Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.
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Artículo de método
Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal
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Resumen
Resumen
La administración de lipopolisacáridos (LPS) es una forma común de estudiar la inflamación pulmonar y la lesión pulmonar aguda (ALI) en modelos animales pequeños. Se han descrito varios enfoques, como la inhalación de LPS aerosolizado, así como la insculación nasal o intratraal. El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones mediante la insinfección directa de LPS intratraqueal y realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar. Después de la sedación intraperitoneal, la tráquea se expone y el LPS se administra a través de un catéter venoso de 22 G. Una reacción inflamatoria robusta y reproducible con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar se induce dentro de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS utilizado. La recolección de muestras de sangre, el líquido BAL y la recolección pulmonar, así como el procesamiento para el análisis de FACS, se describen en detalle en el protocolo. Aunque el uso del LPS estéril no es adecuado para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, el enfoque descrito ofrece una mínima invasividad, un manejo sencillo y una buena reproducibilidad para responder a preguntas inmunológicas mecanicistas. Además, la valoración de la dosis, así como el uso de preparaciones alternativas de LPS o cepas de ratón permiten la modulación de los efectos clínicos, que pueden exhibir diferentes grados de gravedad de la ALI o temprano frente a la aparición tardía de los síntomas de la enfermedad.
Introducción
Los modelos animales experimentales son indispensables en la investigación inmune básica. La administración de bacterias enteras o componentes microbianos se ha utilizado con frecuencia en modelos animales pequeños para inducir inflamación local o sistémica1. El lipopolisacárido (LPS, o endotoxina bacteriana) es un componente de pared celular y antígeno superficial de bacterias gramnegativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella spp.). La molécula termoestable y grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste en una mitad lipídica (Lípido A), región central (oligosacárido), y un polisacárido O (o antígeno O). El lípido A, con sus cadenas de ácidos grasos hidrófobos, ancla la molécula en una membrana bacteriana y media (sobre la degradación de las bacterias) la actividad inmunológica y la toxicidad de LPS. Después de la unión a la proteína de unión LPS (LBP), los complejos LPS:LBP ligan el complejo receptor CD14/TLR4/MD2 ubicado en la superficie de muchos tipos de células, induciendo una fuerte reacción proinflamatoria con translocación nuclear NF-B y posterior regulación ascendente de la expresión de citoquinas2.
La lesión pulmonar aguda (ALI) se define como insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda con edema pulmonar bilateral en ausencia de insuficiencia cardíaca3. La administración de las vías respiratorias de LPSes una forma común de inducir inflamación pulmonar y ALI 4,5,6,7. Aunque la sustancia estéril no es adecuada para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, las preguntas inmunológicas mecanicistas pueden responderse con una precisión adecuada. La insitación de LPS en la tráquea induce una reacción inflamatoria robusta con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar en cuestión de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS3, 6,7.
El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones por instanición de LPS intratraal. El modelo ha sido validado mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la invasión de granulocitos neutrófilos y la fuga de albúmina intra-alveolar como se describió anteriormente8.
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Protocolo
Este protocolo animal fue aprobado por el comité local para el cuidado de animales (LANUV, Recklinghausen, Alemania; protocolo no 84-02.04.2015) y se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales vivos (publicación de la NIH No 85-23, revisado 1996).
1. Inducción de ALI
2. Muestreo de sangre, lavado broncoalveolar, extracción de órganos
NOTA: El momento de la eutanización depende de la cuestión científica abordada. Por lo general, se realiza 12-72 h siguiendo la instilación de LPS3,4,9,10. La gravedad de la ALI se puede determinar clínicamente mediante la observación regular de la temperatura corporal y los síntomas de dificultad respiratoria11.
- Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara inundada de isoflurano. Use 3 vol% isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min. Asegurar la narcosis profunda induciendo un estímulo táctil. En caso de falta de profundidad de la anestesia, aumentar el isoflurano hasta 5 vol%.
- Sacrificar el ratón en anestesia profunda por dislocación atlanto-occipital.
