Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.
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Artículo de método
Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal
En este artículo
Resumen
Resumen
Neisseria meningitidis (meningococo) es un microorganismo de rango estrecho, reconocido mundialmente como la principal causa de meningitis bacteriana. El meningococo es un colonizador transitorio de la nasofaringe humana de aproximadamente el 10% del sujeto sano. En circunstancias particulares, adquiere una capacidad invasiva para penetrar la barrera mucosa e invade el torrente sanguíneo causando septicemia. En el último caso, la sepsis fulminante podría surgir incluso sin el consiguiente desarrollo de la meningitis. Por el contrario, las bacterias podrían multiplicarse mal en el torrente sanguíneo, cruzar la barrera hematoencefálica, alcanzar el sistema nervioso central, lo que conduce a la meningitis fulminante. Los modelos murinos de meningitis bacteriana representan una herramienta útil para investigar las interacciones huésped-patógeno y analizar los mecanismos patogenéticos responsables de esta enfermedad letal. Aunque se han evaluado varios sistemas modelo experimentales en las últimas décadas, ninguno de ellos fue capaz de reproducir los eventos patológicos característicos de la enfermedad meningocócica. En este protocolo experimental, describimos un procedimiento detallado para la inducción de la meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Los signos peculiares de la meningitis humana se registraron en el huésped murino mediante la evaluación de parámetros clínicos (por ejemplo, temperatura, peso corporal), evaluación de la tasa de supervivencia, análisis microbiológico y examen histológico de lesiones cerebrales. Cuando se utiliza inóculo intracisternal (i.cist.), meningococci entrega completa directamente en cisterna magna, lo que conduce a una replicación meningocócica muy eficiente en el tejido cerebral. Se observa un aumento de 1.000 veces por el recuento viable de bacterias en aproximadamente 18 h. Por otra parte, los meningococos también se encuentran en el bazo, y el hígado de ratones infectados, lo que sugiere que el hígado puede representar un órgano diana para la replicación meningocócica.
Introducción
Neisseria meningitidis es un Gram negativo-proteobacterium restringido al huésped humano, bien conocido por ser una de las causas más comunes de meningitis y sepsis en la población humana en todo el mundo. Coloniza el tracto respiratorio superior (nariz y garganta) de portadores sanos y asintomáticos (2-30% de la población), pero la bacteria a veces evade varias defensas inmunitarias del huésped y se propaga desde el torrente sanguíneo al cerebro causando un inflamación, conocida como meningitis meningocócica. Una combinación de factores huésped y bacterianos parece contribuir a la transición de la comensal al comportamiento invasivo1.....
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Protocolo
Este protocolo se llevó a cabo para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de ratones de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Los experimentos in vivo reportados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Éticos (Prot. número 2, 14 de diciembre de 2012) y el Ministerio de Salud de Italia (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos los procedimientos deben realizarse dentro del Gabinete de Bioseguridad 2 (BSC2) en una sala BSL2, y los posibles residuos infectados deben eliminarse en contenedores específicos.
1. Infección de rat....
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Resultados
Supervivencia de ratones infectados con N. meningitidis tipo salvaje y cepas mutantes isogénicas.
Las cepas de Neisseria meningitidis utilizadas en estos resultados representativos son la cepa de referencia del serogrupo C 93/4286 (ET-37) y su mutante isogénico 93/4286-cssA obtenido mediante inactivación insercional del gen cssA, codificando para la UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa, que se asigna en el locus de síntesis de cápsulas25. Para.......
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Discusión
En este estudio, describimos un protocolo experimental para inducir la meningitis meningocócica en ratones adultos por i.cist. inoculación de bacterias meningocócicas. Hasta nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ningún otro modelo de meningitis meningocócica en ratones de laboratorio infectados por i.cist. ruta; en el pasado, esta forma ha sido explorada para proporcionar modelos de meningitis meningocócica tanto en rata31 como en conejo32. Es bien sabido que la tasa .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los estudios fueron apoyados en parte por PRIN 2012 [número de subvención 2012WJSX8K]: "Modelos de interacción Host-microbe en infecciones mucosas: desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas" y por PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Un enfoque integrado para abordar la interacción entre condiciones estresantes y resistencia a los antimicrobianos de patógenos desafiantes".
