Estudio de la remodelación inversa del ventrículo izquierdo por desbanding aórtico en roedores

La constricción de la aorta transversal o ascendente en el ratón es un modelo experimental ampliamente utilizado para la hipertrofia cardíaca inducida por sobrecarga de presión, la disfunción diastólica y sistólica y la insuficiencia cardíaca^1,2,3,4. La constricción aórtica conduce inicialmente a una hipertrofia concéntrica compensada del ventrículo izquierdo (VI) para normalizar el estrés de la pared^1. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, como la sobrecarga cardíaca prolongada, esta hipertrofia es insuficiente para disminuir el estrés de la pared, desencadenando disfunción diastólica y sistólica (hipertrofia patológica)^5. En paralelo, los cambios en la matriz extracelular (MECE) conducen a la deposición de colágeno y reticulado en un proceso conocido como fibrosis, que se puede subdividir en fibrosis de reemplazo y fibrosis reactiva. La fibrosis es, en la mayoría de los casos, irreversible y compromete la recuperación miocárdica después del alivio de la sobrecarga^6,7. Sin embargo, estudios recientes de resonancia magnética cardíaca revelaron que la fibrosis reactiva es capaz de retroceder a largo plazo⁸. En conjunto, la fibrosis, la hipertrofia y la disfunción cardíaca son parte de un proceso conocido como remodelación miocárdica que progresa rápidamente hacia la insuficiencia cardíaca (IC).

La comprensión de las características de la remodelación miocárdica se ha convertido en un objetivo importante para limitar o revertir su progresión, esta última conocida como remodelación inversa (RR). El término RR incluye cualquier alteración miocárdica crónicamente revertida por una intervención dada, como la terapia farmacológica (p. ej., medicación antihipertensiva), la cirugía valvular (p. ej., estenosis aórtica) o los dispositivos de asistencia ventricular (p. ej., IC crónica). Sin embargo, el RR es a menudo incompleto debido a la hipertrofia predominante o a la disfunción sistólica/diastólica. Así, la clarificación de los mecanismos subyacentes del RR y de las estrategias terapéuticas nuevas todavía falta, que es sobre todo debido a la imposibilidad de acceder y de estudiar el tejido del miocardio humano durante rr en la mayor parte de estos pacientes.

Para superar esta limitación, los modelos de roedores han desempeñado un papel importante en el avance de nuestra comprensión de las vías de señalización involucradas en la progresión de la IC. En concreto, la desbandización aórtica de ratones con constricción aórtica representa un modelo útil para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la remodelación adversa del VI⁹ y RR^10,11 ya que permite la recogida de muestras miocárdicas en diferentes momentos de estas dos fases. Además, proporciona un excelente entorno experimental para probar posibles objetivos novedosos que pueden promover /acelerar rr. Por ejemplo, en el contexto de la estenosis aórtica, este modelo podría proporcionar información sobre los mecanismos moleculares involucrados en la gran diversidad de la respuesta miocárdica subyacente a la (in)integridad del RR^6,12,así como, el momento óptimo para el reemplazo valvular, lo que representa una deficiencia importante del conocimiento actual. De hecho, el momento óptimo para esta intervención es objeto de debate, principalmente porque se define en función de la magnitud de los gradientes aórticos. Varios estudios defienden que este punto de tiempo podría ser demasiado tarde para la recuperación miocárdica, ya que la fibrosis y la disfunción diastólica a menudo ya están presentes¹².

A nuestro conocimiento, éste es el único modelo animal que recapitula el proceso de la remodelación del miocardio y del RR que ocurre en condiciones tales como estenosis aórtica o hipertensión antes y después del reemplazo de la válvula o el inicio de la medicación antihipertensiva, respectivamente.

Buscando abordar los desafíos resumidos anteriormente, describimos un modelo animal quirúrgico que se puede implementar tanto en ratones como en ratas, abordando las diferencias entre estas dos especies. Describimos los principales pasos y detalles involucrados en la realización de estas cirugías. Finalmente, relatamos los cambios más significativos que ocurrieron en el VI inmediatamente antes y a lo largo del RR.