- Fije el ratón con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte pronto el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retire partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior (IVC) directamente a la columna vertebral y la aorta abdominal.
- Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de 23 G conectada a una jeringa de 1 ml en la ICV directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 l de sangre y transferirlo a un tubo de 1,5 ml lleno de 20 ml de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 M. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo en hielo.
- Para el lavado broncoalveolar (BAL), prepare tres jeringas de 1 ml con 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire cada una. Desinfecte brevemente el pelaje de la garganta con 70% de etanol y exponga cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura.
- Realizar BAL: Perforar la tráquea usando microtijeras e insertar un catéter venoso de 22 G cortado a una longitud de 20 mm. Fije el catéter con la sutura e inculca 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire. Aspirar el líquido después de 60 s. Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja el aspirado completo en un tubo de 15 ml sobre hielo.
- Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales. Evite cuidadosamente puncturar los pulmones. Levante el esternón cranealmente y arréjelo o retírelo.
- Preparar dos jeringas de 10 ml con PBS caliente a 37oC (sin calcio y magnesio). Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cáula de 26 G y lavar la circulación pulmonar con el PBS precalentado. Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento.
- Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en dos mitades. Congelación rápida en nitrógeno líquido, seguido de almacenamiento a largo plazo a -80 oC para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.
- Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pocillos picando el tejido con tijera y pinza. Incubar el tejido en 2 ml de tampón de digestión [RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,1% NaN3, colagenasa I (1 mg/ml), y DNase II (7 mg/ml)] a 37 oC durante 60 min. Realizar una mayor homogeneización mediante una cuidadosa pipeteo de las piezas pulmonares de tejido hacia arriba y hacia abajo.
3. Preparación de tejidos para el análisis facS
- Preparar el tampón FACS fresco (Tabla1):utilice siempre PBS libre de calcio y magnesio para reducir la adhesión de célula a célula dependiente de cationes y evitar la acumulación. Suplemento con FCS (1%) para proteger las células de la apoptosis, evitar manchas inespecíficas y evitar que las células se peguen a los tubos FACS. Incluya EDTA (0,5 mM) para prevenir la adhesión de célula a célula basada en cationes cuando trabaje con células pegajosas y adherentes como macrófagos. Añadir azida sódica (0,1%), ya que evita la contaminación bacteriana y el fotoblanqueo de fluorocromos y bloquea el desprendimiento de anticuerpos.
- Transfiera las muestras de sangre (paso 2.4) a tubos FACS de 5 ml y mezcle suavemente la sangre con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Poner los tubos en hielo y terminar la reacción después de 2 min añadiendo 2 ml de PBS helado. Centrifugar las muestras durante 5 min a 400 x g y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente.
NOTA: El momento de la eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos como parte de la inflamación sistémica. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Líquido BAL centrífugo (paso 2.6) durante 5 min a 400 x g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido, seguido de un almacenamiento a largo plazo a -80 oC para un análisis de proteínas posterior. Resuspenda el gránulo de célula salconsión BAL con 2 ml de tampón FACS frío y, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 m para sujetar los vellos.
- Una vez más, centrifugar la muestra durante 5 min a 400 xg. Resuspenda el pellet con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente.
NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en BAL como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido (paso 2.10) en un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 ml para extraer grumos y terminar el proceso de digestión añadiendo 2 ml de tampón FACS helado. Centrifugar la muestra durante 5 min a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 60 l de tampón facS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente12.
NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en el tejido pulmonar como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo. - Para el análisis facS, incubar células con anticuerpo CD16/CD32 a 4 oC durante 15 minutos para bloquear la unión no específica de la inmunoglobulina a los receptores Fc. Añadir 20 l de solución de bloqueo a 1 x 106 celdas en 60 l en un tubo de 5 ml.
- Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con tampón FACS y anticuerpos como se describe en la Tabla2.
- Después del bloqueo, no lave las células. Añadir 20 l de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 l. Incubar las muestras durante 20 minutos en la oscuridad a 4 oC.
