Name: Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende a inducir lesión pulmonar aguda en ratones mediante instilación intratraqueal de lipopolisacárido. Este modelo reproducible permite analizar muestras sanguíneas, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar por citometría de flujo.

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Los autores desean agradecer a Jan Kleiner y Susanne Schulz por proporcionar apoyo técnico. Los autores reconocen el excelente apoyo de la instalación central de citometría de flujo en la facultad de medicina de la Universidad de Bonn. Los autores no recibieron financiación de ninguna organización externa.  Parte de los datos indicados en la sección de resultados y que se describen en la Figura 3 ya se han mostrado en una publicación anterior8.

Este protocolo animal fue aprobado por el comité local para el cuidado de animales (LANUV, Recklinghausen, Alemania; protocolo no 84-02.04.2015) y se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el uso de animales vivos (publicación de la NIH No 85-23, revisado 1996).
1. Inducción de ALI
<ol></ol>2. Muestreo de sangre, lavado broncoalveolar, extracción de órganos
NOTA: El momento de la eutanización depende de la cuestión científica abordada. Por lo general, se realiza 12-72 h siguiendo la instilación de LPS3,4,9,10. La gravedad de la ALI se puede determinar clínicamente mediante la observación regular de la temperatura corporal y los síntomas de dificultad respiratoria11.
<ol><li>Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara inundada de isoflurano. Use 3 vol% isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min. Asegurar la narcosis profunda induciendo un estímulo táctil. En caso de falta de profundidad de la anestesia, aumentar el isoflurano hasta 5 vol%.</li>
	<li>Sacrificar el ratón en anestesia profunda por dislocación atlanto-occipital.</li>
	<li>Fije el ratón con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte pronto el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retire partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior (IVC) directamente a la columna vertebral y la aorta abdominal.</li>
	<li>Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de 23 G conectada a una jeringa de 1 ml en la ICV directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 l de sangre y transferirlo a un tubo de 1,5 ml lleno de 20 ml de solución de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) de 0,5 M. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo en hielo.</li>
	<li>Para el lavado broncoalveolar (BAL), prepare tres jeringas de 1 ml con 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire cada una. Desinfecte brevemente el pelaje de la garganta con 70% de etanol y exponga cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura.</li>
	<li>Realizar BAL: Perforar la tráquea usando microtijeras e insertar un catéter venoso de 22 G cortado a una longitud de 20 mm. Fije el catéter con la sutura e inculca 0,5 ml de PBS estéril y 0,1 ml de aire. Aspirar el líquido después de 60 s. Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja el aspirado completo en un tubo de 15 ml sobre hielo.</li>
	<li>Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales. Evite cuidadosamente puncturar los pulmones. Levante el esternón cranealmente y arréjelo o retírelo.</li>
	<li>Preparar dos jeringas de 10 ml con PBS caliente a 37oC (sin calcio y magnesio). Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cáula de 26 G y lavar la circulación pulmonar con el PBS precalentado. Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento.</li>
	<li>Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en dos mitades. Congelación rápida en nitrógeno líquido, seguido de almacenamiento a largo plazo a -80 oC para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.</li>
	<li>Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pocillos picando el tejido con tijera y pinza. Incubar el tejido en 2 ml de tampón de digestión [RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,1% NaN3, colagenasa I (1 mg/ml), y DNase II (7 mg/ml)] a 37 oC durante 60 min. Realizar una mayor homogeneización mediante una cuidadosa pipeteo de las piezas pulmonares de tejido hacia arriba y hacia abajo.</li>
