Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Resumen

Nuestro objetivo general es entender cómo las células detectan señales extracelulares que conducen al crecimiento axonal dirigido. Aquí, describimos la metodología de la Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas, utilizada para producir micropatrones definidos de componentes de matriz extracelular con el fin de estudiar eventos específicos que rigen el crecimiento de axón y la búsqueda de rutas.

Resumen

Las células detectan una variedad de señales extracelulares, incluyendo la composición y geometría de la matriz extracelular, que es sintetizada y remodelada por las propias células. Aquí, presentamos el método de Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas (LIMAP) utilizando el sistema PRIMO como una técnica de patrón para producir sustratos de matriz extracelular micro-patrón (ECM) utilizando una sola o combinación de proteínas. El método permite la impresión de patrones ECM en resolución de micras con excelente reproducibilidad. Proporcionamos un protocolo paso a paso y demostramos cómo esto se puede aplicar para estudiar los procesos de búsqueda de trayectoria neuronal. LIMAP tiene ventajas significativas sobre los métodos de microimpresión existentes en términos de la facilidad de patrón de más de un componente y la capacidad de generar un patrón con cualquier geometría o gradiente. El protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la contribución de casi cualquier componente químico hacia el destino celular y el comportamiento celular. Por último, discutimos los problemas comunes que pueden surgir y cómo se pueden evitar.

Introducción

En los últimos años, las ciencias biológicas han hecho cada vez más uso de los avances proporcionados por las ciencias materiales. Un ejemplo destacado es el micro-patrón de sustratos, que se puede utilizar para estudiar las respuestas celulares como la proliferación celular^1,2Diferenciación^3,4,5,6, migración celular^7,8,9y búsqueda de caminos^10,11. Hay una serie de técnicas disponibles que permiten el micro-patrón de sustratos, tales como fotoquímica excitada multifotón¹², Nanolitografía afm dip-pen¹³, impresión directa de pin e inyección de tinta¹⁴, litografía de haz de electrones¹⁵o microfluidos¹⁶. Sin embargo, dos técnicas que se utilizan ampliamente en el campo biológico son la impresión de microcontactos^17,18,19o patrones asistidos por láser³(Figura 1). El patrón asistido por láser se considera para ofrecer resultados más confiables en términos de estabilidad de proteínas y PEG y confinamiento celular en los patrones, en comparación con la impresión de microcontactos²⁰. Un enfoque más novedoso para el micro-patrones descrito aquí es el uso de la adsorción molecular inducida por la luz de las proteínas²¹(LIMAP,Figura 1 D) utilizando un sistema disponible comercialmente (PRIMO,Tabla de materiales). Cada uno de los métodos tiene ventajas y limitaciones que se describen brevemente a continuación. La impresión de microcontactos utiliza moldes PDMS (sellos) con microfunciones deseadas que se generan a partir de maestros litografiados. Los sellos se incuban con una proteína elegida que luego se transfiere (estampada) al sustrato de cultivo celular¹⁸(Figura 1 Un). El patrón asistido por láser utiliza luz UV para cleave una película antiincrustante^22,23,24,25, exponiendo regiones que posteriormente pueden ser recubiertas con la proteína de interés (Figura 1 B). Si bien la resolución alcanzada con enfoques de fotopatrones está en el rango de micras^25,26, la mayoría de estas técnicas requieren una foto-máscara, ya sea en contacto con la muestra, o situada en el plano del objeto del objetivo del microscopio^23,27,28. Los requisitos para las máscaras tanto en la impresión de microcontactos como en el patrón fotográfico pueden ser una limitación; máscaras específicas son necesarias para cada patrón geométrico y tamaño, que puede ser costoso y lento para generar. A diferencia de estas técnicas, LIMAP no requiere una máscara (Figura 1 D). El uso del sistema PRIMO para LIMAP puede ser intensivo en costos al principio porque requiere la compra de equipos. Sin embargo, el software de código abierto se utiliza para diseñar patrones de cualquier geometría deseada, dando mucha más libertad y permitiendo experimentos más complejos, incluyendo el uso de gradientes de concentración de proteínas. El láser PRIMO es controlado y dirigido por un dispositivo de microespejo controlado digitalmente (DMD) para crear patrones en cualquier número de geometrías definidas por el usuario. LIMAP requiere que la superficie de cultivo esté recubierta con moléculas que impidan la unión celular. El polietilenglicol (PEG) se utiliza más comúnmente como un reactivo "antifouling"; forma una película antiadhesiva densa en la superficie de vidrio o plástico²⁹. Posteriormente, se añade un fotoiniciador que permite retirar la película PEG con alta precisión a través de un mecanismo de fotocissión³⁰por la exposición local a la luz UV bajo el control del DMD. Estas regiones libres de PEG pueden ser recubiertas con proteínas que se adsorban a la superficie grabada con láser, generando un micro-patrón. Al variar la potencia del láser, se pueden eliminar diferentes cantidades de PEG de la superficie permitiendo al usuario generar gradientes de proteína. La eliminación de PEG y el procedimiento de recubrimiento se pueden repetir para crear patrones con dos o más proteínas distintas en el mismo micropozo²¹. Los micropatrones generados proporcionan superficies adhesivas para las células, lo que permite el estudio del comportamiento celular. En nuestros estudios, utilizamos micropatrones para estudiar la neurita o la búsqueda de axón de una línea celular neuronal (CÉLULAs CAD (Cathecholaminergic-a diferenciadas)³¹) o neuronas ganglios de raíz dorsal de rata primaria (DRG), respectivamente. Aquí, delineamos un protocolo paso a paso para LIMAP (Figura 2) utilizando el sistema PRIMO disponible comercialmente y el software Leonardo que lo acompaña. Demostramos cómo se puede utilizar para la generación de patrones con geometrías definidas y múltiples proteínas, que utilizamos para estudiar la búsqueda de rutas axonales. Discutimos los problemas comunes que pueden surgir y cómo se pueden evitar.

