Artículo de método

Perspicacia mecanicista sobre el desarrollo de la fibrosis intestinal mediada por TNBS y la evaluación de los efectos inhibidores de la rapamicina

DOI:

10.3791/60067

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12 de septiembre de 2019

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1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science, University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

En este artículo

Resumen

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En este estudio, describimos un procedimiento detallado de fibrosis intestinal mediada por TNBS, que exhibe fisiopatología comparable a la fibrosis de Crohn. También discutimos este enfoque a la luz de los efectos inhibidores facilitados por la rapamicina sobre la fibrosis intestinal.

Resumen

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Se han realizado estudios significativos para comprender el manejo eficaz de la fibrosis intestinal. Sin embargo, la falta de un mejor conocimiento de la fibrosis ha obstaculizado el desarrollo de un medicamento preventivo. Principalmente, encontrar un modelo animal adecuado es un reto en la comprensión del mecanismo de la patología de la fibrosis intestinal asociada a Crohn. Aquí, adoptamos un método eficaz donde la exposición química de TNBS a los rectos de los ratones produce ulceración sustancialmente profunda e inflamación crónica, y los ratones luego desarrollan crónicamente fibrosis intestinal. También, describimos una técnica donde una inyección de rapamicina muestra efectos inhibitorios sobre la fibrosis mediada por TNBS en el modelo de ratón. Para evaluar el mecanismo subyacente de la fibrosis, medimetóicamente un procedimiento para purificar las células Cx3Cr1+ a partir de la propria de lamina de ratones tratados con TNBS y de control. Este protocolo detallado será útil para los investigadores que están investigando el mecanismo de la fibrosis y allanan el camino para encontrar una mejor invención terapéutica para la fibrosis intestinal asociada a Crohn.

Introducción

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La desregulación de la homeostasis inmune en el intestino conduce a la inflamación patógena y ha sido ampliamente conocida por causar enfermedad inflamatoria intestinal (EII)1,2. La fibrosis intestinal es una consecuencia crónica de las enfermedades inflamatorias intestinales (ECD), como la enfermedad de Crohn (CD)3. La fisiopatología irreversible de la CD incluye estenosis intestinal o estenosis de la fibrosis, que limita las opciones de tratamiento, y sin medicamentos disponibles actualmente, el único tratamiento es la cirugía. En última instancia, el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar la inflamación inapropiada es muy necesario para estudiar el mecanismo de la CD, y esto nos llevará un paso más cerca de eso.

Una variedad de modelos genéticos de ratón están disponibles para estudiar IBD incluyendo IL10 KO, SAMP/Yit y transferencia de células altas CD45+RB adoptiva a ratones SCID4,5,6. Aquí, mostramos el procedimiento para la fibrosis mediada por TNBS en el modelo de ratón de CD, que es comparable a la patología de la fibrosis humana de Crohn. El modelo inducido por TNBS tiene ciertas ventajas. Este modelo es técnicamente simple; la aparición de la enfermedad es rápida, barata y podría utilizarse ampliamente en diferentes animales (por ejemplo, ratón, rata y conejillo de indias7). La administración conjunta de etanol y TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfónico) daña abruptamente la barrera intestinal y expone la proteína del tejido de colon a la TNBS y genera respuestas inmunológicas sustanciales8,9. La exposición repetida de TNBS conduce a un proceso de reparación hiperreactivo que responde a la inflamación y lesión, y desarrolla una reacción fibrosa en el intestino. Por lo tanto, el modelo de fibrosis inducida por TNBS sirve para ser un modelo muy convincente para estudiar la fibrosis intestinal asociada a Crohn.

Además, los fagocitos mononucleares son las células primarias que arbitra la respuesta inmune innata a la patogénesis y lesión en el intestino10,11,12,13. Para dilucidar el mecanismo celular y establecer el papel de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares en el modelo de fibrosis TNBS, mostramos el procedimiento de purificación de los fagocitos mononucleares. El análisis de Cx3Cr1+ células es un paso esencial para evaluar los marcadores inflamatorios y determinar el mecanismo concomitante para la fibrosis intestinal. Colectivamente, este procedimiento detallado para la fibrosis TNBS será útil para explicar los mecanismos celulares de la fibrosis intestinal.

Protocolo

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Para este manuscrito, todas las muestras humanas fueron adquiridas de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión del Instituto (IRB) y por el Comité de Investigación Humana en Albany Medical College. Todas las investigaciones relacionadas con animales fueron seguidas estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Albany Medical College, así como el National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals .

1. Recogida de especímenes intestinales humanos

  1. Recoger muestras de tejido humano de acuerdo con los protocolos del comité de investigación de la institución.
  2. Procurar tejido intestinal (ileocos) de un paciente con CD diagnosticado con fibrosis y controlar muestras de pacientes sin antecedentes de EII.
  3. Utilizar parte del tejido intestinal para la inmunohistología, otra parte del tejido para analizar el ARNm y una parte final para la expresión proteica de genes/marcadores fibrososos y citoquinas.
  4. Para el análisis de inmunohistología, primero fije la muestra de tejido humano en un 4% de paraformaldehído durante al menos 48 h y luego transfiérala a un tubo que contenga 70% de etanol durante al menos 16 h. Use este tejido fijo para hacer un bloque incrustado en parafina y corte el tejido de 5 m de espesor secciones mediante el uso de un microtome tisular.
  5. Con un cepillo, extienda suavemente cada sección cortada en un portaobjetos de vidrio para manchar.
  6. Diapositiva de sección de tejido de tinción con tinción tricroma para detectar la deposición de colágeno, y con la mancha de la A.SM para detectar miofibroblastos (ver sección 3 para obtener información detallada sobre el tricromo y la tinción de la AMI). Examine las secciones manchadas bajo un microscopio de luz.
  7. Procesar otra parte de la muestra de tejido humano obtenida para hacer lisato proteico para detectar la SSMA a través de la mancha occidental (ver sección 7 para obtener información detallada sobre el análisis de la mancha occidental).
  8. Obtenga ARN de la parte final de la muestra de tejido humano utilizando un reactivo de extracción(Tabla de materiales)y convierta el ARNm en ADNc cDNA a través de RT-PCR.
  9. Analizar los genes fibrososos y citoquinas por qPCR (ver sección 6 para obtener información detallada sobre la preparación del ARNm).

2. Inducción de fibrosis TNBS y tratamiento con rapamicina en ratones

  1. Llevar a cabo la investigación animal de acuerdo con los protocolos de investigación animal aprobados por la institución.
  2. Afeitar ratones adultos alrededor de la zona del cuello con el fin de pre-sensibilizar a TNBS a través de la exposición dérmica. Remoje TNBS en un hisopo de algodón y luego aplique TNBS en la zona arasda del cuello del ratón.
    NOTA: La presensibilización es un paso muy importante, ya que mejora la respuesta de hipersensibilidad retardada para iniciar la inflamación mediada por TNBS.
  3. Ocho días después de la presensibilización, inducir la colitis por administración intrarectal una vez a la semana durante seis semanas. Aplicar cuatro mg de TNBS (en 25% de etanol) utilizando un enema de 100 ml a través de una jeringa de 1 ml unida a un catéter de poliuretano francés de 3,5 y dar a los ratones de control 100 ml de etanol al 25%solamente.
    1. Anestetizar ratones con pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) o exponerlos al 2,5% de isoflurano junto con 1 L/min de oxígeno durante la administración de TNBS. Confirme la anestesia pellizcando suavemente los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los ojos y buscando la ausencia de reflejo.
  4. Use pomada veterinaria en los ojos para prevenir la sequedad mientras los ratones están bajo anestesia.
  5. Inyectar rapamicina a 2 mg/kg/día o vehículo (5% Tween-20 y 4% etanol) todos los días de la semana durante 3-6 semanas, intraperitoneales, tanto a ratones de control como tratados con TNBS.
  6. Utilice el intestino de ratones post-tratados TNBS de 6 semanas para analizar los ensayos extracelulares incluyendo histología, citometría de flujo, hinchazón occidental y extracción de ARN. Para cosechar órganos, euthanizar ratones utilizando la inhalación de CO2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical.
    1. Para cosechar órganos, euthanizar ratones utilizando la inhalación de CO2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical. Después de la eutanasia, abra longitudinalmente el ratón en su lado ventral usando tijeras de grado quirúrgico y fórceps. Retire todo el colon del recto hasta el área de ilium terminal. Transfiera rápidamente el colon a 1x HBSS helado y lave el colon con el mismo tampón.
    2. Mida y compare las longitudes de dos puntos de los ratones tratados con TNBS y TNBS. Realice este paso lo más rápido posible para evitar el secado de los colones con el fin de evitar muertes celulares.
    3. Cortar el colon en trozos pequeños y mantener a -80 oC para su almacenamiento para fines futuros (análisis de ARN/western blot). Utilice otra pieza de los dos puntos para el análisis FACS.
    4. Asegúrese de cortar y recoger muestras de tejido colono de regiones similares del colon de animales tratados con TNBS y tratados con TNBS.
      NOTA: Se espera una mortalidad del 10%-20% con la inoculación del TNBS, aunque con la experiencia, la tasa de mortalidad puede reducirse significativamente.

