 con gusanos recién nacidos y transfiera la solución con gusanos a una placa NGM fresca.
6. Permita que la solución M9 se evapore exponiendo la placa NGM al aire. Haga esto adyacente a una llama abierta para evitar la contaminación de la placa NGM.
7. Cultivar los gusanos durante 27 h a 20oC para permitir el desarrollo en la tercera etapa larval (L3). Para los animales adultos sincronizados de 3 días de edad, los gusanos se recogen en la etapa larval 4, y crecen durante 3 días más para llegar a la etapa adulta de 3 días de edad.

3. Preparación de diapositivas para imágenes

1. Preparar 3-4% p/v de caldo de agarosa en una botella a prueba de microondas (3-4 g en 100 ml de agua ultrapura).
   NOTA: El agar se puede utilizar en lugar de agarosa en la misma concentración.
2. Derretir la agarosa cuidadosamente en un horno microondas, teniendo cuidado de no hervir en exceso, hasta que toda la agarosa se disuelva (solución transparente). Mantener la solución a 70 oC para evitar la solidificación.
   NOTA: El stock de agarosa se puede utilizar varias veces. Recalentar antes de su uso si la agarosa se ha solidificado.
3. Con una pipeta Pasteur, coloque una gota de agarosa derretida en una diapositiva del microscopio.
   NOTA: Evite tener burbujas de aire en la gota de agar, ya que estas interrumpen la integridad de la almohadilla.
4. Presione inmediatamente la gota de agarosa con otra diapositiva del microscopio, aplanando suavemente la agarosa en una almohadilla entre las dos diapositivas.
   NOTA: Las burbujas sobrantes deben eliminarse en esta etapa. Si no, se deben hacer nuevos toboganes, ya que los animales pueden quedar atrapados fácilmente en las burbujas. Evite el desbordamiento del agar hacia un lado al presionar sobre la diapositiva.
5. Deje secar la agarosa durante 1 min.
6. Separe cuidadosamente las dos diapositivas para evitar daños en la agarosa, dejando la almohadilla solidificada en una de las diapositivas.
   NOTA: Las diapositivas con almohadillas de agarosa siempre deben prepararse frescas justo antes del experimento, ya que pueden secarse. Asegúrese de que la almohadilla de agarosa tenga un grosor constante. No debe haber burbujas de aire o grietas en la almohadilla, ya que esto puede interferir con las imágenes.
7. Añadir una pequeña gota (5-10 l) de 0.05% de hidrocloruro de tetramisole (anestésico) al centro de la almohadilla de agarosa.
8. Usando un pico esterilizado térmicamente, transfiera rápidamente entre 10 y 15 animales de la placa de almacenamiento a la gota anestésica antes de que la solución se seque. Evite transferir demasiadas bacterias OP50, ya que esto hace que la solución se nuble, lo que puede interferir con las imágenes.
   NOTA: Si la solución anestésica se seca al recoger, simplemente pipetee una segunda gota de hidrocloruro de tetramisole al 0,05% sobre los animales. Los animales tienden a acostarse en su lado lateral en la solución anestésica.
9. Aplique un cubreobjetos colocándolo justo encima de la almohadilla de agarosa y soltándolo suavemente. Esto evitará la formación de burbujas. No aplique presión sobre el cubreobjetos, ya que esto puede aplastar a los animales.
10. Etiquete las diapositivas con el nombre de la cepa.

4. Evaluación de la morfología sináptica

NOTA: Los efectos de la sobreexpresión de MEC-17 en la integridad de la sinapsis en las neuronas receptoras táctiles del microtúbulo lateral posterior (PLM) se estudiaron cuantificando el tamaño sináptico y la localización mediante microscopía confocal de escaneo de línea. Las neuronas PLM (incluidas las regiones sinápticas) se visualizaron utilizando el transgén uIs115(Pmec-17::tagRFP) (strain: TU4065⁵) y la región sináptica fue etiquetada específicamente con jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) (strain: NM664 ⁶) . Este estudio se realizó en animales sincronizados L3 no transgénicos y transgénicos de la cepa extracromosómica MEC-17 de sobreexpresión BXN507 [cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]⁷. En la Tabla 1se incluye una lista completa de las cepas utilizadas en este estudio.