</ol>3. Preparación de tejidos para el análisis facS
<ol><li>Preparar el tampón FACS fresco (Tabla1):utilice siempre PBS libre de calcio y magnesio para reducir la adhesión de célula a célula dependiente de cationes y evitar la acumulación. Suplemento con FCS (1%) para proteger las células de la apoptosis, evitar manchas inespecíficas y evitar que las células se peguen a los tubos FACS. Incluya EDTA (0,5 mM) para prevenir la adhesión de célula a célula basada en cationes cuando trabaje con células pegajosas y adherentes como macrófagos. Añadir azida sódica (0,1%), ya que evita la contaminación bacteriana y el fotoblanqueo de fluorocromos y bloquea el desprendimiento de anticuerpos.</li>
	<li>Transfiera las muestras de sangre (paso 2.4) a tubos FACS de 5 ml y mezcle suavemente la sangre con 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Poner los tubos en hielo y terminar la reacción después de 2 min añadiendo 2 ml de PBS helado. Centrifugar las muestras durante 5 min a 400 x g y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente. NOTA: El momento de la eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos como parte de la inflamación sistémica. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.</li>
	<li>Líquido BAL centrífugo (paso 2.6) durante 5 min a 400 x g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido, seguido de un almacenamiento a largo plazo a -80 oC para un análisis de proteínas posterior. Resuspenda el gránulo de célula salconsión BAL con 2 ml de tampón FACS frío y, a continuación, transfiera la suspensión a un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 m para sujetar los vellos.</li>
	<li>Una vez más, centrifugar la muestra durante 5 min a 400 xg. Resuspenda el pellet con 60 ml de tampón y proceso FACS para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos12descritos anteriormente. NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en BAL como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l en este paso para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.</li>
	<li>Transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido (paso 2.10) en un tubo FACS de 5 ml utilizando un filtro de malla de 100 ml para extraer grumos y terminar el proceso de digestión añadiendo 2 ml de tampón FACS helado. Centrifugar la muestra durante 5 min a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 60 l de tampón facS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente12. NOTA: El tiempo de eutanización del ratón influye en el recuento de leucocitos en el tejido pulmonar como parte de la inflamación. Por lo tanto, se recomienda ajustar el número de celda a 1 x 106 celdas/60 l para lograr los mejores resultados de tinción para el análisis de citometría de flujo.</li>
	<li>Para el análisis facS, incubar células con anticuerpo CD16/CD32 a 4 oC durante 15 minutos para bloquear la unión no específica de la inmunoglobulina a los receptores Fc. Añadir 20 l de solución de bloqueo a 1 x 106 celdas en 60 l en un tubo de 5 ml.</li>
	<li>Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con tampón FACS y anticuerpos como se describe en la Tabla2.</li>
	<li>Después del bloqueo, no lave las células. Añadir 20 l de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 l. Incubar las muestras durante 20 minutos en la oscuridad a 4 oC.</li>
	<li>Lave cada muestra con 1 ml de tampón facS y centrífuga durante 5 min a 400 xg. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS. NOTA: Se sugiere un número de célula de 1 x 106 células/500 l para lograr los mejores resultados de fenotipado inmune en el análisis FACS con este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los anticuerpos tengan que ser valorados individualmente.</li>
	<li>Si es necesario, añada la tinción viva/muerta antes de la tinción de la superficie utilizando kits específicos disponibles comercialmente8.</li>
	<li>Por último, añada a cada muestra números fijos de perlas de calibración acopladas con fluorocromo disponibles en el mismo (3 x 105 perlas en 20 l de búfer FACS) para determinar los números de celda absolutos12. La estrategia de gating para la sangre, BAL y células tisulares se muestra en la Figura2.</li>
</ol>