Protocolo

1. Diseño de plantillas de patrones

NOTA: Las plantillas para el patrón se generan con el software de dibujo digital(Tabla de materiales). Dibujar en diferentes niveles de gris determinará las intensidades del láser. El uso de software para diseñar plantillas de patrones permite la generación rápida de patrones con cualquier geometría y degradados deseados(Figura 3).

1. Dibuje digitalmente la plantilla de patrón deseada utilizando el software de dibujo. Seleccione un tamaño de imagen de 1824 píxeles de longitud y 1140 píxeles de ancho (que en este estudio corresponde a 415 m de longitud y 260 m de ancho). Guarde la plantilla de patrón como un archivo Tiff de 8 bits.
   NOTA: un protocolo paso a paso para generar plantillas está disponible a petición de la marca que comercializa el equipo de micropatrones(Tabla de materiales).

2. Limpieza de plasma

NOTA: Los resultados óptimos requieren una limpieza plasmática de las superficies antes del patrón, lo que eliminará toda la materia orgánica y activará la superficie. En el caso de autos, el aire ambiente es suficiente para la activación de la superficie. Se utilizó un limpiador de plasma(Tabla de materiales)con una presión de proceso de 1000-1300 mTorr y una potencia de 29,6 W durante 1-5 min.

1. Utilice platos de fondo de vidrio con un tamaño de pozo interior de 20 mm y un espesor de vidrio de 0,16-0,19 mm. Para probar múltiples condiciones, utilice un plato inferior de vidrio de 6 pozos. De lo contrario, utilice un solo plato inferior de vidrio de pozo(Tabla de materiales).
   NOTA: Un protocolo paso a paso para la limpieza de plasma está disponible bajo petición de la marca que comercializa el equipo de limpieza de plasma(Tabla de materiales).

3. Pasivación

NOTA: Este paso genera una película antifouling que evita la adsorción de proteínas a la superficie de vidrio. PEG ofrece alta resistencia a la adsorción de proteínas²⁹ como agente antifouling. LIMAP utiliza un fotoiniciador para eliminar localmente PEG a través de la fotocissión UV. Las proteínas/s de interés se adsorbe a estas superficies libres de PEG^21,generando micropatrones.