1. Imagen confocal de las sinapsis de neuronas receptoras táctiles
   1. Para tomar imágenes de las regiones sinápticas, utilice un microscopio confocal de escaneo de línea acoplado a un láser de diodo semiconductor bombeado ópticamente de 488 nm y 552 nm y equipado con software de captura de imágenes.
   2. Localice los gusanos utilizando el aumento más bajo.
   3. Cuando los animales estén bien situados, cambie a un aumento 40X y aplique un medio de inmersión (en este estudio: se utilizó un objetivo multi-inmersivo 40X/1.10 HC PL Pl APO CS2 con inmersión en agua).
   4. Visualice la región sináptica excitando a los fluoróforos con un láser de 488 nm (2% de potencia) para el fluoróforo GFP y 552 nm (1% de potencia) para el fluoróforo tagRFP.
   5. Determine el marco x e y óptimo para capturar toda la región sináptica. Asegúrese de tener en cuenta el tamaño de píxel óptimo al seleccionar el marco. En este estudio, se obtuvo un tamaño de píxel consistente de 56 nm.
   6. Capturar imágenes utilizando un fotodetector híbrido y establecer las ganancias para evitar la sobreexposición de los fluoróforos (100% para excitación de 488 nm y 15% para la excitación de 552 nm).
   7. Recopile imágenes de pila z para cubrir toda la sinapsis, utilizando el tamaño óptimo del paso z dependiendo del objetivo específico utilizado. En este estudio, se utilizó un tamaño óptimo del paso z de 0,211 nm.
      NOTA: Asegúrese de que todas las imágenes se toman bajo condiciones estrictas para permitir la cuantificación y comparación de fluorescencia integrada. Esto se puede hacer manteniendo los parámetros de microscopía idénticos en todas las imágenes capturadas (es decir, la configuración del láser y del detector, el tamaño del píxel, la velocidad de escaneo y el tamaño óptimo del paso z). Los ajustes óptimos dependen del objetivo y se pueden calcular utilizando programas bioinformáticos accesibles, como la calculadora Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Etiquetar imágenes sistemáticamente, esto será útil cuando se utiliza software bioinformático que organizará y procesará archivos basados en el nombre de archivo.
2. Cuantificación de la región sináptica
   1. Para analizar la región sináptica, exporte imágenes como archivos TIFF. Se puede utilizar un software de procesamiento de imágenes basado en Java, como ImageJ (en este estudio, se utilizó la macro de conversión de imágenes MRI en ImageJ).
   2. El tamaño y los niveles de intensidad de fluorescencia integrados de las sinapsis se midieron a partir de la intensidad de suma de las pilas z obtenidas con CellProfiler-3.1.5. Cargue las imágenes en el software CellProfiler3.1.5. Si es necesario, las imágenes se pueden filtrar en función de los nombres de archivo de imagen.
   3. Configure el módulo Nombre y tipo. Opcionalmente, extraiga los metadatos de la etiqueta de imagen para organizar los datos calculados en consecuencia.
   4. Determine la región sináptica mediante la definición manual de esta región mediante el tagRFP difuso expresado desde el transgén uIs115(Pmec-17::tagRFP). Esto se puede hacer agregando el módulo regarding a la canalización CellProfiler-3.1.5.
   5. Para medir el tamaño y la fluorescencia de la sinapsis definida a mano, agregue el tamaño y la forma del objeto Medir y el módulo de intensidad del objeto Medir a la tubería.
   6. Calcule la intensidad de fluorescencia integrada relativa añadiendo el módulo Calcular matemáticas. Divida las unidades de intensidad integradas obtenidas de jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) por las unidades integradas obtenidas para uIs115(Pmec-17::tagRFP).
   7. Exportar mediciones y cálculos.