3. Evaluación inmunohistopatológica de la fibrosis intestinal

  1. Fijar los tejidos humanos y/o ratones en 4% paraformaldehído durante 48 h, y luego transferir al 70% de etanol durante 16 h.
    NOTA: Paraformaldehyde es un producto químico neurotóxico por lo que evitar la inhalación; usar una máscara facial mientras la usas.
  2. La parafina incorpora los tejidos fijos del colon, corta a un espesor de 5 m y coloca directamente los tejidos en diapositivas de vidrio para la histología.
  3. Realice la tinción H&E y Trichrome Blue de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detectar colágeno.
    1. Brevemente, primero desparasfina las secciones sumergiendo la diapositiva que contiene secciones en dos cámaras de xileno durante 5 min en cada cámara.
    2. Enjuague los portaobjetos con 100% de alcohol durante 1 min; repetir este paso tres veces. Enjuague de nuevo con agua del grifo durante 1 min.
    3. Después de eso, sumerja los portaobjetos en la solución precalentada de Bouin a 56 oC durante 60 minutos. lavar después de sacar los toboganes de la solución de Bouin en agua del grifo durante 3 minutos o hasta que los portaobjetos se volvieran incoloros.
    4. Sumerja las diapositivas en la solución de hematoxilina de Mayer modificada durante 7 minutos a temperatura ambiente.
    5. Se desliza por la mancha sumergiendo en la mancha Trichrome durante 5-8 min. Inmediatamente, enjuague los portaobjetos en agua corriente durante 5-10 s para eliminar el exceso de manchas Trichrome.
    6. Deshidratar los portaobjetos con 100% de alcohol durante 1 min. Repita este procedimiento tres veces.
    7. Despeje las diapositivas con xileno durante 1 min y repita el paso 3x.
    8. Monte los portaobjetos con soporte de montaje(Tabla de materiales).
  4. Sostenga cuidadosamente el cubreobjetos en un extremo con fórceps y deje que cubra toda la sección sin tener burbujas. Si hay algunas burbujas, retire rápidamente las burbujas tocando la cubierta.
  5. Utilice la inmunomancha para detectar la AMA.
    1. Bloquear las secciones de dos puntos en el tampón de bloqueo (0,2% Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra en 1x PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
    2. Incubar con 100 l de anticuerpo primario diluido para la SMA(Tabla de Materiales)en la solución deslizante (0,2% Triton X-100 y 3% de suero normal de cabra en 1x PBS; anti-SMA 1:200) a 4oC durante la noche.
    3. Lave las secciones tres veces con 1x PBS.
    4. Utilice IgG antiratón de cabra (H + L) conjugado con Alexa Fluor 488(Tabla de materiales)como anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente.
    5. Lave las secciones tres veces con 1x PBS.
    6. Utilice DAPI para contrarrestar el núcleo durante 5 min.
    7. Lave las secciones tres veces con 1x PBS.
    8. Monte las guías con medios de montaje fluorescentes(Tabla de materiales)y selle con un cubreobjetos con esmalte de uñas.
  6. Adquiera imágenes utilizando el microscopio confocal LSM 880 y las imágenes de proceso utilizando el software del microscopio.
  7. Cuantifique las imágenes tomando un promedio de varias áreas seleccionadas en la misma sección con ImageJ.

