Cuantificación de la dinámica de la red de interacción de proteínas mediante coinmunoprecipitación multiplexada

Summary

La inmunoprecipitación por multiplex (QMI) cuantitativa utiliza citometría de flujo para la detección sensible de diferencias en la abundancia de interacciones proteínas y proteínas dirigidas entre dos muestras. QMI se puede realizar utilizando una pequeña cantidad de biomaterial, no requiere etiquetas genéticamente diseñadas y se puede adaptar para cualquier red de interacción de proteínas previamente definida.

Abstract

Las interacciones dinámicas proteínas y proteínas controlan el comportamiento celular, desde la motilidad hasta la replicación del ADN y la transducción de la señal. Sin embargo, monitorear las interacciones dinámicas entre múltiples proteínas en una red de interacción proteica es técnicamente difícil. Aquí, presentamos un protocolo para la Inmunoprecipitación Cuantitativa múltiple (QMI), que permite la evaluación cuantitativa de los cambios de pliegue en las interacciones proteicas basadas en mediciones relativas de fluorescencia de Proteínas en Complejos Compartidos detectadas por Exposed Epítopos superficiales (PiSCES). En el QMI, los complejos proteicos de los lysaatos celulares se inmunoprecipitan en las microesferas y luego sondean con un anticuerpo etiquetado para una proteína diferente con el fin de cuantificar la abundancia de PiSCES. Los anticuerpos de inmunoprecipitación se conjugan en diferentes regiones espectrales de MagBead, lo que permite que un citómetro de flujo diferencie múltiples inmunoprecipitaciones paralelas y cuantifique simultáneamente la cantidad de anticuerpo de sonda asociado con cada una. QMI no requiere etiquetado genético y se puede realizar utilizando biomaterial mínimo en comparación con otros métodos de inmunoprecipitación. QMI se puede adaptar para cualquier grupo definido de proteínas que interactúan, y hasta ahora se ha utilizado para caracterizar las redes de señalización en las células T y las sinapsis de glutamato neuronal. Los resultados han dado lugar a una nueva generación de hipótesis con posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Este protocolo incluye instrucciones para realizar QMI, desde la selección inicial del panel de anticuerpos hasta la ejecución de ensayos y el análisis de datos. El montaje inicial de un ensayo QMI implica la detección de anticuerpos para generar un panel y determinar empíricamente un búfer de lisis adecuado. La preparación posterior de reactivos incluye el acoplamiento covalente de anticuerpos de inmunoprecipitación a MagBeads, y anticuerpos de sonda biotinylantes para que puedan ser etiquetados por un fluoróforo conjugado con estreptavidina. Para ejecutar el ensayo, el islato se mezcla con MagBeads durante la noche, y luego las cuentas se dividen e incuban con diferentes anticuerpos de sonda, y luego una etiqueta de fluoróforo, y se lee por citometría de flujo. Se realizan dos pruebas estadísticas para identificar PiSCES que difieren significativamente entre las condiciones experimentales, y los resultados se visualizan mediante mapas de calor o diagramas de borde de nodo.

Introduction

Las interacciones dinámicas proteína-proteína constituyen las cascadas de señalización molecular y las estructuras móviles que son la base funcional de la mayoría de la fisiología celular¹. Estos procesos a menudo se representan como vías de señalización lineal que cambian entre estados estables basados en entradas individuales, pero los datos experimentales y de modelado muestran claramente que funcionan como redes integradas^{2,3, 4}. En el caso de las proteínas G, diferentes receptores a menudo tienen la capacidad de activar la misma proteína G, y un ....

Protocol

1. Diseño de ensayos

1. Preparación de anticuerpos candidatos
   1. Para cada proteína de interés, elija de 3 a 5 anticuerpos para examinar. Cuando sea posible, utilice anticuerpos monoclonales que reconozcan diferentes epítopos. También incluya un anticuerpo de control no específico.
   2. Para eliminar Tris, realice el intercambio de búferes agregando el anticuerpo a un filtro de giro de 30 kDa, girando hacia abajo a su volumen mínimo, agregando 500 salinas con búfer de fosfato (PBS) y repitiendo 3 veces. Para eliminar las proteínas portadoras, realice la purificación de anticuerpos de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de Mater....

Results

Detección de anticuerpos
Figura 2 B muestra los resultados de una pantalla para la proteína Connexin36. La mayoría de las combinaciones IP_probe no producen ninguna señal sobre los controles IgG. La IP con el anticuerpo monoclonal 1E5 y la sonda con 1E5 o el anticuerpo policlonal 6200 produce un cambio hacia la derecha en la distribución del cordón en comparación con los controles IgG. Aquí, IP 1E5 y la sonda 6200poly fueron seleccionados para evitar el u.......

Discussion

El ensayo QMI requiere una inversión sustancial en el desarrollo de paneles de anticuerpos, equipos y reactivos, pero una vez establecido el ensayo, se pueden recopilar datos de alta dimensión observando redes de interacción de proteínas a medida que responden a las Estímulos. Técnicamente, QMI requiere un cuidadoso pipeteo y seguimiento de las ubicaciones de pozos de muestras y anticuerpos. Etiquetar cuidadosamente las placas de ensayo es útil, al igual que hacer una plantilla detallada de las ubicaciones de pozos en pa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de fondo plano de 96 pocillos	Bio Rad	171025001
Placas de PCR de 96 pocillos	VWR	82006-704
Sistema Bioplex 200 con HTF	Bio Rad	171000205	modificado para mantener parcialmente refrigerado, consulte la Figura S1 para obtener más información
Estación de lavado Bio-Plex Pro Bio	Rad	30034376
BSA	Sigma
Perlas CML	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxx es la región de perlas de 3 dígitos
Melon Gel IgG Spin Purification Kit	Thermo Scientific	45206	utilizada para la purificación
MES	Sigma	M3671
Película de microplaca, no estéril	USA Scientific	2920-0000
Cóctel de inhibidores de fosfatasa #2	Sigma	P5726
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma	P8340
Refrigerador de preparación de sándwiches	Norlake	SMP 36 15	para refrigeración personalizada de Bioplex 200
Sodio fluoruro	Sigma	201154
ortovanadato de sodio	Sigma 450243
estreptavidina-PE	BioLegend	405204
Sulfo NHS	Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152