5. Cuantificación de la estructura muscular de la pared corporal

1. Imágenes por fluorescencia de la estructura muscular de la pared corporal
   1. Obtener una cepa (por ejemplo, RW1596) que lleva el transgén stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))⁸, que etiqueta las fibras de miosina con GFP.
      NOTA: La introducción del transgén en animales se puede lograr cruzando una cepa de interés con animales que ya expresan el transgén, o microinyectar ADN en el brazo distal de la gónada. El fenotipo 'rolling' inducido por la mutación rol-6 en este transgén facilita la visualización de los músculos. Los músculos de la pared del cuerpo corren a lo largo de los lados dorsal y ventral que normalmente están impedidos de la vista en animales de tipo salvaje porque normalmente se encuentran en uno de sus lados laterales. El alelo rol-6(su1006) induce la torsión de los animales, exponiendo así algunas células musculares para la toma de imágenes.
   2. Imagen de los animales utilizando un microscopio de fluorescencia junto con una cámara de dispositivo acoplado (CCD) cargada de alta resolución, objetivo 40X o superior, filtro GFP y software de adquisición.
   3. Ajuste el tiempo de exposición y la intensidad de la iluminación para evitar imágenes sobresaturadas.
   4. Capturar y guardar imágenes de los músculos (aumento 400X) de una sección del animal que contiene al menos una célula muscular oblicua visible completa. Evite las regiones con una sola célula muscular que esté incompleta o secciones que estén desenfocadas. También excluye imágenes de regiones anteriores y posteriores extremas, y regiones adyacentes a la vulva.
      NOTA: Si el animal no tiene una sola célula muscular completa visible, deslice suavemente la cubierta para girar al animal con el fin de exponer una célula completa.
2. Medición del área de la célula muscular
   1. Abra la imagen en el software de Fiji⁹ (se utilizó la versión 2.0.0 en este estudio).
   2. Utilice la selección de polígonos para trazar cuidadosamente alrededor de una sola célula muscular oblicua. Ajuste la línea del polígono al final arrastrando el punto de anclaje para mejorar el trazado.
   3. Vaya a la pestaña Analizar en la parte superior del software y haga clic en Medir para calcular el área de la selección. Se mostrará una tabla de resultados separada que contiene el área y otras mediciones. Si falta la medición de área en la tabla de resultados, vaya a Establecer medidas en la pestaña Analizar y compruebe que la casilla de área está marcada. Del mismo modo, desmarque otras mediciones que no sean necesarias.
   4. Para las celdas musculares con una región degenerada/faltante, trace la región que falta con la herramienta de selección de polígonos y haga clic en Medir de nuevo. Si hay varios huecos dentro de la celda, trace cada brecha por separado.
   5. Calcule la relación entre el área de separación y toda la célula muscular única. Una relación alta indica una mayor extensión de la degeneración muscular debido a grandes brechas dentro de la célula. Si no faltan regiones, como se ve comúnmente en animales de tipo salvaje, la proporción se calcularía como cero.
      NOTA: Como control, puntuación también para defectos de la estructura muscular visualmente y comparar los resultados con la medición cuantitativa. Esto es especialmente útil si la cepa se está estudiando por primera vez en el laboratorio. Para la puntuación fenotípica, evalúe a los animales como defectuosos o no defectuosos en función de la integridad de los filamentos. Por ejemplo, los animales con pérdida de estriaciones de filamentos distintos, aglomeración de GFP o huecos dentro de las células musculares debido a la avería estructural, serían punzonados como defectuosos.
3. Segmentación y cuantificación de la longitud de la fibra de miosina
   1. Si es necesario, primero convierta los archivos a . uso de Fiji u otro paquete de software. Guarde los archivos TIFF en la ubicación deseada.
   2. Open ilastik¹⁰ (software gratuito, versión 1.3.2 puede descargarse desde https://www.ilastik.org/).
   3. Una vez en ilastik, elija Clasificación de píxeles en Crear nuevo proyecto. El software le pedirá que se guarde el proyecto. Cambie el nombre del proyecto y guárdelo en la ubicación deseada.
      NOTA: Un nuevo proyecto solo necesita ser creado una vez. La segmentación posterior se puede realizar utilizando el mismo proyecto. Para usar la misma configuración del proyecto, vaya a la pestaña Proyecto en la parte superior y haga clic en Abrir proyecto para acceder al archivo de proyecto.
   4. Debe haber 5 pestañas en el panel izquierdo (Datos de entrada, Selección de características, Entrenamiento, Exportación de predicción y Procesamiento por lotes). En la pestaña Datos de entrada, haga clic en Agregar nuevo y, a continuación, agregar imágenes independientes. Dirija la ventana emergente a la carpeta que contiene los archivos TIFF y seleccione la imagen que desea abrir.
   5. En la siguiente pestaña a continuación (Selección de características), haga clic en Seleccionar entidades para seleccionar todas las entidades de píxeles, indicadas por casillas verdes. La selección de píxeles en este paso se utiliza para distinguir las diferentes clases de píxeles en el paso siguiente.
      NOTA: La selección de la función de píxeles depende de la resolución de la imagen. Por lo tanto, los desarrolladores sugieren seleccionar todas o tantas características como sea posible, si la potencia de procesamiento y el tiempo lo permiten.
   6. El siguiente panel Entrenamiento permite la clasificación de diferentes clases de objetos en función de los píxeles. En este caso, las dos clases son los filamentos de miosina que expresan la GFP individuales y el fondo no deseado o bordes borrosos. Haga clic en Añadir etiqueta para tener la primera etiqueta. Atravesa una serie de filamentos para comenzar el entrenamiento clasificador.
      NOTA: Hacer doble clic en la etiqueta permite cambiar el nombre (por ejemplo, cambiar el nombre de 'etiqueta 1' a 'filamento'). Al hacer doble clic en el cuadro de color, los colores de las pantallas de dibujo y probabilidad se modifican. El tamaño predeterminado del pincel es 1, aunque el tamaño se puede aumentar a 61. Si se ha dibujado el píxel incorrecto, simplemente utilice la herramienta de borrador para eliminar el dibujo. Los controles de teclado (-) y (Shift +) se pueden utilizar para acercar y alejar la imagen, respectivamente. Las teclas de flecha se utilizan para navegar por la imagen.
   7. Agregue una segunda etiqueta y cámbiele el nombre a Fondo. Atravesa sobre fondos y espacios no deseados entre los filamentos.
   8. Haga clic en Live Update y asegúrese de que la clasificación ha sido realizada por el software correctamente. Añadir más garabatos y afinar el entrenamiento si es necesario.
      NOTA: Es importante mantener un ojo hacia fuera para las fibras combinadas y bordes borrosos (como la línea del cuerpo) en este paso. Mejore la predicción aquí tanto como sea posible para aumentar la precisión de las mediciones. La precisión de la predicción también depende de la resolución de la imagen, ya que los píxeles de las imágenes de baja calidad son más difíciles de separar. También es opcional, pero se recomienda ejecutar el método de filtro en la función Sugerir características junto al control Live Update.
   9. Una vez que el clasificador de entrenamiento se haya realizado adecuadamente, vaya al panel Exportación de predicción. Haga clic en Elegir exportar configuración de imagen con probabilidades como origen.
   10. Utilice la siguiente configuración. Subregión de corte x e y marcó, y c unticked. Los valores start y stop para c deben ser 0 y 1, respectivamente. Marque y convierta el tipo de datos en Transformaciones en 8 bits sin signo, marque renormalizar [min, max] y utilice los valores predeterminados. Cambie el formato del vídeo del archivo de salida a PNG y cambie el nombre del archivo y el directorio como desee.
   11. Cierre la ventana de configuración de exportación y exporte la imagen específica que acaba de segmentar.
   12. Abra la imagen PNG guardada en el software Fiji. La imagen debe aparecer en blanco y negro.
   13. Ajuste el umbral de la imagen utilizando la configuración predeterminada.
   14. Aplique el plugin de esqueletización (Skeletonize 2D/3D y, a continuación, Analice Skeleton). Se mostrará una tabla independiente de resultados, que incluye la longitud de la rama. La longitud de la rama representa la longitud de la fibra. Otros datos en los resultados también podrían ser útiles, como la distancia euclidiana.
       NOTA: Omita las fibras con longitudes de 0 m o más de 250 m, ya que estos tamaños no son fisiológicamente posibles.