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,8 Zócalo Criovial Con rosca externa | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Tubo Cónico de Polipropileno | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Pinza Adson | F.S.T. | 11006-12 | Termo de alarma de acero inoxidable |
| TESTO | 9000530 | ||
| BactoTM Proteose Peptona | BD | 211693 | |
| BD Micro Jeringa fina | BD | 320837 | U-100 Insulina |
| BD Jeringa Plastipak 1 mL 25 G 5/8 pulgadas | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak jeringa 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| CABINA DE FLUJO LAMINAR VERTICAL BIOHAZARD AURA B | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| Biofotómetro | Eppendorf | Modelo #6131 | |
| Botella D | Tecniplast | D Graduado hasta: 400 mL, Volumen total 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm | |
| C150 CO2 Carpeta para incubadora | 9040-0078 | ||
| Cuerpo de jaula Eurostandard Tipo II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Superficie 370 cm2 |
| Placa de Petri de Cultivo Celular con Tapa | Thermo Scientific | 150288 | Volumen de trabajo: 5 mL |
| Centrífuga | Eppendorf | Microcentrífuga 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Forma | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| Hidrogenofosfato di-Potásico trihidrato | Carlo erba | 471767 | |
| Hidrogenofosfato di-Sódico anhidro ACS-para análisis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Certificado Estándar | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Pellet de alimento para animales |
| Pinzas Dumont Hp 5 Acero inoxidable | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm2 punta |
| Balanza electrónica | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Tubo de microcentrífuga Cerradura de seguridad Eppendorf | T3545-1000EA | ||
| Eritromicina | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Tijeras Bonn Extra Finas | F.S.T. | 14084-08 Tapa de filtro de | acero inoxidable |
| (mini-aislador), H-Temp con abrazaderas de bloqueo | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC base de agar | OXOID | CM0367 | |
| Pinzas Gillies 1 x2 dientes | F.S.T. | 11028-15 | Acero inoxidable |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Pinzas Graefe | F.S.T. | 11052-10 | Ancho de la punta dentada: 0,8 mm |
| Tapa interior | Tecniplast | 1264C116 | |
| Solución de hierro dextrano | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamina | Intervet | ||
| Cabina de seguridad microbiológica BH-EN y BHG Clase II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Tubos de microcentrífuga 1,5 mL | MARCA | PP780751 | tapón de rosca PP, grad |
| Pinza de manipulación del ratón | F.S.T. | 11035-20 | Caucho dentado; Superficie de agarre: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Guantes de Látex | Natural Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubadora Shaker | PBI international | C-24 Classic Incubadora de sobremesa Shaker | |
| Petri PS Platos | VWR | 391-0453 | 90 x 14,2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μ L |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μ LL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1.000 μ L |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A Cloruro | |
| de potasio | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Fosfato de dihidrógeno de potasio | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Pinzas desechables | VWR | 232-0191 | |
| Separador extraíble | Tecniplast | 1264C812 | |
| Tubos de polipropileno de fondo redondo | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Cloruro de sodio | MOLEKULA 41272436 | ||
| Retenedor de acero inoxidable y hoja filtrante de poliéster | Tecniplast | 1264C | |
| Pinzas de patrón estándar | F.S.T. | 11000-12 | Tijeras de |
| tenotomía Stevens | F.S.T. | 14066-11 | |
| Tijera quirúrgica de acero inoxidable - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Guantes de |
| nitrilo desechables Stainless Touch N Tuff | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Haier | DW-86L288 | Volumen = 288 L | |
| Tijeras Wagner | F.S.T. | 14070-12 | Intervet |
| xilacina |
Referencias
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al.
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Reimpresiones y permisos