<ol><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li>
<li>Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li>
<li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li>
<li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12(2018).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li>
<li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li>
<li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li>
<li>Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation%3A+mechanisms+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li>
<li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li>
<li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li>
<li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La mínima invasividad, el manejo simple y la buena reproducibilidad son características clave del enfoque presentado para inducir ALI en un modelo de roedores pequeños. El uso de LPS en lugar de bacterias enteras en modelos animales tiene ventajas. Es un compuesto estable y puro y se puede almacenar en forma liofilizada hasta su uso. Es un potente estimulante para las respuestas inmunitarias innatas a través de la vía TLR4, y su actividad biológica puede cuantificarse fácilmente, facilitando la valoración de la gravedad ...

Los modelos animales experimentales son indispensables en la investigación inmune básica. La administración de bacterias enteras o componentes microbianos se ha utilizado con frecuencia en modelos animales pequeños para inducir inflamación local o sistémica1. El lipopolisacárido (LPS, o endotoxina bacteriana) es un componente de pared celular y antígeno superficial de bacterias gramnegativas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella spp.). La molécula termoestable y grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste en una mitad lipídica (Lípido A), región central (oligosacárido), y un polisacárido O (o antígeno O). El lípido A, con sus cadenas de ácidos grasos hidrófobos, ancla la molécula en una membrana bacteriana y media (sobre la degradación de las bacterias) la actividad inmunológica y la toxicidad de LPS. Después de la unión a la proteína de unión LPS (LBP), los complejos LPS:LBP ligan el complejo receptor CD14/TLR4/MD2 ubicado en la superficie de muchos tipos de células, induciendo una fuerte reacción proinflamatoria con translocación nuclear NF-B y posterior regulación ascendente de la expresión de citoquinas2.
La lesión pulmonar aguda (ALI) se define como insuficiencia respiratoria hipoxémica aguda con edema pulmonar bilateral en ausencia de insuficiencia cardíaca3. La administración de las vías respiratorias de LPSes una forma común de inducir inflamación pulmonar y ALI 4,5,6,7. Aunque la sustancia estéril no es adecuada para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, las preguntas inmunológicas mecanicistas pueden responderse con una precisión adecuada. La insitación de LPS en la tráquea induce una reacción inflamatoria robusta con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar en cuestión de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS3, 6,7.
El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones por instanición de LPS intratraal. El modelo ha sido validado mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la invasión de granulocitos neutrófilos y la fuga de albúmina intra-alveolar como se describió anteriormente8.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de 1 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de 10 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (c-fms) APC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>17-1152-80</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>11-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (30-F11) - eF450</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU</td><td>. 48-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GR1 (RB6-8C5)</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td><td>. 552093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>45-5932-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td><td>Bio Legend, San Diego, CA</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina</td><td>Indivior UK Limited, Berkshire, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones, hembra, 10 - 12 semanas de edad</td><td>Charles River, Wilmongton, MA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. CaliBRITE APC-beads (6&micro; m)</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td>. <td>340487</td><td></td></tr><tr><td>Cánula calibre 23 1''</td> <td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td><td>. 300800</td><td></td></tr><tr><td>Cánula calibre 26 1/2''</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td><td>. 303800</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de celdas 70 y micro; m</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td>. 1148089</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa II</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td>. D8764&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco, estéril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS), sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio, estéril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS, 5 ml</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>551579</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>Fórceps F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos (LPS) de Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit verde de célula muerta reparable</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>L23101</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block&trade;), Clon 2.4G2</td><td>BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640, con L-glutamina y bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>Tijeras R8758</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Catéter venoso, calibre 22</td><td>B.Braun, Melsungen, Alemania</td><td>4268091B</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina clorhidrato</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

La administración de lipopolisacáridos (LPS) es una forma común de estudiar la inflamación pulmonar y la lesión pulmonar aguda (ALI) en modelos animales pequeños. Se han descrito varios enfoques, como la inhalación de LPS aerosolizado, así como la insculación nasal o intratraal. El protocolo presentado describe un procedimiento detallado paso a paso para inducir la ALI en ratones mediante la insinfección directa de LPS intratraqueal y realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y tejido pulmonar. Después de la sedación intraperitoneal, la tráquea se expone y el LPS se administra a través de un catéter venoso de 22 G. Una reacción inflamatoria robusta y reproducible con invasión de leucocitos, regulación ascendente de las citoquinas proinflamatorias, y la interrupción de la barrera alveolo-capilar se induce dentro de horas a días, dependiendo de la dosis de LPS utilizado. La recolección de muestras de sangre, el líquido BAL y la recolección pulmonar, así como el procesamiento para el análisis de FACS, se describen en detalle en el protocolo. Aunque el uso del LPS estéril no es adecuado para estudiar intervenciones farmacológicas en enfermedades infecciosas, el enfoque descrito ofrece una mínima invasividad, un manejo sencillo y una buena reproducibilidad para responder a preguntas inmunológicas mecanicistas. Además, la valoración de la dosis, así como el uso de preparaciones alternativas de LPS o cepas de ratón permiten la modulación de los efectos clínicos, que pueden exhibir diferentes grados de gravedad de la ALI o temprano frente a la aparición tardía de los síntomas de la enfermedad.

