Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.
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Artículo de método
Aislamiento de subconjuntos de macrófagos y células estromas de especímenes miocárgonos humanos y de ratón
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Resumen
Resumen
Los macrófagos representan las poblaciones de células inmunitarias más heterogéneas y abundantes del corazón y son fundamentales para impulsar la inflamación y las respuestas reparadoras después de una lesión cardíaca. Cómo varios subconjuntos de macrófagos orquestan las respuestas inmunitarias después de una lesión cardíaca es un área activa de investigación. Aquí se presenta un protocolo simple que nuestro laboratorio realiza de forma rutinaria, para la extracción de macrófagos de muestras de ratón y miocardio humano obtenidas de individuos sanos y enfermos. Brevemente, este protocolo implica la digestión enzimática del tejido cardíaco para generar una suspensión de una sola célula, seguida de la tinción de anticuerpos, y la citometría de flujo. Esta técnica es adecuada para ensayos funcionales realizados en células clasificadas, así como secuenciación de ARN a granel y de una sola célula. Una de las principales ventajas de este protocolo es su simplicidad, mínima variación diaria y amplia aplicabilidad que permite investigar la heterogeneidad de los macrófagos en varios modelos de ratón y entidades de enfermedades humanas.
Introducción
Los macrófagos representan el tipo de células inmunitarias más abundante en el corazón, y desempeñan un papel importante en la generación de respuestas inflamatorias y reparativas robustas después de una lesión cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nuestro grupo identificaba dos subconjuntos principales de macrófagos en el corazón murino derivados de orígenes de desarrollo distintos5,6. En términos generales, se pueden identificar poblaciones distintas de subconjuntos de macrófagos cardíac....
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Protocolo
El protocolo presentado ha sido aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Institutional Review Board (#201305086). Todos los sujetos proporcionan consentimiento informado antes de la recolección de muestras y los experimentos se realizan de acuerdo con el protocolo de estudio aprobado. El protocolo presentado se realiza con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y sigue las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de especímenes de tejido cardíaco humano
- Enjuague los cor....
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Resultados
El protocolo descrito permite el aislamiento de macrófagos del ratón y el miocardio humano. Usando el mismo protocolo, pero con una estrategia diferente de tinción y gating, las células estromales también se pueden cosechar del miocardio humano. Los resultados de FACS presentados aquí se adquirieron en la plataforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. Se generaron controles de compensación a partir de muestras de control de color único a partir de splenocitos manchados. La F.......
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Discusión
El protocolo permite la extracción de varios subconjuntos de macrófagos del miocardio humano. El protocolo es simple y tarda de 3 a 4 horas en preparar la suspensión de una sola célula lista para el análisis facS. Aunque el protocolo es relativamente fácil de realizar, hay ciertos aspectos técnicos que deben ser considerados que minimizarán la variabilidad. En primer lugar, trabajar de manera oportuna con tejido humano es necesario para una óptima viabilidad celular. Es importante mantener el tejido en salina fría/ HBSS .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue posible gracias a la financiación del Children's Discovery Institute de la Universidad de Washington y del St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), la Fundación del Hospital Judío Barnes (8038-88) y la NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. cuenta con el apoyo de NIH K08 HL123519 y Burroughs Welcome Fund (1014782).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 mL Tubos Conocales | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µ m Filtros de celdas | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Tubos cónicos | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Tampón de lisis | Gibco | A10492-01 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2058 | |
| Colagenasa 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0,5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Tampón | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g Tampón | ||
| BSA FACS | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0,5 M) | ||
| Fetal Suero bovino | Pinza de A3840201 | ||
| VWR | 82027-406 | ||
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostáticos | VWR | 63042-052 | |
| Hialuronidasa tipo 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Placas de Petri | Thermo Fisher | ||
| Hoja de afeitar | VWR | 55411-050 | |
| Tijeras | VWR | 82027-578 |
Referencias
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814(2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electr....
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Reimpresiones y permisos