1. Pasivación con PLL-PEG
   1. En condiciones estériles, corte las plantillas PDMS (consulte la Figura 4A,B y la Tabla de Materiales)para asegurarse de que caben bien en el fondo interior del vidrio y retire los rellenos internos de micropozos con fórceps estériles. Pegue plantillas en el vidrio usando fórceps.
   2. Asegúrese de que las plantillas se peguen firmemente en el pozo de vidrio, evitando la formación de burbujas de aire que pueden causar fugas durante el proceso de pasivación.
      NOTA: Las plantillas PDMS también se pueden fabricar internamente utilizando los protocolos publicados^18,32.
   3. Preparar la solución PLL-PEG(Tabla de materiales,0,1 mg/ml) en solución salina con búfer de fosfato (PBS). Añadir 20 ml de solución PLL-PEG a cada micropozo e incubar a temperatura ambiente, durante 1 h.
   4. Retirar 15 l de PLL-PEG de los micro-pozos y lavarlos cinco veces con 20 s de PBS(Tabla de Materiales)sin dejarlos secar.
      NOTA: Deje siempre aproximadamente 5 s de PBS entre lavados. Dado su pequeño volumen, los micro-pozos son particularmente susceptibles al secado. El secado dará lugar a micropatrones de mala calidad.
   5. Mantenga el plato de cultivo en PBS (3 ml por pozo) a 4 oC durante un máximo de 3 días o continúe con el siguiente paso (paso 3.1.5).
   6. Retire 18 ml de PBS de un solo micro-pozo (por ejemplo, el micro-pozo superior izquierdo, ver Figura 4D), agregue 5 l de fotoiniciador (PLPP, Tabla de materiales)y deje 20 l de PBS en los micropozos restantes. Este micropozo con PLPP se utilizará para crear un patrón de referencia (véase la figura 4D,E)durante el paso de calibración del sistema (paso 4). Mantenga el PLPP protegido de la luz.
2. Pasivación con PEG-SVA de larga duración
   NOTA: Para generar la superficie antiadhesiva se puede utilizar: 1) un PEG vinculado a poli-L-lisina (PLL-PEG, paso 3.1) o 2) un PEG-succinate N-hidroxisuccinimida (PEG-SVA). La decisión de elegir una u otra opción de pasivación depende de las opciones de almacenamiento (consulte el paso 10). Los platos de cultivo incubados con PEG-SVA requieren la doble cantidad de tiempo de pasivación y fotopatrón.
   1. Prepare las plantillas como se describe en el paso 3.1.1.
   2. Añadir 20 l de poli-l-lisina al 0,01% de poli-l-lisina (PLL, Tabla de materiales)a cada micropozo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para pre-recubrir con PLL.
   3. Retire 15 ml de PLL de los micropozos y lávelos tres veces con 20 ml de búfer HEPES de 1 M(Tabla de materiales)sin dejar que los pozos se sequen.
      NOTA: Deje siempre aproximadamente 5 s de HEPES o PBS entre lavados. Dado su pequeño volumen, los micro-pozos son particularmente susceptibles al secado. El secado dará lugar a micropatrones de mala calidad.
   4. Prepare la solución PEG-SVA. La solución de PEG-SVA (50 mg/ml en el tampón HEPES 1M) debe prepararse fresca cada vez inmediatamente antes de su uso. Preparar 20 ml de PEG-SVA por micropozo.
   5. El tampón HEPES debe tener un pH entre 8-8.5. Pruebe el pH de HEPES antes de preparar la solución PEG-SVA con papel de pH. Pesar PEG-SVA en un tubo centrífugo utilizando una báscula de precisión. Añadir búfer HEPES y vórtice 30 s hasta que se disuelvan. PEG-SVA se disuelve completamente cuando la solución es transparente.
      NOTA: SVA es el éster que permite la unión de PEG al PLL previamente recubierto. Una vez que el buffer HEPES se agrega al PEG-SVA, el SVA tiene una vida media de 15 min y se debe utilizar inmediatamente.
   6. Añadir 20 l de solución PEG-SVA a cada micropozo e incubar a temperatura ambiente, durante 1 h. Retirar 15 ml de PEG-SVA de los micropozos y lavar cinco veces con 20 ol de PBS(Tabla de materiales)sin dejar que los pozos se sequen.
   7. Prepare el plato de cultivo para el almacenamiento a largo plazo (hasta 1 mes, consulte el paso 10.2) o continúe con el siguiente paso (paso 3.2.8).
   8. Retire 18 ml de PBS de un solo micro-pozo (por ejemplo, el micro-pozo superior izquierdo, ver Figura 4D), agregue 5 s de PLPP(Tabla de materiales)y deje 20 l de PBS en los micropozos restantes. Este micro-pozo se utilizará para crear un patrón de referencia (ver Fi gure 4D, E). Asegúrese de que el PLPP sea homogéneo en toda la superficie del micropozo. Mantenga el PLPP protegido de la luz.