El enfoque descrito para inducir la ALI en ratones se validó mediante la evaluación de la expresión de citoquinas, la infiltración de granulocitos neutrófilos y la interrupción de la barrera alveolo-capilar 24 h y 72 h después de la instilación de LPS. Los animales inyectados por PBS sirvieron como control. La administración de LPS intratraqueal indujo una respuesta proinflamatoria pulmonar robusta. La expresión del TNF-o en el tejido pulmonar fue significativamente regulada, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 v...

Aquí se presenta un procedimiento paso a paso para inducir una lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacáridos intratraqueales y para realizar análisis FACS de muestras de sangre, líquido de lavado broncoalveolar y tejido pulmonar. La mínima invasividad, el manejo simple, la buena reproducibilidad y la valoración de la gravedad de la enfermedad son ventajas de este enfoque.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Los modelos animales fiables son componentes cruciales de la investigación básica. Nuestro enfoque murino permite responder preguntas inmunológicas sobre la mecanicismo y la cinética del desarrollo de lesiones pulmonares agudas en mamíferos. La mínima invasividad, el manejo sencillo, así como la buena reproducibilidad son las principales ventajas de esta técnica.Además, con la valoración de la dosis, podemos modular el efecto clínico. Esta técnica refleja la situación clínica de los pacientes con lesión pulmonar grave y permite investigar los mecanismos subyacentes. Almacene lipopolisacárido, o LPS, en alícuotas a una concentración de cinco miligramos por mililitro a menos 20 grados centígrados.Para la instilación intratraqueal, diluir el LPS descongelado en solución salina tamponada de fosfato estéril a una concentración final de 2.000 microgramos por mililitro. Corte un catéter venoso de calibre 22 a una longitud de 20 milímetros. Coloque el ratón en la posición propensa sobre una mesa de temperatura controlada para mantener una temperatura corporal de 37 grados centígrados.Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, aplicar lubricante oftálmico estéril para prevenir la desceración de las córneas bajo anestesia. Levante los incisivos de la cabeza y el gancho en una barra horizontal situada aproximadamente cinco centímetros por encima de la mesa, mientras que las sierras delanteras permanecen en estrecho contacto con la mesa. Súper extender el cuello en un ángulo de 90 grados en relación con la mesa.Coloque una fuente de luz fría sobre la piel por encima de la laringe para ayudar a visualizar las cuerdas vocales y apuntar a la tráquea. Sostenga la lengua con fórceps para enderezar la garganta para condiciones de intubación más fáciles. La visualización e identificación adecuadas de la laringe son fundamentales para asegurar la correcta colocación intratraqueal del catéter.Una fuente de luz fría externa ayuda en este paso. Inserte el catéter aproximadamente 10 milímetros en la tráquea. Asegúrese de que la inserción no es demasiado profunda, ya que esto resultará en una instilación unilateral de líquido en el bronquio principal derecho o izquierdo.Si se produce resistencia a la laringe, retraiga el catéter unos milímetros antes de volver a avanzar. Ahora, inyecte el MPBS diluido por LPS con una pipeta. El volumen inyectado depende del peso corporal del ratón.Conecte una jeringa y añada un bolo de 50 microlitros de aire para garantizar que el volumen completo del líquido se distribuya en los pulmones. Retire lentamente el catéter. Mantenga la parte superior del cuerpo del ratón en posición vertical durante 30 segundos para evitar la fuga del líquido de la tráquea.Fije el ratón eutanizado con cinta adhesiva en una mesa de operaciones y desinfecte el pelaje sobre el abdomen con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominal cuidadosamente en la línea mediana con tijeras y pinzas. Retirar partes del intestino para lograr el acceso a la vena cava inferior derecho a la columna vertebral en la aorta abdominal.Localice las venas renales e inserte una cánula doblada de calibre 23 conectada a una jeringa de un mililitro en la vena cava inferior, directamente debajo de la confluencia de las venas. Aspirar 250 microlitros de sangre y transferirlos a un tubo de 1,5 mililitros lleno de 20 microlitros de 0,5 molares de solución EDTA. Agitar suavemente para facilitar la mezcla de EDTA y poner el tubo sobre hielo.Para el lavado broncoalveolar, prepare tres jeringas de un mililitro, cada una con 0,5 mililitros de PBS estéril y 0,1 mililitros de aire. Desinfectar el pelaje de la garganta con 70%etanol y exponer cuidadosamente la tráquea con tijeras y pinzas. Moviliza la tráquea y envuelve una sutura alrededor de ella.Perfore la tráquea con microc tijeras e inserte un catéter venoso del calibre 22, cortado a una longitud de 20 milímetros. Fije el catéter con una sutura e instilo 0,5 mililitros de PBS estéril y 0,1 mililitro de aire. Aspirar el líquido después de 60 segundos.Repita el procedimiento con las dos jeringas adicionales y recoja todo el aspirado en un tubo de 15 mililitros sobre hielo. Abra cuidadosamente el tórax con tijeras y pinzas para cosechar los pulmones. Corte el diafragma a lo largo del margen costal y corte las costillas con dos incisiones laterales.Evite perforar cuidadosamente los pulmones. Levante el esternón y fíjelo o retírelo. Prepare dos jeringas de 10 mililitros con PBS caliente de 37 grados centígrados.Haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo. Perforar