Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Los modelos animales experimentales son indispensables en la investigación inmune básica. La administración de bacterias enteras o componentes microbianos se ha utilizado con frecuencia en modelos animales pequeños para inducir inflamación local o sistémica¹. El lipopolisacárido (LPS, o endotoxina bacteriana) es un componente de pared celular y antígeno superficial de bacterias gramnegativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella spp.). La molécula termoestable y grande (peso molecular 1-4 x 10⁶ kDa) consiste en una mitad lipídica (Lípido A), región central (oligosacárido), y un polisacárido O (o antígeno O). El lípido A, con sus cadenas de ácidos grasos hidrófobos, ancla la molécula en una membrana bacteriana y media (sobre la degradación de las bacterias) la actividad inmunológica y la toxicidad de LPS. Después de la unión a la proteína de unión LPS (LBP), los complejos LPS:LBP ligan el complejo receptor CD14/TLR4/MD2 ubicado en la superficie de muchos tipos de células, induciendo una fuerte reacción proinflamatoria con translocación nuclear NF-B y posterior regulación ascendente de la expresión de citoquinas².

La lesión pulmonar aguda (ALI) se define como insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda con edema pulmonar bilateral en ausencia de insuficiencia cardíaca³. La administración de las vías respiratorias de LPSes una forma común de inducir inflamación pulmonar y ALI 4,^5,6,7. Aunque la sustancia estéril no es adecuada para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, las preguntas inmunológicas mecanicistas pueden responderse con una precisión adecuada. La insitación de LPS en la tráquea induce una reacción inflamatoria robusta con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar en cuestión de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS^{3, 6,7}.

El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones por instanición de LPS intratraal. El modelo ha sido validado mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la invasión de granulocitos neutrófilos y la fuga de albúmina intra-alveolar como se describió anteriormente⁸.

Este protocolo animal fue aprobado por el comité local para el cuidado de animales (LANUV, Recklinghausen, Alemania; protocolo no 84-02.04.2015) y se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales vivos (publicación de la NIH No 85-23, revisado 1996).

1. Inducción de ALI

2. Muestreo de sangre, lavado broncoalveolar, extracción de órganos

NOTA: El momento de la eutanización depende de la cuestión científica abordada. Por lo general, se realiza 12-72 h siguiendo la instilación de LPS^3,4,9,10. La gravedad de la ALI se puede determinar clínicamente mediante la observación regular de la temperatura corporal y los síntomas de dificultad respiratoria¹¹.

1. Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara inundada de isoflurano. Use 3 vol% isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min. Asegurar la narcosis profunda induciendo un estímulo táctil. En caso de falta de profundidad de la anestesia, aumentar el isoflurano hasta 5 vol%.
2. Sacrificar el ratón en anestesia profunda por dislocación atlanto-occipital.
3. Fije el ratón con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte pronto el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retire partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior (IVC) directamente a la columna vertebral y la aorta abdominal.
4. Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de 23 G conectada a una jeringa de 1 ml en la ICV directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 l de sangre y transferirlo a un tubo de 1,5 ml lleno de 20 ml de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 M. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo en hielo.
5. Para el lavado broncoalveolar (BAL), prepare tres jeringas de 1 ml con 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire cada una. Desinfecte brevemente el pelaje de la garganta con 70% de etanol y exponga cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura.
6. Realizar BAL: Perforar la tráquea usando microtijeras e insertar un catéter venoso de 22 G cortado a una longitud de 20 mm. Fije el catéter con la sutura e inculca 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire. Aspirar el líquido después de 60 s. Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja el aspirado completo en un tubo de 15 ml sobre hielo.
7. Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales. Evite cuidadosamente puncturar los pulmones. Levante el esternón cranealmente y arréjelo o retírelo.
8. Preparar dos jeringas de 10 ml con PBS caliente a 37oC (sin calcio y magnesio). Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cáula de 26 G y lavar la circulación pulmonar con el PBS precalentado. Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento.
9. Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en dos mitades. Congelación rápida en nitrógeno líquido, seguido de almacenamiento a largo plazo a -80 oC para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.
10. Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pocillos picando el tejido con tijera y pinza. Incubar el tejido en 2 ml de tampón de digestión [RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,1% NaN₃, colagenasa I (1 mg/ml), y DNase II (7 mg/ml)] a 37 oC durante 60 min. Realizar una mayor homogeneización mediante una cuidadosa pipeteo de las piezas pulmonares de tejido hacia arriba y hacia abajo.