4. Calibración del sistema

NOTA: En estos pasos, el enfoque del láser se ajustará al tipo particular de plato de cultivo (paso 4.1). Se generará un patrón de referencia en un solo micropozo (paso 4.2) seguido de incubación con una solución proteica (paso 4.3) para garantizar las condiciones óptimas de enfoque del láser (paso 4.4), necesaria para obtener patrones nítidos y definidos.

1. Calibración láser
   NOTA: Durante el proceso de calibración, se proyectará una imagen láser de calibración sobre una superficie de vidrio resaltada fluorescentemente (pozo de calibración, marcado con un resaltador fluorescente, Figura 4C),que debe centrarse en el Microscopio.
   1. Utilice un resaltador fluorescente(Tabla de materiales)para marcar un pozo de vidrio interior vacío.
      NOTA: El pozo de calibración debe tener el mismo espesor de vidrio (0,16-0,19 mm) que la placa de cultivo en la que se generarán micropatrones. Si se utiliza un plato inferior de vidrio de 6 pozos, se puede utilizar un pozo vacío para la calibración y debe estar marcado con resaltador fluorescente en condiciones estériles.
   2. Encienda el microscopio, el escenario y el ordenador. Encienda el equipo de micropatrones PRIMO, abra el microadministrador y el software Leonardo. El software Leonardo se opera a través de Micro-manager en Plugins. Consulte los números de marcas/catálogos de equipos y software en Tabla de materiales.
   3. En el menú inicial de Leonardo, seleccione Calibrar. Compruebe que el cubo de filtro PRIMO dedicado está en la posición correcta (ruta óptica) en la torreta del filtro; seleccionar el objetivo 20X (0,75 DIC S Plan Fluor, sin anillo de fase) tanto en el microscopio como en el software Leonardo.
      NOTA: Este protocolo se ajusta a la versión 4.4 de Leonardo. Es posible que el protocolo deba ajustarse para otras versiones.
   4. Coloque el pozo de calibración resaltado anteriormente(Figura 4C)por encima del objetivo. Seleccione la ruta de la cámara. Ajuste el enfoque objetivo hasta que la proyección láser del logotipo primo y la línea de etiqueta Tenga cuidado de sus células en el foco.
   5. Deje el tiempo de exposición predeterminado de la cámara a 25 ms. Ajuste la intensidad del láser para ver la letra I de la proyección del logotipo PRIMO en color gris y el resto de las letras en blanco.
   6. Registre la posición Z del plano focal (altura del objetivo de la muestra) más adelante conocida como posición Z de calibración. Esto será una aproximación al enfoque óptimo obtenido después de la generación del patrón de referencia (ver paso 4.2-4.4).
2. Patrón de referencia
   1. Coloque el plato de cultivo con el micro-pozo que contiene el foto-iniciador (patrón de referencia micro-pozo, Figura 4D) por encima del objetivo y seleccione Patrón ahora en el software Leonardo.
   2. Visualice el borde del micropozo con luz transmitida a través de la cámara y elija el símbolo de ROI en el menú de la derecha. Establezca el diámetro del círculo de ROI en 4000 m y alinee el borde del ROI digital con el borde del micropozo actual.
   3. Asegúrese de que haya una superposición precisa entre el ROI digital y el micropozo actual moviendo la etapa alrededor de los bordes del micropozo. La posición del ROI se acoplará a los movimientos del escenario.
   4. Seleccione Bloquear en el software Leonardo para bloquear el ROI en la posición deseada. Apague la luz transmitida.
   5. Seleccione PRIMO para cargar la plantilla de patrón deseada, que se proyectará en el ROI como una unidad de diseño (consulte la figura 5). Los patrones aparecerán en una lista desplegable denominada Acciones y se mostrarán en el menú Acciones del software.