6. Cuantificación de la morfología mitocondrial

NOTA: Para la cuantificación de la morfología mitocondrial, este estudio utilizó la cepa BXN038⁷ que contiene el transgén uIs115(Pmec-17::tagRFP)⁵ para visualizar las neuronas PLM y jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP)¹¹ para visualizar las mitocondrias específicamente dentro de las neuronas PLM. Este estudio se realizó en gusanos adultos sincronizados de 3 días de edad, pero se ha realizado con éxito a otras edades, así como en otros tejidos^7.

1. Imágenes por fluorescencia de las mitocondrias dentro de las neuronas PLM
   1. Para medir los cambios de tamaño y forma de las mitocondrias dentro de las neuronas PLM, visualice tanto la neurona de fondo como las mitocondrias utilizando transgenes fluorescentes.
   2. Para tomar imágenes de la neurona PLM, utilice un microscopio confocal acoplado a un láser de diodo semiconductor bombeado ópticamente de 488 nm y 552 nm y equipado con software de captura de imágenes.
   3. Imagen del gusano según los pasos 4.1.1-4.1.4 anteriores, asegurando condiciones de exposición no saturadas.
   4. Con el fin de visualizar toda la neurona, una imagen en mosaico puede ser necesaria. Para lograr esto, utilice software con una opción de escaneo de teselas para localizar y soltar un marcador en una esquina de la neurona y luego localice el extremo opuesto y suelte el otro marcador. El software calculará el número óptimo de teselas necesarias para capturar el área requerida.
      NOTA: Para reducir el tiempo de escaneo, a menudo es más fácil localizar las neuronas que siguen un solo plano, lo que resulta en menos teselas.
   5. Para acoplar el escaneo de teselas con una pila Z, establezca los límites inferior y superior antes de iniciar el análisis de teselas y asegúrese de que se establece el tamaño óptimo del sector.
   6. Asegúrese de que la resolución está optimizada, ya que la segmentación será más refinada con resoluciones más altas (aquí, se utilizó una resolución de 3224 x 3224 píxeles).
      NOTA: Mientras que el transgén uIs115(Pmec-17::tagRFP) se utiliza para marcar el PLM y posicionar con éxito la cámara, no necesariamente necesita ser imagen dacuenta debido a la ligera fluorescencia de fondo observada desde el jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) transgén dentro del propio plM axon. Por lo tanto, el tiempo de escaneo e imágenes se puede reducir eliminando el filtro de 552 nm del experimento.
2. Segmentación de objetos mediante SQUASSH
   1. Convierta archivos de imagen en imágenes .tiff y genere proyecciones de máxima intensidad de pilas Z utilizando el software de imágenes Fiji. Recorte las imágenes al tamaño mínimo mientras todavía contiene la neurona completa para reducir la carga computacional y reducir el ruido de fondo.
      NOTA: Para los resultados representativos, sólo se consideraron las mitocondrias dentro de los largos procesos axonales, por lo que el cuerpo celular y cualquier mitocondria dentro fueron excluidos de cada imagen.
   2. Con la macro de Mosaic Suite SQUASSH para ImageJ, realice la segmentación¹² de Split Bregman en las proyecciones máximas. Una guía detallada para la instalación y aplicación de esta macro está disponible en el sitio web de Mosaico (http://mosaic.mpi-cbg.de/) y descrito por Rizk et al. 2014¹³. El proceso de segmentación de la imagen se describe en breve a continuación.
      NOTA: Esta segmentación identifica los objetos (en este caso el mitocondría individual) sobre un umbral de intensidad de fluorescencia, lo que permite una medición precisa del tamaño y la forma de cada objeto individual.
   3. Elimine el ruido de fondo de una imagen utilizando el método de bola rodante, en el que una ventana definida por el usuario se mueve a través de la imagen, imputando la estimación de intensidad de fondo local de la intensidad que se produce con mayor frecuencia en cada ventana. Esto corrige intensidades de fondo desiguales.
   4. Utilice la detección de objetos para encontrar aproximadamente regiones de la imagen que contienen objetos (mitocondrias) de interés, en función de la intensidad de la fluorescencia y el número de píxeles. Los parámetros que rigen este paso son la regularización y la intensidad mínima del objeto.
      NOTA: La regularización se utiliza para evitar la segmentación de pequeñaintensidad, picos inducidos por ruido, y el umbral mínimo de intensidad del objeto ayuda a definir los orgánulos subcelulares a partir de la fluorescencia del tejido de fondo. Estos son los dos parámetros principales que se manipulan para encontrar una segmentación óptima de las mitocondrias, y el proceso de optimización tiende a ser ensayo y error de diferentes parámetros para una imagen de prueba, seguido de inspección manual.
   5. Utilice el software para estimar las intensidades de fondo locales alrededor de cada objeto para ayudar al cálculo de la segmentación óptima.
   6. Mida los objetos individuales para el tamaño, el perímetro, la longitud a través del número de píxel, así como la intensidad de la señal y la ubicación x/y en la imagen. Para calcular las medidas en tamaño (nm), tenga en cuenta el tamaño de píxel de la imagen original.