Todos los experimentos con animales cumplen con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicación de los NIH nº 85-23, revisada en 2011) y la ley portuguesa sobre bienestar animal (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Las autoridades locales competentes aprobaron este protocolo experimental (018833). Los ratones machos C57B1/J6 de siete semanas de edad se mantuvieron en jaulas apropiadas, con un ambiente regular de ciclo claro-oscuro de 12/12 h, una temperatura de 22 °C y un 60% de humedad con acceso al agua y una dieta estándar ad libitum.

1. Preparación del campo quirúrgico

1. Desinfecte el sitio de la operación con un 70% de alcohol y coloque una cubierta de mesa de quirófano desechable sobre el área quirúrgica.
2. Esterilice todos los instrumentos antes de la cirugía.
   NOTA: Este procedimiento requiere tijeras micro quirúrgicas, 2 fórceps curvos finos, 3 fórceps rectos finos, un bisturí, pequeños fórceps, una tijera disectora en ángulo, un soporte de aguja, una ayuda de ligadura ultrafina, 2 hemóstatos y, por último, un sistema de retracción fijador magnético es muy recomendable (Figura 1A).
3. Curva la punta de una aguja embotada de 26 G a 90° para un acercamiento más fácil a la aorta. Una aguja de 26 G creará un estrechamiento aórtico de 0,45 mm de diámetro (Figura 1B).
4. Ajuste la temperatura de la almohadilla térmica a 37 ± 0,1 °C.

2. Preparación e intubación de ratones

1. Anestesiar ratones jóvenes C57B1/J6 (20-25 g) por inhalación de sevoflurano al 8% con 0,5 - 1,0 L/min 100%_O2 en un tubo cónico.
2. Compruebe la profundidad de la anestesia usando el reflejo de abstinencia del pellizco del dedo deldo deldo deldo del sistema.
3. Coloque el ratón en la reclinación dorsal en una placa inclinada y proceda a la intubación orotraqueal.
4. Mueva el ratón a la almohadilla térmica y conecte rápidamente el tubo orotraqueal al ventilador para iniciar la ventilación mecánica.
5. Ajuste los parámetros del ventilador a una frecuencia de 160 respiraciones/min y un volumen corriente de 10 mL/kg.

3. Preparación para la cirugía (tanto para cirugías de anillamiento como de desbandificación)

1. Afeitarse y aplicar la crema depilatoria desde el escote hasta la mitad del pecho de los ratones.
2. Aplique gel oftálmico en los ojos de los animales para evitar que se seque la córnea.
3. Coloque una sonda rectal y el oxímetro en la pata o la cola para controlar la temperatura y la oxigenación de la sangre, y la frecuencia cardíaca, respectivamente.
   NOTA: La anestesia induce hipotermia significativa, por lo tanto, es importante mantener la temperatura corporal normal durante la cirugía para evitar una rápida disminución de la frecuencia cardíaca.
4. Mantener la anestesia con sevoflurano (2.0 - 3.0%). Compruebe el nivel correcto de anestesia por la falta del reflejo de dedo del dedo deldo deldo del usuario.
5. Coloque los ratones en decúbito lateral derecho sobre una almohadilla térmica y asegure las extremidades al sistema de retracción del fijador magnético con una cinta adhesiva para mantener al animal en la posición correcta durante la cirugía(Figura 2, Figura 3A).
6. Desinfecte el pecho del ratón con alcohol al 70% seguido de una solución de providona yodada.

4. Cirugía de bandas aórticas ascendentes

NOTA: Para una descripción detallada del protocolo, consulte ^2,3,4,13.

