Caracterización de transportadores de membranas por expresión heteróloga en E. coli y producción de vesículas de membrana

Resumen

Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Resumen

Se han desarrollado varios métodos para caracterizar funcionalmente a los nuevos transportadores de membranas. Las poliaminas son omnipresentes en todos los organismos, pero no se han identificado intercambiadores de poliamina en las plantas. Aquí, delineamos un método para caracterizar los antiportadores de poliamina utilizando vesículas de membrana generadas a partir de la lisis de Escherichia coli cells hetrólogamente expresando un antiportador vegetal. En primer lugar, expresamos heterologousamente AtBAT1 en una cepa de E. coli deficiente en transportadores de intercambio de poliamina y arginina. Las vesículas se produjeron utilizando una prensa francesa, purificadas por ultracentrifugación y utilizadas en un ensayo de filtración por membrana de sustratos etiquetados para demostrar la especificidad del sustrato del transportador. Estos ensayos demostraron que AtBAT1 es un transportador mediado por protones de arginina, ácido aminobutírico (GABA), putrescina y espermidina. La cepa mutante que se desarrolló para el ensayo de AtBAT1 puede ser útil para el análisis funcional de otras familias de intercambiadores de poliaminas vegetales y animales. También hipotetizamos que este enfoque se puede utilizar para caracterizar muchos otros tipos de antiportadores, siempre y cuando estas proteínas se puedan expresar en la membrana celular bacteriana. E. coli es un buen sistema para la caracterización de nuevos transportadores, ya que hay múltiples métodos que se pueden emplear para mutagenizar a los transportadores nativos.

Introducción

Las proteínas implicadas en el tráfico de metabolitos constituyen un nivel esencial de regulación fisiológica, pero la gran mayoría de los transportadores de membranas vegetales aún no se han caracterizado funcionalmente. Se han implementado varias estrategias para caracterizar las nuevas proteínas de transporte. La expresión hetróloga en organismos modelo como E. coli y células eucariotas como levaduras, ovocitos de Xenopus, células de mamíferos, células de insectos y células vegetales se han utilizado para determinar su actividad de transporte¹. Las células eucariotas son favorecidas por la expresión de proteínas eucariotas,....

Protocolo

1. Generación del Mutante Doble Knock Out de E. coli con Transducción P1

1. Obtenga las cepas mutantes de un solo knockout de E. coli, el Centro de Valores Genéticos de E. coli (http://cgsc.biology.yale.edu).
   NOTA: La cepa de la variedad de la variedad de la sr. Es resistente a la kanamicina²⁶ y la cepa de CadB es resistente a la tetraciclina^27.
2. Construir la cepa PotE/CadB de doble knockout (DKO) utilizando el protocolo de transducción P1

Resultados

Los pasos principales de este protocolo se resumen pictóricamente en la Figura 1. Brevemente, las células de E. coli deficientes en todos los intercambiadores de poliamina y la expresión de AtBAT1 son cultivadas, centrifugadas, lavadas con un tampón y sometidas a lisis celular utilizando una prensa francesa. La lisis tiende a producir vesículas que son en su mayoría de adentro hacia afuera y atrapan el tampón fuera de las células. Los desech.......

Discusión

En el presente estudio, delineamos un método para la caracterización de un antiportador expresando primero la proteína en E. coli y luego generando vesículas de membrana, de modo que la proteína expresada heterólogamente puede ser ensayada en un sistema libre de células. Además de los equipos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular, esta estrategia requiere el uso de una prensa francesa, una ultracentrífuga y el acceso a una instalación para llevar a cabo ensayos de radioisótopo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescina	PerkinElmer	NET185001MC
3H-espermidina	PerkinElmer	NET522001MC
4-cloro-1-naftol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginina	Moravek Inc.	MC137
Arginina	Sigma-Aldrich	A-5006
Anticuerpo anti-His (C-term)-HRP	ThermoFisher	R931-25	Detecta la etiqueta de polihistidina C-terminal (6xHis), requiere el grupo carboxilo libre para la detección
Arabinosa	Sigma-Aldrich	A3256
Kit de ensayo de proteínas BCA	ThermoFisher	23227	Pierce Ensayo de proteínas BCA botiquín.
Azul de bromofenol	Bio-Rad	161-0404
Carboxipeptidasa B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrífuga	Sorvall		SS-34 rotor de ángulo fijo y rotor de ángulo fijo GA-6
Molinillo de tejidos Dounce	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 Homogeneizador pyrex con boquilla de vertido.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	cóctel de centelleo
EDTA	Sigma-Aldrich
Colector de filtración	Hoefer	FH225V
Célula de presión francesa	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamato	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Peróxido de hidrógeno	KROGER
Cloruro de potasio	J.T. Baker	3040-01
Contador de centelleo líquido	Beckman	LS-6500
Maleato	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Filtros de membrana de nitrocelulosa	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µ M
Kit de limpieza PCR	Genscript		QuickClean II
Fosfato de potasio dibásico	ThermoFisher	P290-500
putrescina	fluka	32810
Fosfato de potasio monobásico	J.T.Baker	4008
Espermidina	Sigma-aldrich	S2501
Cepas :E. coli y Delta; potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10	Este manuscrito	está disponible bajo petición.	La deformación es deficiente en los intercambiadores de poliaminas PotE y CadB.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrífuga	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT rotor de ángulo fijo Tubos de
ultracentrífuga	ThermoFisher	45237	Tubos de centrífuga para rotor S150-AT
Vector: pBAD-DEST49 Vector de	ThermoFisher		Gateway para E. coli

expresión de