      NOTA: Para cada experimento, primero se deben calcular los parámetros óptimos. Para garantizar la precisión de la segmentación, es aconsejable realizar un análisis SQUASSH en una imagen de prueba e inspeccionar manualmente la precisión de la segmentación. La macro proporciona archivos de salida que muestran los objetos individuales que se identificaron en la imagen original, e inspeccionarlos de cerca y ajustar los parámetros que se adapten garantizará una segmentación precisa. A continuación, se deben utilizar los parámetros definidos para todo el experimento para la comparabilidad. Los parámetros utilizados para los resultados representativos se incluyen en el Cuadro2.
   7. Abra el software de análisis Fiji o ImageJ, vaya al contenedor de macros de mosaico y abra el menú SQUASSH.
      1. Abra el submenú Subsusta de fondo y asegúrese de que La opción Quitar fondo? El valor predeterminado para el tamaño de la ventana es 10.
      2. Establezca los valores de Regularización y Intensidad mínima de objetos deseados, los valores de canal 1 para identificar y segmentar mejor los objetos (consulte el paso 6.2.4). Los valores del canal 2 no son necesarios para los objetos marcados con un solo transgén.
      3. Haga clic en estimar PSF de las propiedades objetivas para estimar la función de dispersión de puntos en función de las características del microscopio. Esto ayuda a la segmentación de objetos estrechamente ubicados al tener en cuenta la influencia de cada píxel en su píxel vecino.
         NOTA: La segmentación de subpíxeles no se utilizó en este experimento debido a su mayor carga en la potencia de procesamiento de computadoras. Las máscaras celulares tampoco se utilizaron, ya que el axón se define fácilmente. Estos ajustes son útiles para tejidos más complejos y para definir objetos en una celda por célula.
      4. Para las opciones de visualización, asegúrese de que están activadas las características de objeto y imagen de objeto y Guardar. Para su uso posterior en gráficos y software estadístico, asegúrese de que se introduce el número correcto de condiciones.
   8. Busque la carpeta con imágenes .tiff y ejecute la macro. Este proceso se puede realizar en una imagen individual o en un lote de imágenes por genotipo ubicado dentro de una carpeta. Los archivos de salida se ubicarán en la carpeta junto con las imágenes originales.
3. Análisis y mediciones de la forma
   1. Utilice la salida de SQUASSH para proporcionar un archivo .csv de datos de objeto detallado, que proporciona cada objeto individual por fila, incluidas sus mediciones como se ha descrito anteriormente.
      NOTA: Si bien este proceso de macro automatiza las mediciones de objetos, siempre es importante comprobar manualmente las imágenes de salida después de la segmentación de SQUASSH para asegurarse de que la macro ha identificado correctamente las mitocondrias.
   2. Para analizar la forma de cada mitocondria, utilice una medida bidimensional para la esfheriidad, Circularidad,para estimar la desviación del objeto de un círculo perfecto.
      NOTA: La circularidad es una función de área y perímetro (Circularidad á (4 x) x (área/perímetro²) donde 1 es un círculo perfecto y 0 o una línea recta. Esto se puede lograr utilizando una fórmula en gráficos y software estadístico.
   3. Para determinar la varianza en tamaño y forma a través de la piscina de mitocondrias, calcule histogramas y una distribución gaussiana ajustada utilizando gráficos y software estadístico, con cubos de 0,2 m para el tamaño mitocondrial y 0,05 para la circularidad mitocondrial.

C. elegans es un organismo modelo ideal para estudiar la morfología de diferentes tejidos y orgánulos debido a su simplicidad, linaje celular conocido, transparencia y herramientas disponibles. Aquí, proporcionamos enfoques cuantitativos para el estudio de los orgánulos (por ejemplo, mitocondrias) y tejidos, incluyendo sinapsis y músculos utilizando imágenes de fluorescencia en vivo y software gratuito de procesamiento de bioimagen.

Se requiere una regulación estricta de la expresión MEC-17 para el desarrollo normal de la sinapsis

Para entender mejor la función de la alfa-tubulina acetil-transferasa MEC-1714,15,16 en el sistema nervioso, estudiamos morfología sináptica en las neuronas receptoras táctiles en C. elegans sobreexpresando la proteína17. Estas estructuras celulares son esenciales para la función de las neuronas, ya que permiten que las señales se transmitan a las neuronas vecinas. Las imágenes de la sinapsis PLM se recopilaron utilizando un microscopio confocal de escaneo láser y el análisis cuantitativo de morfología se realizó utilizando un software de procesamiento de bioimagen accesible (Figura1A,B). La sobreexpresión de MEC-17 da lugar a reducciones significativas en el área de acumulaciones presinápticas en PLM y a una reducción de las intensidades de fluorescencia integrada relativas del marcador SNB-1::GFP (Figura1C,D). Juntos, estos resultados sugieren que la sobreexpresión de MEC-17 interrumpe el desarrollo normal de la sinapsis en las neuronas receptoras táctiles PLM.