1. Con una cuchilla desechable, realice una pequeña (~ 0.5 cm) incisión en la piel en el lado izquierdo inmediatamente debajo del nivel de axila y diseccione la piel.
2. Diseccione y separe suavemente el músculo pectoral y otras capas musculares hasta que las costillas se vuelvan visibles. Use pórceps finos y evite cortar el músculo.
3. Bajo un microscopio, identifique los espacios intercostales y abra una pequeña incisión entre el^2º y^3º espacio intercostal con pórceps finos.
4. Retraer las costillas colocando el retractor torácico (Figura 2A).
5. Use pequeños fórceps para diseccionar suavemente y separar los lóbulos tímicos hasta que la aorta ascendente se vuelva visible.
   NOTA: Los aplicadores de algodón deben ser útiles en caso de sangrado. La solución salina estéril caliente debe administrarse por vía subcutánea en caso de sangrado significativo (por ejemplo, la arteria mamaria).
6. Use pequeños pórceps para diseccionar suavemente la aorta.
   NOTA: Se considera que la aorta está diseccionada cuando no hay grasa u otras adherencias a su alrededor y es posible rodear fácilmente el vaso con una pequeña curva de fórceps.
7. Después de la disección aórtica, coloque una ligadura de polipropileno 7-0 alrededor de la aorta mediante el uso de ayuda de ligadura y fórceps curvos(Figura 2B).
8. Coloque la aguja embotada de 26 G paralela a la aorta (punta apuntando hacia la cabeza de los ratones) (Figura 2B). Para los ratones que pesan 20-25 g, esta aguja induce una constricción aórtica reproducible del 65-70%.
9. Hacer 2 nudos sueltos alrededor de la aorta y la aguja de 26 G con la ayuda de 2 fórceps (Figura 2B).
10. Apriete el^1º nudo y, rápidamente después, el^2º nudo. Confirme brevemente el posicionamiento correcto de la constricción y retire rápidamente la aguja para restaurar el flujo sanguíneo aórtico. Finalmente, haz un nudo^{3 rd} (grupo BA).
11. Reposicionar el timo y los músculos en su posición inicial.
12. Realice el procedimiento simulado idéntico al procedimiento de constricción, pero manteniendo la sutura suelta alrededor de la aorta (grupo SHAM).
13. Cortar los extremos de la sutura y retirar el retractor torácico.
    NOTA: Los extremos cortos de la sutura pueden aumentar la probabilidad de que los nudos se aflojen con la presión aórtica, mientras que los extremos largos hacen que el procedimiento de desbanding sea más riesgoso ya que pueden producirse adherencias entre la sutura y la aurícula izquierda.
14. Cierre la pared torácica usando la sutura de polipropileno 6-0 con una simple sutura interrumpida o continua utilizando el menor número posible de puntos de sutura. Apriete el último nudo torácico con los pulmones inflados al final de la inspiración al pellizcar la salida del ventilador durante 2s para volver a inflar los pulmones.
15. Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continua.
    NOTAS: Si se utiliza un ventilador más reciente, es posible programarlo para que se detenga en inspiración (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)

5. Atención postoperatoria

1. Aplique la solución de providona-yodo en el sitio de la sutura de la piel.
2. Para una analgesia adecuada, administrar buprenorfina por vía subcutánea 0,1 mg/kg, dos veces al día, hasta que el animal se recupere por completo (generalmente 2-3 días después de la cirugía).
3. Inyecte solución salina estéril por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación en caso de sangrado significativo durante la cirugía.
4. Apague la anestesia (sin desintubar el ratón) y espere hasta que el animal recupere los reflejos (los movimientos de los bigotes son una señal de despertar) y comience a respirar espontáneamente.
5. Retire la cánula traqueal.
6. Dejar que el animal se recupere en una incubadora a 37 °C.
7. Devuelva al animal a una sala de ciclo claro/oscuro de 12 h después de la recuperación completa.

6. Cirugía de desbanding aórtico

1. Siete semanas más adelante, realice la desbanding de la aorta por la mitad de los animales del BA y quite la sutura floja de la mitad de los ratones del IMPOSTOR, dando lugar a 2 nuevos grupos -- debanding (DEB) y debanding SHAMA (DESHAM), respectivamente. DESHAM representa el control para el grupo DEB (Figura 4).
2. Repita todos los pasos 2.1 a 3.6 mencionados anteriormente.
3. Diseccione suavemente los tejidos, las adherencias y la fibrosis alrededor de la aorta hasta que su constricción se haga visible.
4. Diseccione cuidadosamente la aorta y separe la sutura de la aorta. Corte la sutura con tijeras de resorte angulosas de una sonda (Figura 3B).
5. Cierre la pared torácica usando 6-0 sutura de polipropileno con una simple sutura interrumpida o continua usando el mínimo número de puntos de sutura posibles.
   NOTA: Trate de apretar la última sutura torácica cuando los pulmones estén inflados para evitar el neumotórax.
6. Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continua.
7. Realice todos los procedimientos de atención postoperatoria como se menciona en 5.
8. Sacrificar los animales 2 semanas después.