4. Aislamiento de la lámina intestinal y purificación de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares

  1. Abra longitudinalmente el colon en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS; Tabla de Materiales) y lavar el colon con el mismo tampón.
  2. Corte aproximadamente 5 cm pequeños trozos de tejidos de colon usando tijeras estériles en HBSS.
  3. Transfiera piezas de tejido de colon pequeño en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de tampón de predigestión (1x HBSS con 5% FBS, 5 mM EDTA y 1 mM de TDT), y agite durante 20 minutos a 100 rpm en una incubadora de 37 oC11.
    NOTA: La incubación de tejido colono a 37 oC a 100 rpm de condición de agitación permite una digestión eficiente del tejido de la colagenasa y un alto rendimiento de células viables.
  4. Deseche el epitelio colono separado pasando a través de un colador de células de 40 m.
  5. Recoger el tejido restante del colador y digerirlos aún más en el tampón de digestión que contiene Colagenasa tipo IV y DNase I(Tabla de Materiales)en 1x HBSS con 5% FBS durante 20 min a 37oC a 100 rpm.
  6. Vortex los tejidos digeridos durante aproximadamente 20 s y pasar a través de un colador celular de 40 m para obtener fracciones de propria de lamina.
  7. Centrifugar las fracciones de propria de lamina para peletizar las células a 700 x g en 4 oC
  8. Para excluir las celdas muertas de la lámina propria utilice un gradiente de densidad(Tabla de materiales).
    NOTA: Los medios de gradiente de densidad utilizados aquí(Tabla de Materiales)pueden causar la pérdida de células mononucleares; sin embargo, elimina en gran medida las células muertas de la preparación, lo que en general aumenta la pureza.
    1. Haga 100 ml cada una de las soluciones de medios de gradiente de densidad del 30% y del 70%. Resuspender las células obtenidas en 10 ml de la solución del 30% y superponerse encima de 5 ml de la solución del 70% en un tubo de 15 ml.
    2. Centrifugar el gradiente en un estado libre de frenos a 1.000 x g y a temperatura ambiente. Recoger la fase de anillo blanco que contiene linfocitos propria de lámina, que estará entre las capas de 30% y 70% de gradiente.
  9. Lavar las células obtenidas mediante la resuspensión en HBSS helado y centrífuga a 500 x g,20 oC, durante 10 min. Volver a suspender las células en el tampón FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) (PBS, pH 7.4, con 1% de BSA y 2 mM EDTA).
  10. Purificar los fagocitos mononucleares de la purificación de las células recogidas utilizando perlas magnéticas y/o clasificación FACS.
    1. Purificación magnética
      1. Antes de la tinción con anticuerpos, primero bloquee la superficie celular de las células de lamina propria incubando con el bloqueador de CD16/CD32 Fc antiratón durante 15 minutos sobre hielo.
      2. Incubar células con anticuerpos anti-Cx3Cr1-PE (ficoeritrina) junto con microperlas anti-PE(Tabla de materiales)durante 30 minutos sobre hielo, para capturar las células enlazadas. Lave las células con el tampón FACS.
      3. Pase las células enlazadas a anticuerpos/perlas a través de una columna de clasificación de células activada magnéticamente en un campo magnético para eliminar las células no enlazadas. Lávese tres veces con el búfer FACS. Retire la columna del campo magnético y empuje el émbolo en la columna para producir celdas enlazadas con cordón.
    2. Clasificación FACS
      NOTA: La clasificación FACS se puede utilizar en lugar de la purificación magnética. Aunque la purificación magnética es un método fácil y rentable, se limita a purificar solo células individuales, no a subpoblaciones de células. Por lo tanto, para aislar subpoblaciones de células, el método de clasificación FACS es un método eficaz para clasificar celdas individuales, así como subpoblaciones de celdas.
      1. Células de lamina propria de bloque con bloqueador antiratón CD16/CD32 Fc (Tabla de materiales).
      2. Células de mancha mediante la incubación con anticuerpos anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C y MHCII.
      3. Ordenar usando un citómetro de flujo FACS, gating para CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- células para purificar la población CX3Cr1 (P3 + P4).
  11. Células ordenadas de Lyse para la preparación total del ARN y la detección de marcadores de citoquinas y fibroticos (ver sección 6 para la preparación de ARN y ADNc).
  12. Analizar la expresión de ARNm de marcadores fibroticos y el análisis de citoquinas inflamatorias a partir de suspensiones de una sola célula aisladas de purificación magnética.
  13. Para el análisis FACS, bloquee las celdas con el bloqueador antiratón CD16/CD32 Fc(Tabla de materiales)antes de manchar con anticuerpos contra marcadores de superficie o intracelulares.

