Aquí presentamos un protocolo de disociación mecánica para aislar rápidamente los macrófagos del ganglio de la raíz dorsal para el fenotipado y el análisis funcional.
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Artículo de método
Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal
En este artículo
Resumen
Resumen
Hay intereses crecientes para estudiar las interacciones moleculares y celulares entre las células inmunitarias y las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal después de la lesión del nervio periférico. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos, responden a una lesión tisular a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. La evidencia emergente ha implicado la contribución de los macrófagos de los ganglios de raíz dorsal al desarrollo del dolor neuropático y la reparación axonal en el contexto de la lesión nerviosa. Se desea fenoticante rápidamente (o "aislamiento rápido de") la respuesta de los macrófagos de ganglios de raíz dorsal en el contexto de una lesión nerviosa para identificar los factores neuroinmunes desconocidos. Aquí demostramos cómo nuestro laboratorio aísla rápida y eficazmente los macrófagos de los ganglios de la raíz dorsal utilizando un protocolo de disociación mecánica libre de enzimas. Las muestras se mantienen en hielo para limitar el estrés celular. Este protocolo consume mucho menos tiempo en comparación con el protocolo enzimático estándar y se ha utilizado rutinariamente para nuestro análisis de clasificación de células activado por fluorescencia.
Introducción
Ahora hay evidencia considerable de que las células inmunitarias contribuyen al dolor neuropático después de la lesión del nervio periférico1,2. Se sabe que las células monocíticas periféricas, incluidos los macrófagos maduros, responden a lesiones tisulares e infecciones sistémicas a través de la fagocitosis, la presentación de antígenos y la liberación de citoquinas. Paralelamente a la activación de microglia inducida por una lesión nerviosa en el cuerno dorsal espinal, los macrófagos en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) también se expanden significativamente después de la lesión nerviosa
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Recoger DRG lumbar de ratones experimentales
- Antes de iniciar el experimento, prepare la solución de trabajo del medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Percoll) mezclando 9 volúmenes del medio con 1 volumen de Ca++/Mg++-libre 10x HBSS. Mantenlo en hielo.
- Anestetiza el ratón con 2.5% Avertin. Confirme que el animal está completamente anest....
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Resultados
Para validar las células aisladas, primero elegimos los ratones transgénicos Depoptosis Inducida por Macrófagos (MAFIA)17. Esta línea expresa un gen de fusión suicida FK506 inducible (FKBP)-Fas y proteína fluorescente verde (eGFP) bajo el control del promotor del receptor CSF1 (CSF1R), que se expresa específicamente tanto en macrófagos como en microglia. La inyección sistémica de dimerizador de proteínas de unión a FK, AP20187 (AP), induce la apoptosis de las células que expresan el transgén. La e.......
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Discusión
Aquí introducimos un nuevo método para enriquecer eficazmente los macrófagos aislados del DRG de ratón. El enfoque convencional para aislar las células inmunitarias DRG requiere digestión enzimática15,18, que ahora se sustituye por la homogeneización mecánica en nuestro protocolo para limitar el daño celular no deseado y aumentar el rendimiento. Por lo tanto, el nuevo protocolo consume mucho menos tiempo. Más importante aún, la digestión enzimática podría estimul.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros en competencia relacionados con este manuscrito.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado por: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); el Departamento de Anestesia y Cuidado Perioperatorio (XY) de la UCSF; y 1R01NS100801-01(GZ). Este estudio fue apoyado en parte por HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility a través de una subvención del NIH (P30CA082103).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-anticuerpo CX3CR1-APC de ratón | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Filtro de células (70 mm nylon) | Centrífuga Falcon | 352350 | |
| Eppendorf | 5810R Homogeneizador | ||
| de tejidos Dounce | Wheaton | 357538 ( 1 ml) | |
| Tubos FACS (5 ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Tijera de resorte Noyes | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Yoduro de propidio | Sigma | P4864-10ml |
Referencias
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature....
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