7. Ecocardiografía para evaluar la función cardíaca y la hipertrofia ventricular izquierda in vivo

1. Realizar el examen ecocardiográfico cada 2-3 semanas para seguir la progresión de la hipertrofia y la función cardíaca.
2. Anestesiar a los animales, como se describe, por inhalación de sevoflurano al 5% con un cono de la nariz. Ajustar el nivel de anestesia disminuyándolo a 2.5%.
3. Afeitarse y aplicar la crema depilatoria desde el escote hasta la mitad del pecho.
4. Coloque el animal en una almohadilla térmica y coloque los electrodos de ECG. Asegure un buen rastro de ECG y mantenga el ritmo cardíaco entre 300 y 350 latidos/min.
5. Controle la temperatura (~ 37 °C).
6. Aplique el gel de eco y coloque al animal en el decúbito lateral izquierdo.
7. Inicie el ecocardiógrafo y ajuste la configuración.
8. Coloque una sonda de ultrasonido sobre el tórax.
9. Evaluar el gradiente de presión a través de las bandas a las 7 y 2 semanas después de la cirugía de bandas y desbandificación, respectivamente. Coloque la sonda en el eje largo del VI y coloque el haz sobre la aorta. Pulse el botón PW para activar la ecocardiografía Doppler de onda pulsada. Después de siete semanas de anillamiento, los gradientes aórticos serán de >25 mmHg en los animales anillados.
10. Registre imágenes guiadas bidimensionales de aorta que muestren la presencia o ausencia de la constricción de la aorta ascendente para visualizar anatómicamente la eficacia de las bandas y la desbandificación.
    NOTA: Es posible visualizar el flujo turbulento en el nivel de constricción si el modo de color está disponible.
11. Evaluar la hipertrofia posicionando la sonda en un eje corto del VI, a nivel de los músculos papilares, y pulsar el trazado en modo M para visualizar la pared anterior del VI (DDVI), el diámetro del VI (DVI) y la pared posterior del VI (LVPW) en la diástole (D) y la sístole (S)(Figura 5).
12. Evaluar la función sistólica, calcular la fracción de eyección y el acortamiento fraccionario como se describió anteriormente^14,15.
13. Evaluar la función diastólica por 1) determinar el pico de Doppler de onda pulsada de la velocidad de flujo mitral temprano y tardío (ondas E y A, respectivamente) utilizando una vista apical de 4 cámaras apicales justo encima de las valvas mitrales; 2) registro de las velocidades diastólicas tempranas (E') y sistólicas máximas (S') del miocardio anular mitral lateral utilizando la TDI pulsada y la vista apical de 4 cámaras apicales(Figura 5).
14. Registre al menos tres latidos consecutivos en cada evaluación de parámetros. Estos valores se promediarán posteriormente.