5. Análisis de citometría de flujo

  1. Tinción y análisis de superficie celular
    1. Resuspenda 5-10 x 105 células de propria de lámina aisladas en 50 ml de tampón FACS (1% BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7.4).
    2. Incubar células con cd16/CD32 antiratón(Tabla de materiales) a una dilución 1:50 para bloquear los receptores Fc en hielo durante 10 min.
    3. Lave las células con 500 ml de tampón FACS helado para eliminar el anti-CD16/CD32 no unido antes de la tinción de la superficie celular.
    4. Suspensión de una sola célula colónica de mancha superficial (106 células/50 ml) con anticuerpo con etiqueta fluorescente a 1:100 de dilución en hielo durante 30 min para evaluar la lámina propria colónica.
    5. Lave las células etiquetadas con 500 ml de tampón DE FACS helado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos.
    6. Analizar las células mononucleares etiquetadas por citometría de flujo. Gate for Live, luego para FSC+SSC+ seguido de CD11b+ Cx3Cr1+, y luego analizar otros marcadores de activación de macrófagos incluyendo MHCII, CD80, CD86 y CD40.
  2. Tinción y análisis de citoquinas intracelulares
    1. Para la tinción de citoquinas intracelulares, fijar y permeabilizar las células teñidas de superficie utilizando un kit de solución de fijación/permeabilización(Tabla de materiales); siga las instrucciones del fabricante para conocer los pasos detallados.
    2. Células propria de lámina de puerta para Live, luego para FSC+SSC+ seguida de CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ para detectar el nivel intracelular de citoquina IL23 y CD11b+ Cx3Cr1+IL1+ detectar el nivel intracelular de citoquinas IL1.
  3. Tinción y análisis de la AMI
    1. Lave las células con tampón FACS dos veces centrifugando a 200 x g y 4 oC durante 5 min para eliminar el exceso de tampón fijador.
    2. Para determinar el nivel de SMA, permeelice las celdas con un kit de solución de fijación/permeabilización (Tabla de materiales).
    3. Incubar células con anticuerpo anti-SMA-AF488(Tabla de Materiales) usando 1:1,000 de dilución en hielo durante 30 min.
    4. Lave las células dos veces y luego haga el análisis FACS. Gate for Live, FSC+SSC+ seguido de la detección de células sma+ en células colónicas.

6. Aislamiento de ARN, RT-PCR, PCR en tiempo real

  1. Aislar el ARN de las células purificadas MACS o FACS o el tejido extirpado de colon homogeneizándolos en el reactivo de extracción(Tabla de materiales).
    NOTA: Utilice gafas de seguridad y otros equipos de protección de laboratorio cuando trabaje con este reactivo, ya que es un irritante para el pulmón y la piel. Trabaja con seguridad en una capucha.
  2. Añadir 0,5 l de glucógeno libre de RNase a partir de 20 g/ml de solución de glucógeno(Tabla de materiales)para mejorar la recuperación del ARN total antes de precipitar el ARN con isopropanol.
  3. Resuspender el pellet de ARN en 50 ml de agua libre de RNase(Tabla de Materiales)e incubar a 55 oC durante 5 min para disolver completamente el paladar de ARN.
  4. Lea las concentraciones de ARN utilizando un espectrofotómetro a 260 nm.
  5. Sintetice el ADNc utilizando 1 g de ARN total y un kit de síntesis de transcripción inversa(Tabla de materiales).
  6. Analice la expresión génica utilizando 2 l de ADNc como plantillas a través de PCR en tiempo real. Utilice un kit qPCR Master Mix de placa PCR de 96 pocillos(Tabla de materiales). Utilice los valores CT para calcular el cambio de plegado de la abundancia de ARN después de normalizar los valores GAPDH/HPRT.

7. Hincha occidental

  1. Tejido de colon Lyse mediante el uso de tampón de lisis RIPA (1% NP40).
  2. Resolver el lisado proteico en un 8% bis-Tris gel a una tensión constante de 80 V.
  3. Transfiera la proteína de gel a la membrana(s) de nitrocelulosa en tampón de transferencia en frío que corría a una corriente constante de 50 mA durante 2 h a 4 oC.
  4. Bloquear regiones no específicas en la membrana transferida a proteínas utilizando 5% de leche sin grasa en TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% Tween-20) durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
  5. Para detectar los niveles de SMA, incubar la(s) membrana(s) con el anticuerpo de detección primaria de la A. SMA a 4 oC durante la noche.
  6. Lave las membranas 3-4 veces usando TBST en intervalos de 15 minutos.
  7. Incubar con anticuerposecundario conjugado en HRP (1:10.000) en leche sin grasa al 5% en TBST.
  8. Desarrollar membranas utilizando un kit de desarrollo de ECL.
  9. Normalizar las intensidades de la señal proteica con GAPDH como control de carga para el análisis de densitometría.

8. Análisis estadístico

  1. Analice los datos utilizando el software de análisis de datos de elección comparando entre el tipo salvaje y los animales KO.
  2. Considere que el valor P de <0.05 es significativo (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).
  3. Utilice la prueba t de Student para probar las diferencias entre dos grupos y la prueba ANOVA para su análisis entre más de dos grupos.