El tamaño del sitio presináptico y la fluorescencia relativamente integrada se estudiaron utilizando el software gratuito de procesamiento de bioimágenes CellProfiler3.1.5. Debido a su estructura compleja, las sinapsis se definieron a mano utilizando la proteína tagRFP difusa expresada a partir del transgén uIs115(Pmec-17::tagRFP). El área de la sinapsis definida se calculó por el número de píxeles dentro de la región definida. En comparación con el control de tipo salvaje, los animales que sobreexpresan MEC-17 han reducido significativamente las regiones presinápticas (P a 0,0025; n a 10) (Figura 1C). Además, para estudiar la integridad sináptica, se compararon los niveles de intensidad de fluorescencia integrada relativa. Esto se calculó midiendo los niveles de intensidad de fluorescencia integrados dentro de la sinapsis definida tanto para SNB-1::GFP como para el tagRFP difusible. Posteriormente, se compararon los valores de fluorescencia SNB-1::GFP en relación con los valores de tagRFP para los que se observó una disminución significativa (P - 0,0479; n a 10) con la sobreexpresión de MEC-17 (Figura1D). Juntos, estos resultados sugieren que la correcta regulación del MEC-17 es importante para el desarrollo de la sinapsis.

La medición cuantitativa del área de la célula muscular de la pared corporal y la longitud de la fibra revela defectos significativos como resultado de mutaciones en genes relacionados con CMT2

Se ha demostrado que la mutación en los genes MFN2, DNM2 y KIF5A causa Charcot-Marie-Tooth tipo 2 (CMT2), una forma axonal de la neuropatía periférica hereditaria más común18,19. CMT2 se asocia comúnmente con debilidad muscular distal lentamente progresiva y atrofia, deterioro sensorial distal, deformidades del pie y marcha por paso secundaria. Como resultado, los pacientes a menudo sufren deficiencias debilitantes de movilidad de por vida. Actualmente no existe una cura para la enfermedad, en parte debido a la heterogeneidad genética y clínica asociada con CMT219,así como la falta de modelos animales para estudiar la fisiopatología de la enfermedad. Por lo tanto, el uso de modelos animales para entender los defectos celulares subyacentes puede proporcionar respuestas a los mecanismos desconocidos de la enfermedad CMT2.

Hasta ahora, estudios publicados que evalúan defectos musculares de la pared corporal en C. elegans han confiado en la puntuación visual en lugar de las mediciones cuantitativas20. Con el fin de evitar el sesgo subjetivo que puede ocurrir durante la evaluación cualitativa, las mediciones cuantitativas del área muscular de la pared del cuerpo y la longitud de la fibra de miosina se probaron utilizando los programas de procesamiento de imágenes disponibles. Utilizamos estos métodos para evaluar la morfología muscular en animales portadores de mutaciones en los genes fzo-1/MFN2, dyn-1/DNM2 y unc-116/KIF5A en C. elegans,adulto de 3 días de edad. Para ambas mediciones, se aplicaron una serie de condiciones, de modo que al menos una sola célula muscular oblicua completa estaba a la vista, se excluyeron las células musculares que eran borrosas o fuera de foco, y las regiones anteriores y posteriores extremas, así como las regiones adyacentes a la vulva se omitió. Además de las mutaciones en los genes asociados a la CMT2, los animales también llevaban el transgén stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) que etiqueta una subunidad de cadena pesada de miosina C. elegans con GFP (Figura2A-E). La herramienta poligonal simple en el software de Fiji9 (versión 2.0.0) se utilizó para medir el área de una sola célula muscular. Si un animal experimentó descomposición de la estructura muscular de la pared corporal, dejando atrás espacios vacíos dentro de las células musculares, se calculó la relación entre el área de separación y el área total de la célula muscular única y se comparó con el control de tipo salvaje (Figura3A). Para obtener mediciones de la longitud de la fibra de miosina, cada imagen se segmentó por primera vez utilizando el software de ilastik10 (versión 1.3.0) (Figura3B). La segmentación es un proceso que permite clasificar y separar las fibras musculares individuales de secciones no deseadas como el fondo. Después de la segmentación, la imagen se exportó como una imagen binaria de 8 bits sin asignar. Fiji (versión 2.0.0) se utilizó a continuación para esqueletizar la imagen binaria para filtrar los píxeles de borde, dejando atrás fragmentos que representan las fibras originales. Las longitudes de las ramas de los esqueletos,o filamentos de miosina individuales, se analizaron en Fiji. Se excluyeron las mediciones de longitud de 0 o más de 250 m, que es la longitud máxima razonable para un filamento incluso con estiramiento muscular. En total, se midieron entre 2000 y 3000 longitudes de fibra de miosina. En la Figura 3Bse muestra un resumen del flujo de trabajo de segmentación. Los resultados del análisis cuantitativo se compararon además con la puntuación visual de los defectos musculares de la pared corporal, donde los animales de 3 días de edad fueron clasificados como defectuosos o no defectuosos en función de la integridad de la estructura muscular.