      NOTA: Las plantillas de patrón deben diseñarse previamente (consulte el paso 1) y guardarse como un archivo Tiff de 8 bits antes de cargar la plantilla en el software.
   6. Sólo se necesita un patrón pequeño para el patrón de referencia; por ejemplo, 3 líneas, 1 columna (véase el cuadro 4E y el cuadro 5B). En el menú Replicación, establezca el número deseado de columnas y filas(Líneas en el software Leonardo). Haga clic en Actualizar para observar una vista previa digital del diseño del patrón.
   7. Establezca la dosis láser en el menú Replicación. La dosis láser óptima en este ajuste y utilizando PLL-PEG es de 1390 mJ/mm².
      NOTA: La potencia del láser puede variar entre 5-7,5 mW/mm². En este caso, es de 7,5 mW/mm^2,que tarda aproximadamente 30 s en domatrónizar cada unidad de diseño, utilizando una dosis láser de 1390 mJ/mm². Se pueden requerir dosis láser más altas si la superficie del plato de cultivo se pasiva con PEG-SVA (aproximadamente dosis láser doble en comparación con PLL-PEG). Esto debe ser probado de antemano.
   8. Navegue a una región periférica del micropozo, (por ejemplo, la parte superior) lejos de la región principal de interés para la generación de patrones (región central) del micropozo (véase la figura 4E)y seleccione Bloquear. Espere hasta que se muestre el patrón.
   9. Ajuste el enfoque a la posición Z de calibración (consulte el paso 4.1.6).
      NOTA: Se recomienda realizar un paso de calibración adicional del sistema si otro usuario está utilizando el mismo microscopio entre las rondas de fotopatrón.
   10. Seleccione el símbolo Reproducir para iniciar el patrón. Asegúrese de que el láser esté encendido en el software. Espere hasta que finalice el proceso de patrón. La duración del patrón se mostrará en el panel Tiempo estimado. En la versión 4.4 del software Leonardo, el patrón se completa cuando todas las acciones aparecen en azul en el menú Visualización.
3. Incubación de proteínas en el patrón de referencia
   1. En condiciones estériles, lave el patrón de referencia micropozo tres veces con 20 s de PBS para extraer el PLPP.
   2. Añadir 20 l de proteína ECM con etiqueta fluorescente (10 g/ml de laminina, fibronectina o fibrinógeno en PBS, ver Tabla de materiales y paso 6) al patrón de referencia micropozo. Incubar a temperatura ambiente durante 10-20 min (dependiendo de la proteína) protegido de la luz (envuelva el plato en papel de aluminio).
   3. Después de la incubación, retirar 18 ml de solución proteica y lavar tres veces con 20 s de PBS; mantener los micro-pozos que no se utilizan para crear un patrón de referencia (véase la figura 4D,E) en 20 l de PBS.
4. Visualización y configuración de enfoque láser óptimo
   1. Visualice el patrón de referencia utilizando un microscopio de epifluorescencia, un objetivo 20X y un software adecuado (consulte el software utilizado en este estudio en Tabla de materiales). El patrón de referencia debe ser visible en la región periférica (por ejemplo, la región de pozo superior), en la que se generó el patrón de referencia (consulte la figura 4E).
   2. Ajuste el enfoque en los bordes del patrón a través de la trayectoria de la cámara. Registre la posición Z de acuerdo con el mejor enfoque en el patrón de referencia. Esta posición Z ajustada será el enfoque láser óptimo utilizado para el patrón posterior.

5. Configuración de software y fotopatrón

NOTA: Una vez lograda la calibración del sistema (paso 4), el usuario cargará las plantillas de patrón deseadas (configuración de plantilla, Figura 5)para fotopatrones, con la opción de generar patrones para una o varias proteínas en cada micro-pozo. El proceso de micropatrones implica pasos de fotopatrón e incubación de proteínas (ver Figura 2).

