Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Resumen

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Resumen

Aquí, presentamos un método eficiente que se puede ejecutar con habilidades básicas de laboratorio y materiales para evaluar el movimiento quimiocinético de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) y las células auxiliares CD4⁺ T se aislaron de los bazos y los pulmones de los ratones BALB/c con problemas de óvulos de huevo de pollo (OVA). Confirmamos la expresión de CCR4 tanto en células CD4⁺ T como en ILC2, comparativamente. CCL17 y CCL22 son los ligandos conocidos para CCR4; por lo tanto, utilizando este método de transmigración ex vivo examinamos el movimiento inducido por CCL17^- y CCL22 de CCR4⁺ linfocitos. Para establecer gradientes de quimiocina, CCL17 y CCL22 se colocaron en la cámara inferior del sistema de transmigración. Luego se añadieron linfocitos aislados a las cámaras superiores y durante un período de 48 h los linfocitos migraron activamente a través de poros de 3 m hacia la quimiocina en la cámara inferior. Este es un sistema eficaz para determinar la quimiocinética de los linfocitos, pero, comprensiblemente, no imita las complejidades que se encuentran en los microambientes de órganos in vivo. Esta es una limitación del método que puede superarse mediante la adición de imágenes in situ del órgano y los linfocitos en estudio. Por el contrario, la ventaja de este método es que puede ser realizado por un técnico de nivel de entrada a una tasa mucho más rentable que las imágenes en vivo. A medida que los compuestos terapéuticos están disponibles para mejorar la migración, como en el caso de las células inmunitarias citotóxicas infiltrantes del tumor, o para inhibir la migración, tal vez en el caso de enfermedades autoinmunes donde la inmunopatología es preocupante, este método puede ser utilizado como herramienta de selección. En general, el método es eficaz si la quimiocina de interés está generando constantemente quimiocinética a un nivel estadísticamente más alto que el control de los medios. En tales casos, el grado de inhibición /mejora por un compuesto dado puede ser determinado también.

Introducción

Este método de transmigración original fue presentado por Stephen Boyden en 1962 en el Journal of Experimental Medicine¹. Gran parte de lo que sabemos sobre la quimiotaxis y la quimioquinética no sería posible sin el desarrollo de la cámara Boyden. Antes del descubrimiento de la primera quimiocina en 1977, se utilizaban sistemas de transmigración ex vivo para aprender sobre factores séricos que podrían detener el movimiento celular en los macrófagos mientras amplificaban la motilidad celular en neutrófilos^1,2. Una enorme riqueza de conocimiento se ha desarrollado con respecto a....

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC) y la Universidad de Utah.

1. Configuración y preparación de reactivos

1. Prepare los medios completos de RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
   1. Añadir 10 ml de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor a 90 ml de RPMI.
   2. Añadir 1 mL de 100x Penicilina-Streptomicina-Glutamina a 100 mL de 10% FBS RPMI.
2. Prepare los medios de expansión ILC2.
   1. Agregue IL-2 e IL-33 (20 ng/....

Resultados

Expresión CCR4 en células T CD4+ e ILC2.

Para el éxito del experimento de transmigración ex vivo, es imperativo determinar si los linfocitos responden a CCL17 y CCL22 a través de CCR4; por lo tanto, determinamos la expresión CCR4 en células CD4⁺ T e ILC2 por citometría de flujo. Si bien es bien sabido que las células T específicas de OVA CD4⁺ auxiliares expresan CCR4, menos se sabe de la expresión de CCR4 en ILC2. La Figura 1.......