Se observaron defectos en la morfología muscular de la pared corporal entre 2,5 y 3,5 veces más alto en los animales de tipo fzo-1(cjn020), dyn-1(ky51) y unc-116(e2310) que en animales de tipo salvaje durante la evaluación visual (Figura 4A). La mayoría de los animales con mutaciones en fzo-1 y unc-116 experimentaron una pérdida visible de estrías musculares, gran aglomeración de GFP debido a la acumulación de desechos celulares, y la degeneración de la fibra muscular que dejó espacio de espacio dentro de las células musculares ( Figura 2C,E). En contraste, mientras que más del 60% de los mutantes dyn-1 fueron puntuados visualmente defectuosos, el alcance de los defectos fue mínimo en comparación con los otros dos mutantes genéticos. Sólo hubo una ligera pérdida de estrías, no hay agregaciones de GFP y sólo degeneración muscular menor en comparación con los otros dos mutantes (Figura2D y Figura 4A). Al igual que con otras puntuaciones fenotípicas, no se pudo considerar la extensión de los defectos, y una tendencia a sesgo podría hacer que se registre una mayor proporción de defectos. Por lo tanto, las mediciones cuantitativas del área de la célula muscular y la longitud de la fibra proporcionarían una representación más precisa de la extensión de los defectos musculares que la evaluación visual sola. En línea con los grandes huecos observados con la puntuación visual, se demostró que la relación entre el área de separación y el área total de una sola célula era de 5 a 6 veces mayor en los animales mutantes fzo-1 y unc-116 en comparación con el grupo de tipo salvaje, que sólo experimentó insignificante descomposición de la estructura muscular (Figura4B). La falta de colapso estructural en los mutantes dyn-1 dio lugar a un aumento no significativo de 3 veces en la brecha a la relación de la superficie muscular (Figura4B). Esto también indica que el sesgo del experimentador podría ser un factor que contribuye a la alta proporción de defectos asignados por la evaluación cualitativa. Sin embargo, las pequeñas brechas disminuyeron la longitud media de la fibra de 24 m en tipo salvaje a 22 m en mutantes dyn-1 (Figura4C). La longitud media de la fibra fue dramáticamente más corta en los mutantes fzo-1 y unc-116, correlacionando con la presencia de brechas más grandes dentro de las células musculares degenerativas en estos animales (Figura2C,E y Figura 4C ). Estos resultados son consistentes con nuestros hallazgos recientes que estudian los efectos de mutar los genes de CMT2 en C. elegans20. Además, destacan la evaluación más precisa de la morfología muscular utilizando estos métodos cuantitativos en comparación con la puntuación visual solamente, y proporcionan evidencia de que fzo-1 y unc-116 son necesarios para la morfología muscular normal.

Mediciones cuantitativas de la morfología mitocondrial utilizando la segmentación de objetos SQUASSH

Para entender cómo la ausencia de fission mitocondrial afecta la morfología mitocondrial en las neuronas C. elegans, realizamos análisis cuantitativos en las neuronas mequesensoriales PLM. DRP-1, el ortologo C. elegans de la proteína 1 relacionada con Dynamin de mamíferos (DRP1), controla la fesión mitocondrial, donde tras la activación se recluta desde el citosol para formar una espiral alrededor de las mitocondrias, constrintando y eventualmente separando ambos las membranas mitocondriales internas y externas21,22. Etiquetamos fluorescentemente mitocondrias con un transgén específico de tejido en las neuronas PLM, que tienen un largo proceso axonal que se puede visualizar fácilmente mediante microscopía de epifluorescencia. Se presume que la pérdida de físiones interrumpa la dinámica mitocondrial general y, por lo tanto, disminuye la creación de mitocondrias más nuevas y más pequeñas a través de un proceso conocido como23en ciernes.

Realizamos la segmentación SQUASSH para comparar la morfología mitocondrial en animales mutantes de tipo salvaje y drp-1. Analizamos las mitocondrias a partir de 6 neuronas PLM por genotipo, lo que resultó en un valor n de mayor que 200 mitocondrias para cada una. Las imágenes esquemáticas y representativas se muestran en la Figura 5A,B. Encontramos que los mutantes que carecen de DRP-1 tenían mitocondrias más grandes y alargadas (Figura5B-F). Las mitocondrias en el fondo mutante drp-1 eran un 32% más grandes que las de tipo salvaje (P a 0.0006, Figura 5C)y un 14% más alargadas (más lejos de un círculo perfecto) (P < 0.0001, Figura 5D). Para una evaluación más detallada de la varianza en tamaño y forma, trazamos histogramas para cada medida, ajustando los datos a distribuciones gaussianas (Figura5E,F). Encontramos que tanto para el tamaño como para la circularidad, los mutantes que carecen de la proteína de fisión tenían una varianza mayor (p < 0.0001 para ambos), destacada por la presencia de redes mitocondrias/mitocondriales más grandes y alargadas (ver Figura 5Bii para ver ejemplos ). En general, encontramos evidencia que sugiere que la mutación de drp-1 causa una falta de fission dentro de las neuronas PLM, lo que resulta en mitocondrias más grandes y alargadas. También demostramos que la interrupción de la fission mitocondrial causa un aumento en la varianza de la morfología mitocondrial.