el ventrículo derecho con una cánula de calibre 26. Luego, enjuague la circulación pulmonar con un PBS precalecado.Tenga en cuenta que los pulmones se vuelven pálidos durante el procedimiento. Retire el lóbulo derecho de los pulmones y córtelo en mitades. Enganche en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados Celsius para una mayor expresión génica y análisis de proteínas.Retire todo el pulmón izquierdo y homogeneizarlo en una placa de 48 pozos picando el tejido con tijeras y pinzas. Incubar el tejido en dos mililitros de tampón de digestión a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Realizar una mayor homogeneización pipeteando cuidadosamente las piezas del tejido pulmonar hacia arriba y hacia abajo.Transfiera las muestras de sangre a tubos FACS de cinco mililitros y mezcle suavemente la sangre con dos mililitros de tampón de lelisis de glóbulos rojos. Ponga los tubos sobre hielo y termine la reacción después de dos minutos añadiendo dos mililitros de PBS helado. Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 400 g y deseche el sobrenadante.Resuspender el pellet celular con 60 microlitros de tampón FACS y proceso para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Centrifugar el líquido BAL durante cinco minutos a 400 veces g. Aspirar el sobrenadante y congelarlo en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados Celsius para un análisis de proteínas adicionales.Después de resuspender el pellet de la célula BAL con dos mililitros de tampón FACS frío, transfiera la suspensión a un tubo FACS de cinco mililitros utilizando un filtro de malla de 100 micras para sujetar los cabellos. Después de centrifugar la muestra de nuevo, resuspender el pellet con 60 microlitros de tampón FACS y procesar para la tinción FACS posterior de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Ahora, transfiera el tejido pulmonar izquierdo digerido a un tubo FACS de cinco mililitros usando un filtro de malla de 100 micras para extraer grumos.Termine el proceso de digestión añadiendo dos mililitros de tampón FACS helado antes de centrifugar la muestra durante cinco minutos a 400 veces g. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet con 60 microlitros de tampón FACS y procese para la posterior tinción FACS de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. Para un análisis FACS, agregue 20 microlitros de solución de bloqueo de anticuerpos CD16/CD32 a 60 microlitros de células en un tubo de cinco mililitros.Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 15 minutos para bloquear la unión inespecífica de inmunoglobulina a los receptores Fc. Mientras tanto, prepare una mezcla maestra con búfer FACS y anticuerpos, como se describe en el protocolo de texto. Después del bloqueo, no lave las células.Añadir 20 microlitros de mezcla maestra de anticuerpos por muestra para obtener un volumen final de 100 microlitros. Incubar las muestras durante 20 minutos, en la oscuridad, a cuatro grados centígrados. Lave cada muestra con un mililitro de tampón FACS y centrífuga como antes.Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet con tampón FACS a la concentración celular adecuada para las mediciones de FACS. Por último, agregue números fijos de perlas de calibración acopladas al fluorocromo disponibles comercialmente a cada muestra para determinar los números de celda absolutos. Realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición que se muestra en el protocolo de texto para células de sangre, BAL y tejidos.24, así como 72 horas después de la instilación intratraqueal, la expresión de TNF-alfa en el tejido pulmonar se reguló significativamente, alcanzando un aumento sostenido y más de 50 veces en comparación con los animales de control. La invasión de leucocitos en el tejido y el espacio alveolar es una característica y característica para el desarrollo de lesiones pulmonares agudas. El análisis del FACS reveló una infiltración significativa de granulocitos neutrófilos en el intersticio pulmonar, con un recuento celular absoluto que aumentó casi nueve veces en comparación con los controles después de 24 horas.El recuento absoluto de granulocitos neutrófilos disminuyó ligeramente después de 72 horas, sin embargo, el aumento del factor en comparación con los controles se mantuvo. En consonancia con la infiltración intersticial de granulocitos neutrófilos, la expresión de MMP-9 en todo el tejido pulmonar también se incrementó significativamente durante el período de observación total. Los granulocitos neutrófilos no sólo aumentaron en el tejido pulmonar, sino también en el líquido BAL.El aumento del pliegue en comparación con los animales de control fue más pronunciado que en el tejido pulmonar. El edema pulmonar debido a un deterioro grave de la barrera alveolocapillaria es patognomónico para el desarrollo de lesiones pulmonares agudas. El análisis del contenido de albúmina en fluido BAL por ELISA reveló una pérdida significativa de la función de barrera a las 24 horas y 72 horas después de la instilación de LPS.La colocación adecuada del catéter es crucial para la instilación bilateral de LPS. A menudo, los cambios en los patrones respiratorios, como toser o jadear, indican una instilación intratraqueal correcta del líquido. Después de la inducción de la lesión pulmonar aguda, se pueden realizar una serie de pasos posteriores, como el análisis FACS, la PCR, una detección de proteínas, para responder a las preguntas de investigación respectivas.