1. En condiciones estériles, retire 18 s de PBS de todos los micro-pozos y agregue 5 s de PLPP a cada micro-pozo. Asegúrese de que el PLPP sea homogéneo en toda la superficie de los micropozos.
2. Coloque el plato de cultivo con el patrón de referencia micro-pozo(Figura 4D,E) por encima del objetivo y seleccione Patrón ahora en el software Leonardo.
3. Visualice el micropozo con luz transmitida a través de la ruta de la cámara y elija el símbolo de ROI. Establezca el diámetro del ROI en 4.000 m y superponga el borde del ROI digital al borde del micropozo actual. Seleccione Bloquear.
   NOTA: la forma y el diámetro del ROI dependen del diseño y el tamaño de la galería de símbolos PDMS que se esté utilizando. Por ejemplo, si utiliza plantillas cuadradas PDMS de 5.000 x 5.000 m, utilice un ROI cuadrado de 5.000 x 5.000 m.
4. Repita el paso de superposición (paso 5.3) para cada micro-pozo del plato. Al finalizar, apague la luz transmitida.
5. Navegue hasta el centro del micropozo del patrón de referencia, lejos de la región del patrón de referencia, y seleccione PRIMO para cargar la plantilla de patrón deseada, que se proyectará en el ROI como una unidad de diseño (consulte la figura 5). Los patrones aparecerán en una lista desplegable denominada Acciones y se mostrarán en el menú Acciones del software.
   NOTA: Las plantillas de patrón deben diseñarse antes del experimento y guardarse como un archivo Tiff de 8 bits antes de cargar la plantilla en el software.
6. Para crear un patrón en todo el micropozo, la unidad de diseño necesita ser replicada. Una unidad de diseño cubre alrededor de 0,1 mm² de la zona de micropozos. En el menú Replicación, establezca el número deseado de columnas y filas(Líneas en el software) (consulte la figura 5).
7. Para generar un patrón continuo, ajuste el espaciado entre columnas y líneas; en este estudio, los patrones de rayas continuas se obtienen utilizando el espaciado de -20 a -35 m (espaciado negativo) entre columnas. Este espaciado negativo crea una superposición entre las unidades de diseño(Figura 5B,C).
8. Establezca la dosis láser en el menú Replicación. La dosis láser óptima en este ajuste y utilizando PLL-PEG es de 1390 mJ/mm². La duración del patrón se mostrará en el panel Tiempo estimado.
   NOTA: En este caso, la potencia del láser es de 7,5 mW/mm^2,tardando aproximadamente 30 s en el patrón de cada unidad de diseño, utilizando una dosis de 1390 mJ/mm². Por ejemplo, una unidad de diseño (0,1 mm²) replicada en 4 columnas y 4 líneas (alrededor de 1,6 mm²), tardaría 8 minutos en ser modelada. Se pueden requerir dosis láser más altas si la superficie del plato de cultivo se pasiva con PEG-SVA (aproximadamente dosis láser doble en comparación con PLL-PEG).
9. Seleccione Bloquear y espere hasta que el patrón se muestre virtualmente.
10. Para actualizar los parámetros de un patrón, haga clic en la Acciónrelacionada y, a continuación, desbloquee y actualice los parámetros. Seleccione Bloquear de nuevo cuando se complete la actualización del patrón.
11. El patrón de múltiples proteínas en el mismo micropozo (rondas secuenciales de micro-patrón) requiere una alineación precisa de los patrones. Para lograr dicha alineación, cargue todos los conjuntos de plantillas de patrón deseadas simultáneamente (patrones de primera y segunda rondas de fotopatrón).
12. Establezca los parámetros de replicación y dosis de las plantillas de patrón. Una vez establecidos los parámetros, los patrones aparecerán como Acciones en la lista Acciones. Guarde esta configuración de plantilla como archivo en el software (consulte la figura 5D).
13. En la lista Acciones, seleccione solo las acciones específicas que se deben patrones durante la primera ronda de patrones y anule la selección de las acciones que se modelarán durante la segunda ronda de patrones (consulte la figura 5D).
14. Navegue hasta el área donde se produjo el patrón de referencia en el paso 4.2 (por ejemplo, la región superior del micropozo del patrón de referencia, véase la Figura 4E). Ajuste el enfoque a la posición Z óptima (obtenida en el paso 4.4).
    NOTA: Se recomienda encarecidamente seleccionar un sistema de enfoque perfecto en el microscopio que se está utilizando (si está disponible), lo que garantiza que la posición Z óptima para el patrón se mantendrá durante todo el proceso de fotopatrón.
15. Seleccione el símbolo Reproducir para iniciar el patrón. La duración del patrón se mostrará en el panel Tiempo estimado. En la versión 4.4 del software Leonardo, el patrón se completa cuando todas las acciones aparecen en azul en el menú Visualización.