Figura 1: Cuantificación de la integridad de la sinapsis en las neuronas PLM. (A) Las imágenes son proyecciones z máximas de la región sináptica PLM en un animal no transgénico. El panel izquierdo muestra la neurona PLM etiquetada con tagRFP, el segundo panel muestra la región presináptica etiquetada con SNB-1::GFP, la tercera imagen es una superposición con colocalización representada en amarillo y el cuarto panel es un esquema de la imagen superpuesta. (B) Imágenes confocales máximas de proyección z de la región sináptica en animales que sobreexpresan MEC-17. Las imágenes se muestran según el panel A. (C) Cuantificación del tamaño de la región presináptica en animales no transgénicos en comparación con los animales transgénicos que sobreexpresan MEC-17. (D) Cuantificación de los niveles de fluorescencia integrada relativa del SNB-1::GFP en animales no transgénicos frente a los animales transgénicos que sobreexpresan MEC-17. Para (C) y (D), las sinapsis individuales analizadas están representadas por círculos; n 10; media: S.E. se muestra en negro. P valores * < 0.05, ** < 0.01 de t-tests no emparejados; Las barras de escala representan 2 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización de los músculos de la pared corporal C. elegans. (A) Un animal que expresa el stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) transgén, que etiqueta la cadena pesada de miosina con GFP en los músculos de la pared del cuerpo. La matriz también induce un fenotipo rodante en el animal que facilita la visualización de las células musculares dispuestas a lo largo de los lados dorsal y ventral del cuerpo. Vistas ampliadas representativas de las fibras de miosina en (B) animales de tipo salvaje, (C) fzo-1(cjn020), (D) dyn-1(ky51) y (E) unc-116(e2310). Todos los animales fueron imágenes en la etapa de adulto de 3 días de edad. La barra de escala representa 60 m in (A) y 30 m in (B-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Medición del área muscular de la pared del cuerpo y la longitud de la fibra utilizando algoritmos computacionales disponibles. (A) Imagen de ejemplo que demuestra cómo se dibuja y calcula en Fiji el espacio de separación interna dentro de una sola célula muscular (cerrada en rojo) y el área de toda la célula (cerrada en amarillo) en Fiji para obtener la relación de área muscular. (B) Esquema del protocolo de segmentación en una sola imagen de ejemplo utilizando una combinación de Fiji e ilastik. La barra de escala representa 30 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Calificación y cuantificación de defectosmusculares de la pared corporal. (A) Evaluación visual de defectos musculares de la pared corporal. (B) Comparación del área del espacio en blanco con la relación total del área muscular entre WT y los mutantes indicados. (C) Medición de la longitud de la fibra de miosina. Para (B) y (C), sólo se incluyeron para su análisis imágenes con al menos una célula muscular oblicua visible completa. También se excluyeron las fibras con una longitud de 0 m o superior a 250 m. Las barras representan el porcentaje de animales defectuosos en (A) y la media de S.E.M. en (B) y (C); n valores enumerados en cada barra. Se realizaron pruebas de chi-cuadrado con tasa de detección falsa para comparar defectos visuales en (A), mientras que el ANOVA unidireccional con las pruebas post hoc de Dunnett para la comparación múltiple se utilizaron para analizar las mediciones cuantitativas en (B) y (C). *P < 0.05, ****P < 0.0001, ns no es significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Morfología mitocondrial dentro de los axons de las neuronas PLM. (A) Esquema de una neurona mecanosensorial del microtúbulo lateral posterior (PLM) en la cola de C. elegans. El cuadro rojo indica la ubicación aproximada de las secciones resaltadas en (B),que muestran imágenes representativas de las mitocondrias etiquetadas por GFP (Pmec-4::MLS::GFP) dentro del axón PLM. Puncta verde brillante indican mitocondrias. En comparación con el WT (i), drp-1(tm1108) mutantes (ii) muestran mitocondrias más grandes y alargadas. Las imágenes son representativas de los axónicos de n a 6 PLM de 6 gusanos por genotipo; barras de escala de 15 m. (C) Tamaño medio (m2) de mitocondrion individual cuantificado por la segmentación de objetos SQUASSH en gusanos adultos de 3 días de edad (3DOA). (D) Circularidad media de mitocondrion individual dentro del axón PLM, cuantificado a partir de mediciones de objetos SQUASSH en 3DOAs. (E) Histograma y distribución gaussiana que muestra la varianza del tamaño mitocondrial. La prueba F (P < 0.0001) muestra que las varianzas son significativamente diferentes entre el histograma drp-1 y WT. (F) y la distribución gaussiana que muestra la varianza de la circularidad mitocondrial. Los datos se representan como media +/- SEM. *** P < 0.001, **** P <0.0001 de la prueba t de Welch; n 204 mitocondrias para análisis cuantitativos a partir de gusanos n.o 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Lista de cepas de C. elegans utilizadas en este estudio.

Cuadro 2. Parámetros SQUASSH para la segmentación de las mitocondrias.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.