8. Evaluación hemodinámica

1. Al final del protocolo(Figura 4),realizar la ecocardiografía final, como se describe en 7, antes de la evaluación hemodinámica terminal.
2. Repita los pasos 2.1 a 3.6.
3. Cannulate la vena yugular derecha y perfunde solución salina estéril a 64 mL/kg/h.
4. Gire ligeramente el animal hacia el lado izquierdo y haga una incisión en la piel a nivel del apéndice xifoideo.
5. Separe la piel del músculo con las esrórceps o con una tijera.
6. Haga una incisión lateral entre las costillas izquierdas a nivel del apéndice xifoides.
7. Realice una toracotomía lateral izquierda para exponer el corazón completamente.
   NOTA: Para evitar sangrado y daño pulmonar, inserte un hisopo de algodón en la cavidad torácica y empuje el pulmón suavemente mientras inserta dos hemóstatos en el lado derecho e izquierdo del lugar a cortar.
8. Precalentar los catéteres de asa P-V en un baño de agua a 37 °C.
9. Calibrar el catéter (configuración, ajuste del canal, eligió el canal correcto para la presión y el volumen, unidades).
10. Inserte un catéter de forma apical en el VI y asegúrese de que los sensores de volumen estén colocados entre la válvula aórtica y el ápice. Los volúmenes pueden ser evaluados por ecocardiografía (Figura 5). La visualización de los bucles presión-volumen ayuda a confirmar el posicionamiento correcto del catéter (Figura 6).
11. Permita que el animal se estabilice 20-30 min sin cambios significativos en la forma de los bucles de presión-volumen.
12. Con la ventilación suspendida al final de la expiración, adquirir registros de referencia (Figura 6). Adquirir continuamente datos a 1.000 Hz para ser posteriormente analizados fuera de línea por el software adecuado.
13. Calcular la conductancia paralela después del bolo salino hipertónico (10%, 10 μL).
14. Mientras está anestesiado, sacrifique al animal por exsanguinación, recoja y centrifue la sangre.
15. Por último, extirpar y recoger el corazón. Peso el corazón, el ventrículo izquierdo y derecho por separado y almacene inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido o formalina para estudios moleculares o histológicos posteriores, respectivamente.

9. Procedimiento de bandas/desbandamiento aórtico en ratas

1. Realizar bandas aórticas en Wistar joven (70-90 g) utilizando una aguja de 22 G y ligadura de polipropileno 6-0 para constreñir la aorta.
2. Asegurar un adecuado procedimientos anestésicos y analgésicos con 3-4% de sevoflurano y 0,05 mg/kg de buprenorfina, respectivamente.
3. Durante la ecocardiografía, asegurar una frecuencia cardíaca siempre por encima de 300 tasa / min (idealmente entre 300 y 350).
4. Antes del paso 8.9, diseccione suavemente la aorta de rata, coloque una sonda de flujo alrededor de ella para medir el gasto cardíaco. El uso de la sonda de flujo aórtico es el procedimiento estándar de oro para las ratas.
5. Para la evaluación hemodinámica, cannulate la vena yugular o femoral para la administración de líquido (32 mL/kg/h).
6. Reemplace el catéter de presión-volumen SPR-1035 por el SPR-847 o SPR-838, cuyos tamaños se adaptan mejor a las dimensiones ventriculares de rata.

Supervivencia postoperatoria y tardía
La supervivencia perioperatoria del procedimiento de anillamiento es del 80% y la mortalidad durante el primer mes suele ser de <20%. Como se mencionó anteriormente, el éxito de la cirugía de desbandificación depende en gran medida de cuán invasiva fue la cirugía anterior. Después de una curva de aprendizaje, la tasa de mortalidad durante los procedimientos de desbandificación es de alrededor del 25%. Para esta mortalidad se contabilizan principalmente las muertes durante el procedimiento quirúrgico, incluyendo la aorta o la ruptura de la aurícula izquierda (en ratas, la tasa de supervivencia es mayor en ambos procedimientos quirúrgicos).

Bandas aórticas y remodelación miocárdica
El éxito de la constricción aórtica fue verificado por el aumento de la presión sistólica final del VI (PEVI) y por velocidades de flujo aórtico Doppler >2,5 m/s, lo que corresponde a un gradiente de presión de 25 mmHg utilizando la ecuación de Bernoulli modificada (Figura 5). En comparación con los ratones SHAM, las bandas indujeron la hipertrofia del VI evaluada por el aumento de la masa del VI(Tabla 1 y Figura 5)y la alteración de la función diastólica evidente por presiones de llenado más altas (relación de la velocidad máxima mitral del llenado temprano (E) a la velocidad anular mitral diastólica temprana (E'), (E/e'), y la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (LVEDP) y la relajación prolongada (t, Tabla 1, Figura 5y Figura 6)dentro de las 7 semanas. La fracción de la eyección todavía fue preservada en esta etapa de la enfermedad.