6. Incubación de proteínas

NOTA: Los micropozos se incuban con proteínas ECM (preferiblemente etiquetadas fluorescentemente). Estos sólo se unirán a las áreas donde PEG fue atravesado a través del proceso de fotopatrón descrito en el paso 5. Cada pozo contiene una plantilla PDMS con 4 micro-pozos, lo que permitirá probar 4 condiciones diferentes simultáneamente, por ejemplo, la incubación de una proteína diferente en cada micropozo (ver Figura 4D).

1. Utilice proteínas etiquetadas fluorescentes (por ejemplo, laminina, fibronectina o fibrinógeno conjugado a fluoróforos rojos o verdes) para visualizar los micropatrones (ver paso6 6.7 y 9.4). Alternativamente, las proteínas no etiquetadas adsorbidas se pueden visualizar en etapas posteriores utilizando inmunofluorescencia.
   NOTA: Las proteínas ECM (por ejemplo, la fibronectina) pueden etiquetarse utilizando los protocolos^{existentes 33} y los kits de etiquetado de fluorescencia disponibles en el uso comercial (es decir, el kit de etiquetado Alexa 488), o comprarse fácilmente etiquetados (por ejemplo, fibrinógeno conjugado-488 o rodamina fluorescente de color rojo laminino, véase Tabla de materiales).
2. En condiciones estériles, prepare la concentración deseada de proteínas ECM (10 g/ml de laminina, fibronectina o fibrinógeno en PBS, véase Tabla de materiales y paso 4.3).
   NOTA: Las proteínas ECM con etiqueta fluorescente son sensibles a la luz y deben protegerse de la luz (envolver el plato en papel de aluminio) y deben mantenerse en hielo en todo momento.
3. En condiciones estériles, lave los micropozos tres veces con 20 ml de PBS para extraer el PLPP.
4. Retire 18 ml de PBS de todos los micro-pozos y agregue 20 l de solución de proteína ECM a cada micro-pozo. Incubar a temperatura ambiente, durante 20-30 min y proteger la luz.
   NOTA: Los tiempos óptimos de incubación del recubrimiento pueden variar dependiendo del tipo y la concentración de proteínas.
5. Después de la incubación, retire 15 l de solución proteica ECM y lave los micro-pozos tres veces con 20 s de PBS.
   NOTA: Deje siempre aproximadamente 5 s de PBS entre lavados.
6. Si se modela con una sola proteína (una ronda de micro-patrón), proceda al almacenamiento de la placa de cultivo (paso 10) o al revestimiento celular (paso 11, y vea la Figura 2). Si realiza una segunda ronda de micropatrones con una proteína diferente en el mismo micropozo, proceda al almacenamiento de la guarnición de cultivo (paso 10) o a bloquear sitios de unión inespecíficos (paso 7, y consulte la Figura 2).
7. Paso de control de calidad opcional: visualice e imagen patrones impresos utilizando un microscopio de epifluorescencia antes de las células de chapado. Seleccione los canales fluorescentes adecuados y ajuste los tiempos de exposición en consecuencia.
   NOTA: Para comparar la intensidad de fluorescencia de los patrones entre experimentos, es esencial utilizar los mismos tiempos de exposición para las mismas proteínas.