Discusión

En este documento, presentamos un método bien establecido para evaluar la migración inducida por quimiocina de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Hay varios pasos críticos en el protocolo, el primero de los cuales es verificar la expresión del receptor de quimiocina correcto en las células inmunitarias en el experimento. En nuestras manos, elegimos CCR4 debido al cuerpo de literatura que destaca la importancia de CCR4 en th2 células T auxiliares en la inflamación alérgica. La inflamación inducida por ova.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.4% Azul Trypan	Sigma-Aldrich	15250061
Jeringa de 1 mL	BD Bioscience	329424	U-100 Jeringas Microfinas 28 g 1/2" 1cc
100x Penicilina-Estreptomicina, L-Glutamina	Gibco	10378-016	Diluido a 1x en medios RPMI
Tubos cónicos de 15 mL	Olympus Plastics	28-101	tubos de polipropileno
3 μ m Insertos transwell	Genesee Scientific	25-288	Placa de 24 pocillos que contiene 12 insertos transwell
3x fijador estabilizador	BD Pharmigen	338036	Prepare 1x solución según el protocolo
del fabricante Tubos de poliestireno de 5 mL	STEM Cell Technologies	38007
Tubos cónicos de 50 mL
de polipropileno Olympus Plastics 28-106Imán de fácil separación de 8 cámaras	STEM Cell Technologies	18103
ACK Tampón de lisis	Life Technologies Corporation	A1049201
Filtro de células avanzado, 40 μ m	Malla de nailon Genesee Scientific	25-375	, 40 μ m filtros
Hidróxido de aluminio, grado reactivo	Sigma-Aldrich	239186-25G	20 mg/mL
anti-ratón CCR4; Biolegend conjugado con APC		131211	0,5 μ g/test
anti-ratón CD11b	BD Pharmigen	557396	0,5 μ g/prueba
anti-ratón CD11c; PE eFluor 610	Thermo-Fischer Scientific	61-0114-82	0.25 μ g/test
anti-ratón CD16/32, bloque Fc	BD Pharmigen	553141	0,5 μ g/prueba
anti-ratón CD19; APC-eFluor 780 conjugado	Thermo-Fischer Scientific	47-0193-82	0.5 μ g/prueba
anti-ratón CD3; PE Cy 7 conjugado	BD Pharmigen	552774	0,25 μ g/prueba
anti-ratón CD45; PE conjugado	BD Pharmigen	56087	0.5 μ g/test
anti-ratón ICOS (CD278)	BD Pharmigen	564070	0.5 μ g/prueba
anti-ratón NK1.1 (CD161);	BD Pharmigen	553164	0,25 μ g/prueba
anti-ratón ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugado	Biolegend	145311	0.5 μ g/test
Contador de células automatizado	BIORAD	1450102
disociador automatizado	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
Albúmina sérica bovina, polvo liofilizado	Sigma-Aldrich	A2153-10G	0,5% en RPMI sin suero
Contador de células Clides	BIORAD	1450015
Ovoalbúmina de huevo de gallina, grado V	Sigma-Aldrich	A5503-10G	500 μ g/mL
de colagenasa, Tipo 1, Filtrado	Worthington Biochemical Corporation	CLSS-1, comprar como 5 viales de 50 mg (LS004216)	25 U/mL en RPMI
Perlas de compensación	Affymetrix	01-1111-41	1 gota por tubo de control
Tubos de disociación	MACS Miltenyi Biotec	130-096-335
FACS Tampón	BD Pharmigen	554657	1x PBS + 2% FBS, con azida de sodio; almacenado a 4 ° C
Calor inactivado-FBS	Genesee Scientific	25-525H	10% en RPMI completo & Ratón de medios de expansión
ILC2 CCL17	GenScript	Z02954-20	50 ng/mL
Ratón CCL22	GenScript	Z02856-20	50 ng/
mL Ratón CD4+ Kit de enriquecimiento de células T	STEM Cell Technologies	19852
Ratón IL-2	GenScript	Z02764-20	Ratón de 20 ng/
mL Kit de enriquecimiento ILC2	STEM Cell Technologies	19842
Ratón recombinante IL-33	STEM Cell Technologies	78044	20 ng/mL
RPMI	Life Technologies Corporation	22400071
Tampón de separación	STEM Cell Technologies	20144	1x PBS + 2% FBS; almacenado a 4 & grados; C
Nebulizador y cámara para animales pequeños	Data Sciences International
Sterile saline	Baxter	2F7124; NDC 0338-0048-04	Cloruro de sodio al 0,9%

Tubos conjugado con FITC