3. Preparación de tejidos para el análisis facS

1. Preparar el tampón FACS fresco (Tabla1):utilice siempre PBS libre de calcio y magnesio para reducir la adhesión de célula a célula dependiente de cationes y evitar la acumulación. Suplemento con FCS (1%) para proteger las células de la apoptosis, evitar manchas inespecíficas y evitar que las células se peguen a los tubos FACS. Incluya EDTA (0,5 mM) para prevenir la adhesión de célula a célula basada en cationes cuando trabaje con células pegajosas y adherentes como macrófagos. Añadir azida sódica (0,1%), ya que evita la contaminación bacteriana y el fotoblanqueo de fluorocromos y bloquea el desprendimiento de anticuerpos.
2. Transfiera las muestras de sangre (paso 2.4) a tubos FACS de 5 ml y mezcle suavemente la sangre con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Poner los tubos en hielo y terminar la reacción después de 2 min añadiendo 2 ml de PBS helado. Centrifugar las muestras durante 5 min a 400 x g y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos¹²descritos anteriormente.
   NOTA: El momento de la eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos como parte de la inflamación sistémica. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 10⁶ celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.
3. Líquido BAL centrífugo (paso 2.6) durante 5 min a 400 x g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido, seguido de un almacenamiento a largo plazo a -80 oC para un análisis de proteínas posterior. Resuspenda el gránulo de célula salconsión BAL con 2 ml de tampón FACS frío y, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 m para sujetar los vellos.
4. Una vez más, centrifugar la muestra durante 5 min a 400 xg. Resuspenda el pellet con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos¹²descritos anteriormente.
   NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en BAL como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 10⁶ celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.
5. Transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido (paso 2.10) en un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 ml para extraer grumos y terminar el proceso de digestión añadiendo 2 ml de tampón FACS helado. Centrifugar la muestra durante 5 min a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 60 l de tampón facS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente¹².
   NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en el tejido pulmonar como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 10⁶ celdas/60 l para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.
6. Para el análisis facS, incubar células con anticuerpo CD16/CD32 a 4 oC durante 15 minutos para bloquear la unión no específica de la inmunoglobulina a los receptores Fc. Añadir 20 l de solución de bloqueo a 1 x 10⁶ celdas en 60 l en un tubo de 5 ml.
7. Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con tampón FACS y anticuerpos como se describe en la Tabla2.
8. Después del bloqueo, no lave las células. Añadir 20 l de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 l. Incubar las muestras durante 20 minutos en la oscuridad a 4 oC.
9. Lave cada muestra con 1 ml de tampón facS y centrífuga durante 5 min a 400 xg. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS.
   NOTA: Se sugiere un número de célula de 1 x 10⁶ células/500 l para lograr los mejores resultados de fenotipado inmune en el análisis FACS con este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los anticuerpos tengan que ser valorados individualmente.
10. Si es necesario, añada la tinción viva/muerta antes de la tinción de la superficie utilizando kits específicos disponibles comercialmente⁸.
11. Por último, añada a cada muestra números fijos de perlas de calibración acopladas con fluorocromo disponibles en el mismo (3 x 10⁵ perlas en 20 l de búfer FACS) para determinar los números de celda absolutos^12. La estrategia de gating para la sangre, BAL y células tisulares se muestra en la Figura2.

El enfoque descrito para inducir la ALI en ratones se validó mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la infiltración de granulocitos neutrófilos y la interrupción de la barrera alveolo-capilar 24 h y 72 h después de la instilación de LPS. Los animales inyectados por PBS sirvieron como control. La administración de LPS intratraqueal indujo una respuesta proinflamatoria pulmonar robusta. La expresión del TNF-o en el tejido pulmonar fue significativamente regulada, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 veces en comparación con los animales de control [RQ (TNF-/18s); 24 h: 53,7 (SD a 11,6); 72 h: 55,0 (SD a 20,6); p < 0,05)] (Figura3A). La invasión de leucocitos en el espacio tisular y alveolar es un sello distintivo y característico para el desarrollo de ALI13. El análisis facS reveló una infiltración significativa de granulocitos neutrófilos (NG) en el intersticio pulmonar, con un recuento absoluto de células que se ha multiplicado casi 9 en comparación con los controles después de 24 h [65.243 (SD 15.855) frente a 7.358 (SD a 4.794), p < 0,05] ( Figura 3B). El recuento absoluto de NG disminuyó ligeramente después de 72 h; sin embargo, los aumentos del factor en comparación con los controles se mantuvieron estables [48.946 (SD a 5.223) frente a 5.510 (SD a 654), p < 0,05]. De acuerdo con la infiltración intersticial de NG, la expresión MMP-9 en el tejido pulmonar entero también se incrementó significativamente durante el período total de observación [RQ (MMP-9/18s), 24 h: 7,4 (SD a 1,5); 72 h: 10,4 (SD a 2,0); p < 0,05] (Figura3C).