Histológicamente, siete semanas de bandas aórticas indujeron hipertrofia y fibrosis cardiomiocitos significativas(Figura 7).

Desbanding aórtico y remodelación inversa miocárdica
En ratones sometidos a desbandificación, se verificó la eliminación exitosa de la estenosis aórtica mediante velocidades doppler de eco(Tabla 1 y Figura 5). En general, la desbandización promovió una disminución significativa de la poscarga (disminución de la PVI) y la hipertrofia del VI (evaluada por morfometría, ecocardiografía e histología). Por otra parte, se observó la normalización de la función diastólica y las velocidades aórticas(Tabla 1, Figura 5, Figura 6,y Figura 7).

Tabla 1: Alteraciones morfofuncionales del ventrículo izquierdo evaluadas por ecocardiografía y por hemodinámica.

Tabla 2: Pasos críticos del protocolo.

Figura 1: Instrumentos quirúrgicos ultra finos utilizados para los procedimientos de anillamiento y desbandificación. (A)2 porta agujas y una hoja de bisturí; 2 catéteres para intubación de ratones y una tijera; un bisturí, 2 fórceps curvos, una ayuda de ligadura, una tijera microquirúrgica, 3 fórceps rectos; (B)y 26G-aguja y embotado 26G-aguja curvado para adaptarse a los ratones pequeños abertura torácica correctamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2:Procedimiento de bandas aórticas. (A) La aproximación torácica a la aorta ascendente realizada con la ayuda de un sistema de retracción del fijador magnético (3 retractores son visibles). (B)La aorta ascendente está claramente diseccionada y visible. La aguja embotada y la sutura de polipropileno 6-0 se colocan en la posición correcta para realizar las bandas aórticas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:Procedimiento de desbanding aórtico. (A) El ratón se coloca en un sistema de retracción magnética, lo que representa una herramienta útil para retraer los músculos y tejidos. El ratón se intuba para la ventilación mecánica. Una sonda rectal controla la temperatura y se coloca un oxímetro en la pata derecha de los ratones para monitorear la oxigenación de la sangre durante la cirugía. La fibrosis y el tejido adherente se eliminan cuidadosamente alrededor de la aorta y la sutura, para poder cortar la sutura(B)y(C). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4:Diseño de protocolo experimental para ratones. La remodelación miocárdica (rojo) y la remodelación inversa (verde) se muestran en la parte inferior junto con todas las tareas de evaluación. Cabe destacar que la cirugía de desbandificación puede dar lugar a dos grupos de animales con distintos grados de remodelación inversa. Así, obtuvimos DEB ratón con recuperación miocárdica completa (DEB-COMP) e incompleta (DEB-INCOM). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5:Evaluación ecocardiográfica de la estructura y función cardíaca. (A) Velocidadesdel flujo aórtico; (B)Masa del VI; (C)Dimensiones ventriculares (diámetro del VI, DVI) y espesor de la pared (pared posterior del VI, LVPW y pared anterior del VI, DDVI); (D)Flujo transmitral (pico de la onda Doppler de pulso de la velocidad del flujo mitral tardío, A, y pico de la onda Doppler pulsada de la velocidad del flujo mitral temprano, E) y(E)Velocidades mitrales mitrales del tejido (velocidad diastólica tardía del tejido anular mitral, A'; velocidad diastólica temprana del tejido anular mitral, E' y velocidad del tejido anular mitral sistólico, S'). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6:Bucles de presión-volumen representativos para los grupos SHAM, BA y DEB. Los datos fueron adquiridos continuamente a 1000 Hz y posteriormente analizados fuera de línea por el software PVAN. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 7:Hipertrofia miocárdica y fibrosis evaluada histológicamente. (A)Hipertrofia del ventrículo izquierdo evaluada por cardiomiocitos área seccional de las secciones teñidas de hematoxilina-eosina (HE) (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 14) y grupo DEB (n = 12). (B)Fibrosis intersticial del ventrículo izquierdo e imágenes representativas de secciones rojas teñidas de Sirio (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 13) y DEB (n = 12). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.