Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Resumen

Aquí, presentamos protocolos de procesamiento detallados para la toma de imágenes de muestras de tejido delicadas utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). Tres métodos de procesamiento diferentes, a saber, el secado químico de hexametil disilazana (HMDS), el secado simple al aire y el secado de puntocrítico se describen para preparar cáscaras de huevo rígidas, embriones en etapas tempranas del desarrollo y cultivos de hongos, respectivamente.

Resumen

Aunque la microscopía electrónica de barrido (SEM) está siendo ampliamente utilizada para el análisis ultraestructural de diversas muestras biológicas y no biológicas, los métodos involucrados en el procesamiento de diferentes muestras biológicas implican prácticas únicas. Todas las prácticas convencionales descritas en la literatura para el procesamiento de muestras todavía encuentran aplicaciones útiles, pero los cambios sutiles en la preparación de la muestra pueden alterar la calidad de la imagen, así como, introducir artefactos. Por lo tanto, se requiere el uso de una técnica única de preparación de muestras específica para el tipo de tejido analizado para obtener una imagen de buena calidad con resolución ultraestructural. El enfoque de este estudio es proporcionar los protocolos óptimos de preparación de muestras para la toma de imágenes embriones, cáscaras de huevo rígidas y cultivos de hongos utilizando SEM. Se recomendaron las siguientes optimizaciones para obtener buenos resultados para las tres muestras biológicas delicadas diferentes estudiadas. El uso de fijadores más suaves como 4% paraformaldehído o 3% glutaraldehído seguido de deshidratación con series de etanol es obligatorio. El micelio fúngico en bloques de agar obtenidos por cultivos de diapositivas produce una mejor integridad ultraestructural en comparación con los cultivos tomados directamente de placas de agar. El secado químico de embriones con HMDS proporciona secado sin introducir artefactos de tensión superficial en comparación con el secado de punto crítico. HMDS previene el agrietamiento causado por la contracción, ya que las muestras son menos frágiles durante el secado. Sin embargo, para el cultivo de hongos, el secado de puntocrítico proporciona una calidad de imagen aceptable en comparación con el secado químico. Las cáscaras de huevo se pueden crear imágenes sin pasos de preparación especiales, excepto para el lavado a fondo y el secado al aire antes del montaje. Las metodologías de preparación se estandarizaron en función de la calidad de imagen aceptable obtenida con cada ensayo.

Introducción

El análisis ultraestructural del microscopio electrónico de barrido (SEM) y la imagen intracelular complementan la microscopía de luz para el perfilado tridimensional de prokaryotes, plantas y animales. La alta resolución espacial de un SEM lo convierte en una de las técnicas más versátiles y potentes disponibles para el examen de las características microestructurales de las muestras a escala de nanómetro a micrómetro. Los especímenes desecados se resuelven en estructuras compositivas y topográficas con detalles intensos, lo que proporciona la base para el desarrollo de conclusiones válidas sobre las relaciones funcionales^1,

Protocolo

NOTA: Los huevos de tortuga pintada (Chrysemys picta) utilizados en este estudio fueron recogidos durante la temporada de anidación de mayo a junio de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York con permiso obtenido del Departamento de Medio Ambiente del Estado de Nueva York Conservación (DEC).

1. Método de secado químico para procesar embriones para SEM

1. Recoger huevos de tortuga de sitios de campo durante la temporada de anidación. Preparar las cámaras de incubación con antelación, hechas de cajas de plástico con tapas (L x An x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm llenas de medio de cama preparado con una mezcla húmed....

Resultados

La Figura 1 muestra el análisis micrográfico de electrones de barrido de embriones de tortuga pintada (Chrysemys picta). Se utilizaron huevos de tortuga pintados recogidos e incubados en un medio de cama, montados en talones de aluminio después del secado químico para imágenes SEM (Figura1A-E). Una vista lateral de un embrión en la etapa 12 muestra las estructuras craneofaciales; prominencia maxilar se extiende más allá de la mandibula.......

Discusión

En nuestro estudio, se probaron diferentes agentes de fijación, métodos de deshidratación y secado para preparar tres muestras biológicas delicadas diferentes para la toma de imágenes SEM: embriones, cáscaras de huevo y cultivos de hongos. El SEM se utiliza comúnmente para el análisis de superficie, por lo que la penetración fijativa es menos preocupante, pero debe entenderse que las estructuras internas mal fijas causarán una contracción interna o/y estructuras superficiales colapsadas. También se debe considerar un tie.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Fischer Scientific	S25127A	para cultivos de portaobjetos
Trozo de alfiler de aluminio	Tedpella	16111	12,7 mm x 8 mm
BD Difco Medios de cultivo deshidratados: Agar patata dextrosa	BD 213400	DF0013-17-6	Medios para el aislamiento y cultivo de hongos, levaduras y mohos
Cloranfenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiótico para medios de comunicación
Vermiculita gruesa	invernadero Megastore	SO-VER-12	cama mediana
Transparente placa de 12 pocillos	Corning	07-201-589	para la fijación de embriones
cubreobjetos	Fischer Scientific	S17525B	para el cultivo de portaobjetos
Secador de punto crítico	Quorum CPD	EMS850	Secado de punto crítico
Platos de cultivo	Fischer Scientific	08 747B	PLATO PETRI 100X10MM 12/PK
Etanol	Fischer Scientific	A406P 4	agente de deshidratación
Pinzas - Aquarius Pinzas	Tedpella	5804	estilo 4, longitud 108 mm, ancho x espesor 0,017 x 0,17 mm
Glutaraldehído	Fischer Scientific	G151-1	fijador
Objetivo de oro para recubridor de pulverización catódica	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Objetivo de oro, 2.375 y Prime; D X .002 y primo;
Hexametildisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	agente de secado químico
Kim wipes	Kimtech	S-8115	limpieza
Portaobjetos de microscopio	Thermo Scientific	67-762-16	para cultivo de portaobjetos
Tijeras de microscopía	Tedpella	1327	Doble punta, acero inoxidable, 100 mm L (3-5/8").
Microtijeras	Tedpella	1346	Tipo Vannas, recta, 80 mm
L Moria Cuchara de embrión perforada	Fine Science Tools	10370-17	Longitud 14,5 cm, diámetro de la punta 20 mm, profundidad de la cuchara 5 mm
Insertos Netwell	Corning	0330B09	15 mm Insertos con 74 µ m Tamaño de malla La membrana de poliéster actúa como prácticos portadores durante el procesamiento de muestras en diferentes solventes
Paraformaldehído	Fischer Scientific	T353 500	fijador
Musgo de turba	Walmart- Miracle Gro	551705263	medio de cama
PELCO tabs cinta conductora de carbono de doble adherencia	Tedpella	5000	12 mm de diámetro exterior
Recubrimiento por pulverización catódica	DENTON	VACUUM DESK V	revestimiento metálico fino
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV microscopía electrónica de barrido