NG no sólo se incrementaron en el tejido pulmonar, sino también en el líquido BAL. El aumento del pliegue en comparación con los animales de control fue más pronunciado que en el tejido pulmonar, con recuentos absolutos de NG 24 h después de la inducción de ALI de 52.005 (SD 21.906) frente a 1.829 (SD a 1.724) (p < 0,05) (Figura 3D). Después de 72 h, NG se incrementó a 37.254 (SD a 4.478) frente a 17,0 (SD a 10,8) (p < 0,05). El edema pulmonar debido a un deterioro grave de la barrera alveolo-capilar es patognomónico para el desarrollo de LAI, con LPS induciendo rápidamente la apoptosis endotelial y el aumento de la permeabilidad14,15. El análisis del contenido de albúmina en BAL fluid por ELISA reveló una pérdida significativa de la función de barrera. 24 h después de la instilación de LPS, la albúmina en el líquido BAL fue de 43 ng/ml (SD n.o 13), en comparación con 20 ng/mL (SD n.o 9) en condiciones de control (p < 0,05) (Figura3E). Después de 72 h, en animales de ALI, el contenido de albúmina era de 48 ng/ml (SD n.o 14), en comparación con 29 ng/mL (SD n.o 9) (p < 0,05).

Figura 1 : Diagrama esquemático de la configuración de intubación. Cabe señalar que el cuello del ratón debe ser super-extendido en un ángulo de 90o en relación con la mesa de operaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Estrategia de gating FACS para sangre, BAL y células tisulares. Las manchas de puntos ejemplares del análisis FACS se muestran en gráficas de pseudocolor de dos parámetros (fluorescencia de doble color). La estrategia de gating para las muestras respectivas se basa en células individuales. (A) Árbol de gating para las células de la sangre: a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas /muertas; no es necesaria la tinción CD45 como en la sangre, la alta autofluorescencia hace que las poblaciones celulares sean claramente distinguibles); d • granulocitos neutrófilos; e - monocitos (según la tinción Gr1 y CD115). (B) Árbol de gating para el líquido de lavado broncoalveolar (BAL): a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas/muertas); c - CD45+ células inmunitarias; d • granulocitos neutrófilos; y e - macrófagos (según la tinción Ly6G y F4/80). (C) Árbol de gating para el tejido pulmonar: a - células muertas; b - células vivas (según la tinción de células vivas/muertas); c - CD45+ células inmunitarias; d • granulocitos neutrófilos; y e - macrófagos (según la tinción Ly6G y F4/80). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Validación del modelo murine ALI contra animales de control. (A) Expresión de TNF-o en el tejido pulmonar de los ratones hembra C57BL/6 24 h y 72 h tras la instillación intratraal de LPS (cambio de expresión de animales falsos). (B) Análisis FACS del recuento absoluto de granulocitos neutrófilos en el tejido pulmonar. (C) Expresión de MMP-9 en el tejido pulmonar (cambio de expresión de animales falsos). (D) Análisis FACS del recuento absoluto de granulocitos neutrófilos en el líquido de lavado broncoalveolar. (E) Contenido de albúmina en el líquido BAL [media: SD, n a 7, prueba Mann-Whitney U, *p < 0,05 (vs. control PBS)]. Esta cifra ha sido modificada de Ehrentraut et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición del búfer FACS.

Tabla 2: Preparación de la mezcla maestra para la tinción FACS. La tabla describe la preparación de mezcla maestra para 10 muestras.

Los autores no tienen nada que revelar.