- Lave cada muestra con 1 ml de tampón facS y centrífuga durante 5 min a 400 xg. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS.
NOTA: Se sugiere un número de célula de 1 x 106 células/500 l para lograr los mejores resultados de fenotipado inmune en el análisis FACS con este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los anticuerpos tengan que ser valorados individualmente. - Si es necesario, añada la tinción viva/muerta antes de la tinción de la superficie utilizando kits específicos disponibles comercialmente8.
- Por último, añada a cada muestra números fijos de perlas de calibración acopladas con fluorocromo disponibles en el mismo (3 x 105 perlas en 20 l de búfer FACS) para determinar los números de celda absolutos12. La estrategia de gating para la sangre, BAL y células tisulares se muestra en la Figura2.
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Resultados
El enfoque descrito para inducir la ALI en ratones se validó mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la infiltración de granulocitos neutrófilos y la interrupción de la barrera alveolo-capilar 24 h y 72 h después de la instilación de LPS. Los animales inyectados por PBS sirvieron como control. La administración de LPS intratraqueal indujo una respuesta proinflamatoria pulmonar robusta. La expresión del TNF-o en el tejido pulmonar fue significativamente regulada, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 v...
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Discusión
La mínima invasividad, el manejo simple y la buena reproducibilidad son características clave del enfoque presentado para inducir ALI en un modelo de roedores pequeños. El uso de LPS en lugar de bacterias enteras en modelos animales tiene ventajas. Es un compuesto estable y puro y se puede almacenar en forma liofilizada hasta su uso. Es un potente estimulante para las respuestas inmunitarias innatas a través de la vía TLR4, y su actividad biológica puede cuantificarse fácilmente, facilitando la valoración de la gravedad ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Jan Kleiner y Susanne Schulz por proporcionar apoyo técnico. Los autores reconocen el excelente apoyo de la instalación central de citometría de flujo en la facultad de medicina de la Universidad de Bonn. Los autores no recibieron financiación de ninguna organización externa. Parte de los datos indicados en la sección de resultados y que se describen en la Figura 3 ya se han mostrado en una publicación anterior8.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringas de 1 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | 300013 | |
| Jeringas de 10 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU | . 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | 25-4801-82 | |
| Anti-GR1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU | . 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Clorhidrato de buprenorfina | Indivior UK Limited, Berkshire, Reino Unido | ||
| C57BL/6 ratones, hembra, 10 - 12 semanas de edad | Charles River, Wilmongton, MA, EE. UU | ||
| . CaliBRITE APC-beads (6µ m) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU | 340487 | |
| Cánula calibre 23 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU | . 300800 | |
| Cánula calibre 26 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU | . 303800 | |
| Filtro de celdas 70 y micro; m | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | 352350 | |
| Colagenasa Tipo I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | . 1148089 | |
| Desoxirribonucleasa II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | . D8764 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco, estéril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | D8662 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS), sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio, estéril | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | D8537 | |
| Solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | E7889 | |
| Tubos FACS, 5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania | 551579 | |
| Suero fetal para terneros (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | Fórceps F2442 | |
| Fine | Science Tools, Heidelberg, Alemania | 11049-10 | |
| Isoflurano | Baxter, Unterschleiß heim, Alemania | ||
| Clorhidrato de ketamina | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemania | ||
| Lipopolisacáridos (LPS) de Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | L2630 | |
| LIVE/DEAD Kit verde de célula muerta reparable | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | L23101 | |
| Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block™), Clon 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | 553141 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU. | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, con L-glutamina y bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | Tijeras R8758 | |
| Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania | 14060-09 | ||
| Azida de sodio (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. | S2002 | |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania | 15018-10 | |
| Pinzas de tejido | Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania | 11021-12 | |
| Tubos | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 30125150 | |
| Catéter venoso, calibre 22 | B.Braun, Melsungen, Alemania | 4268091B | |
| Xilacina clorhidrato | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemania |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