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Investigación

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Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.

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La presión de la ventilación controlada para inducir la lesión pulmonar aguda en ratones

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Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Se describe un método para inducir la inflamación pulmonar neutrofílica por desafío para el lipopolisacárido de aerosol por nebulización, para modelar la lesión pulmonar aguda. Además, también se describen técnicas quirúrgicas básicas para la separación de pulmón, la intubación traqueal y lavado broncoalveolar.

Un método para generar pulmonar Neutrofilia Usando aerosol lipopolisacárido

La instilación de reactivos intratraqueal mediada por intubación (IMIT) es un método excelente y no invasivo para estudiar las enfermedades respiratorias, así como un método para instilar reactivos terapéuticos directamente en el pulmón. Es un método rápido y altamente reproducible que es adecuado para pruebas preclínicas.

La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

La instilación selectiva de ácido intrabronal en el pulmón izquierdo en ratones da lugar a una lesión pulmonar aguda unilateral y autolimitada que modela el síndrome de dificultad respiratoria aguda humana (ARDS) inducido por la aspiración de ácido gástrico.

Un modelo de lesión pulmonar aguda autolimitada por la instilación unilateral de ácido intrabronal

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Aprende a inducir lesión pulmonar aguda en ratones mediante instilación intratraqueal de lipopolisacárido. Este modelo reproducible permite analizar muestras sanguíneas, lavado broncoalveolar y tejido pulmonar por citometría de flujo.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

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