Resultados

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Adoptamos el modelo de ratón de colitis TNBS para estudiar y dilucidar los mecanismos subyacentes de la fibrosis intestinal8. Aquí, realizamos un estudio detallado del curso de tiempo de la colitis mediada por TNBS, donde TNBS se administró rectalmente a ratones de tipo salvaje durante un máximo de seis semanas como se representa esquemáticamente(Figura 1A). Después de seis semanas de tratamiento con TNBS, notamos que las longitudes colónicas se acortan progresivamente en el transcurso del tratamiento con TNBS, de una media de 5 x 0,5 cm en el grupo de control a 3 x 0,5 cm en el grupo TNBS; tal análisis cuantitativo de la longitud de dos puntos representa una reducción muy aparente de la longitud de dos puntos(Figura 1B). Para asegurarnos de que el modelo de enfermedad de TNBS Crohn es comparable al modelo de fibrosis de Crohn humano y no era un artefacto relacionado con la metodología, analizamos los marcadores fibroticos en múltiples niveles en un estudio detallado del curso de tiempo para la inyección de TNBS al tipo salvaje . La acumulación de células positivas de actina muscular alfa-suave (SMA) y la deposición de colágeno dentro de las capas submucosas se han notificado en la mayoría de las incidencias de fibrosis y se considera un sello distintivo para los eventos fibrosas14. Encontramos que las secciones de dos puntos de ratones tratados con TNBS que estaban manchadas con la AMA mostraron un aumento de 4-6 veces en la capa de la submucosa colónica manchada positivamente con la AMA(Figura 1C). Además, la tinción azul tricroma para estas secciones también mostró un aumento de 2-4 veces, lo que sugiere una deposición significativa de colágeno, que valida la fibrosis intestinal grave(Figura 1D). Evaluamos además la activación de los miofibroblastos mediante la detección de células positivas de SMA mediante el análisis de FACS en ratones tratados con TNBS en el colon de ratones tratados con TNBS y encontramos una acumulación significativa de tinción positiva de La AMA(Figura 1E). Además, encontramos una inducción sustancial en la expresión de las s.s. SMA, Col-I y Col-III medida por el análisis qPCR en ratones tratados con TNBS(Figura 1F). El aumento de la expresión de la proteína SMA en el análisis de manchas occidentales reveló un aumento de la fibrosis(Figura 1G). En general, el tratamiento cinético de TNBS ofrece la oportunidad de acceder a la respuesta inmune putativa en condiciones crónicas, que imita de cerca la condición de fase crónica de la CD y es esencial para el desarrollo de la fibrosis.

Para comparar la fibrosis TNBS con la fibrosis asociada de Crohn, analizamos la expresión de marcadores de fibrosis y citoquinas en biopsia de tejido fresco del íleon de pacientes con CD activo o bajo remisión. Sorprendentemente, encontramos una marcada inducción del engrosamiento de las capas positivas de la AMA y el aumento de la deposición de colágeno detectado por la tinción tricroma en secciones de CD activas(Figura 2A). También realizamos análisis de manchas occidentales y confirmamos la inducción de la expresión ssMA en muestras de CD activas(Figura 2B). Además, observamos una inducción significativa de los marcadores de fibrosis, incluyendo la AMA, Col1, detectada por el análisis qPCR(Figura 2C).

A continuación, para determinar un mecanismo para limitar la fibrosis TNBS evaluamos los efectos de la rapamicina, un inhibidor farmacológico de la actividad mTOR15,16. En consecuencia, tratamos a ratones con TNBS y rapamicina y analizamos el nivel de SMA y colágeno en histología del colon y hemos mostrado la medición cuantitativa de la A.S.M. y el colágeno en la gráfica de densitometría(Figura 3A). Nuestros datos sugieren que la rapamicina reduce la tinción positiva de la AMA en la capa submucosa y disminuye la deposición de colágeno. Para validar y cuantificar aún más las respuestas fibrosas, determinamos las expresiones sSMA, colágeno y TGF por qPCR, y la expresión de SMA por citometría de flujo en dos puntos tratados con TNBS(Figura 3B, 3C). También hemos demostrado Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares inducen una respuesta inmune inflamatoria a la lesión9. Por lo tanto, queríamos ver si la administración de rapamicina en ratones tratados con TNBS podría revertir los efectos inflamatorios y fibroticos. Por lo tanto, purificamos Cx3Cr1+ phagocitos mononucleares residentes de suspensiones de una sola célula colónica mediante el uso de microperlas magnéticas(Figura 3D). Encontramos un mayor nivel de p-p70 y p-S6 en Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares residentes por análisis de manchas occidentales de ratones tratados con TNBS, y este nivel fue bloqueado por rapamicina (Figura 3E). Además, encontramos que el tratamiento con rapamicina amortigua la IL-23 y la IL-1 en el grupo tratado con TNBS(Figura 3F). Además, estos hallazgos aclaran el mecanismo eficaz implicado en la inducción de la TNBS-fibrosis y han demostrado que la rapamicina atenúa la inducción de la fibrosis.

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Figura 1: La administración exitosa de TNBS conduce al desarrollo de fibrosis intestinal en ratones. A. Representación del diagrama esquemático del tratamiento semanal de TNBS dado a ratones de tipo salvaje. B. Imágenes de colon y medición de longitudes de colon de ratones tratados con TNBS, cosechadas en las semanas 0, 2, 4 y 6 tratamiento post-TNSB. C-D. Análisis histológico de las secciones de colon manchado con anticuerpo anti-SMA para la activación de miofibroblastos y tinción azul tricroma para colágeno; barra de escala 100 m. E. Análisis facS para identificar células positivas en el colon y cuantificación de células positivas de La AMA. F. Marcadores fibrosos y citoquinas detectados por qPCR. G. Análisis de manchas occidentales de la A-SMA a partir del lisato de colon de ratones tratados con TNBS y de control. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: La fibrosis TNBS es comparable a la fibrosis intestinal asociada a Crohn. A. Imágenes representativas de biopsias de colon de control, CD activo que muestra un aumento significativo de la tinción azul tricroma y tinción positiva de la AMA en capas submucosas, barra de escala 50 m. B. Análisis de manchas occidentales de la expresión y cuantificación de la A- SMA. C. análisis qPCR de marcadores fibroticos y citoquinas. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El tratamiento con rapamicina mejora eficazmente la fibrosis inducida por TNBS. A. Análisis histológico de colon - imágenes representativas de la tinción de miofibroblastos con anticuerpos anti-SMA y tinción de colágeno con azul tricroma, barra de escala 100 m. B. análisis qPCR de la expresión de La AMA, colágeno y TGF en Control/ Dos puntos de ratón tratados con TNBS. C. Análisis FACS de la AIMA en suspensión de una sola célula del colon del ratón tratado con Control/TNBS. D. Esquema para la purificación de Cx3Cr1+ células de fracción de propria de lamina colónica y análisis FACS de células purificadas. E. Análisis de manchas occidentales de los niveles de p-p70 y p-S6 en fagocitos mononucleares cx3Cr1+ purificados de ratones tratados con TNBS y/o rapamicina. F. qPCR análisis de la expresión en fagocitos mononucleares cx3Cr1+ purificados, que produce IL-23 e IL-1. Esta cifra modificada está siendo reutilizada con el permiso de la publicación anterior9 en Mucosal Immunology, 2019 por Mathur et al. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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La cicatrización de heridas o reparación de tejidos es un proceso biológico estrechamente regulado17. Durante la lesión tisular con una condición química, mecánica y de infección, una respuesta inflamatoria desencadena el proceso de reparación del tejido. Sin embargo, una respuesta inflamatoria desregulada y patológica conduce al desarrollo de cicatrices o una reacción fibrosa, que podría afectar la función de reparación del tejido9,18,19. Aquí, mostramos el procedimiento para el modelo animal de fibrosis inducido por TNBS, que comparte significativamente la fisiopatología con la enfermedad humana de Crohn. La inoculación sucesiva de la exposición química de TNBS para dañar el epitelio del ratón causa ulceraciones profundas e induce el desarrollo de fibrosis. Con una inducción fiable, de bajo costo y rápida de la aparición de la enfermedad, este método es ampliamente aceptado por múltiples grupos de investigación involucrados en estudios para lesiones tisulares, inflamación transmural y el eje intestino-cerebro.

Para implementar con éxito el modelo de fibrosis TNBS, hay varios pasos esenciales. Por ejemplo, dosis adecuada y tiempo de administración de TNBS son muy importantes. Una inoculación TNBS de 6-8 semanas permite ulceración de tejido profundo y es muy recomendable para estudios fibrosos crónicos. Las heces que salen de ratones y el reflejo retrógrado de la TNBS inoculada son dos problemas principales, que podrían resultar en la administración de dosis variables a ratones. Una presión suave cerca del recto de los ratones puede ayudar a liberar las heces antes de la administración de TNBS. Mantener la cabeza del animal hacia abajo durante unos segundos ayuda dramáticamente a detener el reflujo inverso de TNBS. Mantener a los ratones en una jaula, colocar la jaula en una almohadilla de calor y proporcionar a los ratones con néctar Napa también podría ser una estrategia útil para prevenir la alta mortalidad.

Aquí, también discutimos la inflamación intestinal durante la fibrosis TNBS y su impacto en la respuesta fibrosa. El papel de mTOR/autofagia está ampliamente implicado en la homeostasis intestinal y en la patogénesis de la EII20,21. Identificamos que la señalización mTOR/autofagia es fundamental para modular las respuestas proinflamatorias de las citoquinas IL-23 e IL1 de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares que afectan al eje PRO-fibrosico IL-23/IL-22(Figura 3A9 ) . De este modo, la purificación de células mononucleares Cx3Cr1+ para inmunoperfilado y expresión génica es un paso crítico del modelo. Discutimos en detalle el protocolo para aislar lapropería de láminas y proporcionamos el procedimiento de purificación para cx3Cr1+ células mononucleares utilizando cuentas magnéticas.

En conjunto, a pesar de la presencia de modelos genéticos y espontáneos para la enfermedad de Crohn, la tnBS-colitis sigue siendo una herramienta potente para estudiar la inmunopatogénesis de la CD y tiene el potencial de evaluar los tratamientos de fibrosis de Crohn. La principal limitación del uso de modelos de fibrosis inducidas químicamente como TNBS es la posibilidad de una alta variabilidad de usuario a usuario y la posibilidad de valores atípicos en los datos. Un tamaño de muestra de 5-8 animales por grupo junto con una mayor experiencia de usuario puede aumentar la consistencia del modelo. Sin embargo, encontrar un modelo genético adecuado que cause fibrosis espontánea de Crohn es y siempre estará justificado.

Divulgaciones

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Intereses en competencia: Los autores no declaran intereses competidores.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la concesión NIH R01NS093045 (Y.H.), la beca NIH K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), y The Crohn's & Colitis Foundation of America research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-ratón aSMA, AF488 conjugado, Clon#1A4e-bioscience53-9760-82
Anti-ratón aSMA, purificado Clon#M1/77e-bioscience149760-80
Anti-ratón CD11b, APCCy7 conjugado, Clon#M1/70Biolegend Inc101226
Anti-ratón CX3cr1 PE conjugado, Clon#SA011F11Biolegend149006
Anti-ratón bloque CD16/32 Fc purificadoBiolegend Inc14-9760-80
MicroBeads anti-PEMiltenyi130-105-639
Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRPe-bioscience7074
Albúmina sérica bovinaInvivoGentlrl-isdn
Colagenasa tipo IVRoche1088866001
DAPISIGMAD9542
DMEMCorning10013-CV
DNasa I de páncreas bovinoRocheD263-5vl
Falcon® 40µ m Filtro de célulasCorning352340
Kit de solución de fijación/permeabilización con BD GolgiKit PlugBD Bioscience555028
FlowJoFlowJo LLCa href="http://www.flowjo.com/">www.flowjo.com
GlycogenRoche10901393001
Cabra anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-Conejo, Alexa Fluor 488 conjugadoe-bioscience5018
Graphpad Prism 7GraphPad Software Incwww.graphpad.com
H& E kitAmerican Mastertech KitHXMMHPT
Imagen JNIHa href="http://www.imagej.nih.gov/ij/">www.imagej.nih.gov/ij/
Mouse: C57BL/6JJackson Laboratories664
MS ColumnasMiltenyi130-042-201
PercolGE Healthcare17-0891-01
PMA/ Sal de ionomicinaSigmaP8139
PowerUp SYBR Mezcla Maestra VerdeThermofisherA25777
Conejo Anti ratón GAPDH, Clon # D16H11Señalización celular5174
Conejo Anti ratón p70 S6 Quinasa, clon # 49D7Señalización celular2708
Conejo Anti ratón Phospho-p70 S6 quinasa, clon # S371Señalización celular9208
Conejo Anti ratón Fosfo-S6 Proteína ribosómica (Ser235/236), clon# D57.2.2ESeñalización celular4858
Conejo Anti ratón S6 Proteína ribosómica Señalizacióncelular2217
RapamicinaLC LABORATORIES1003799
TNBSSigma 92823
Kit de tinción TricordmeAmerican Mastertech KitSTOSTBPT
Tecnologías TRIzolLife15596018
Verso Kit de Síntesis de ADNcThermofisherAB1453B
Zen negro 2.1Carl Zeisswww.zeis.com
Zen blue lite 2.3Carl Zeisswww.zeis.com
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Referencias

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Modelo TNBStratamiento con rapamicinaaislamiento de c lulas Cx3cr1an lisis por citometr a de flujoactina de m sculo liso alfadeposici n de col genoclasificaci n celular activada magn ticamentean lisis de citocinasWestern blot

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