7. Bloqueo de sitios de unión inespecíficos (solo para múltiples patrones de proteínas)

NOTA: El micropatrón con múltiples proteínas en el mismo micropozo implica pasos de patrón secuenciales (consulte la figura 2). Se añade un agente bloqueador (PLL-PEG o BSA) a los micropozos para evitar la unión cruzada, que se produce cuando la segunda proteína incubada (paso 9) se une a la primera proteína incubada (paso 6), evitando así una mezcla de proteínas dentro de los patrones.

1. En condiciones estériles, agregue 20 s l de PLL-PEG (0,1 mg/ml en PBS) o BSA (1% De BSA en PBS) como paso de bloqueo para evitar la unión cruzada.
   NOTA: La eficiencia del bloqueo puede variar dependiendo de la naturaleza de las proteínas que se utilizan y la afinidad entre ellas. Se recomienda probar PLL-PEG y BSA como agentes de bloqueo de antemano(Figura 10D-I).
2. Incubar el agente bloqueador a temperatura ambiente durante 1 h y protegerlo de la luz. Retire 15 s de agente bloqueador y lave todos los micropozos tres veces con 20 ml de PBS. Deje siempre aproximadamente 5 s de PBS entre lavados.
3. Retire 18 ml de PBS de todos los micro-pozos y agregue 5 s de PLPP a cada micro-pozo, asegurando que el PLPP sea homogéneo en toda la superficie de los micro-pozos.

8. Segunda ronda de fotopatrón (sólo para múltiples patrones de proteínas)

NOTA: Después de la primera ronda de fotopatrón e incubación de proteínas, se genera un micropatrón. Durante la segunda ronda de fotopatrón, el patrón de la segunda proteína se generará en el mismo micropozo (ver Figura 2C y Figura 5D). En el software, seleccione las plantillas de patrón correctas (acciones), que se modelarán durante esta ronda (consulte la figura 5D).

1. Navegue al primer micro-pozo(Figura 4D). Garantice una superposición adecuada entre el ROI digital y el micropozo.
2. Cargue la configuración de plantilla guardada anteriormente (paso 5.12) y seleccione las acciones que se van a crear el patrón durante la segunda ronda de fotopatrones (deseleccione las acciones de la primera ronda, consulte la figura 5D).
3. Seleccione el símbolo Reproducir para iniciar el patrón. Asegúrese de que el láser esté encendido en el software.

9. Segunda ronda de incubación de proteínas (solo para múltiples patrones de proteínas)

NOTA: En esta parte del protocolo, las proteínas con etiqueta fluorescente se incubarán en el plato de cultivo después de la segunda ronda de fotopatrón.

1. En condiciones estériles, lave el micropozo tres veces con 20 ml de PBS para extraer el PLPP. Retire 18 ml de PBS y agregue 20 ml de solución de proteína ECM a cada micropozo. Incubar a temperatura ambiente durante 20-30 min y proteger de la luz.
   NOTA: Los tiempos óptimos de incubación del recubrimiento pueden variar dependiendo del tipo y la concentración de proteínas.
2. Después de la incubación, retire 15 l de solución proteica ECM y lave los micro-pozos tres veces con 20 s de PBS. Deje siempre aproximadamente 5 s de PBS entre lavados.
3. Proceda al almacenamiento de la placa de cultivo (paso 10) o al revestimiento de celdas (paso 11, y vea la Figura 2).
4. Paso de control de calidad opcional: utilizando un microscopio de epifluorescencia, visualice e imagen patrones impresos antes de las células de chapado. Seleccione los canales fluorescentes adecuados y ajuste el tiempo de exposición.
   NOTA: Para comparar la intensidad de fluorescencia de los patrones entre experimentos, es esencial utilizar los mismos tiempos de exposición para las mismas proteínas.

10. Almacenamiento de micropatrones

NOTA: Los micropatrones con proteínas adsorbidas se pueden almacenar durante diferentes pasos del protocolo (consulte la figura 2). Si el micropatrón con múltiples proteínas, los micropatrones se pueden almacenar después de la primera ronda de micropatrones o después de que se hayan completado las dos rondas secuenciales de micropatrones (véase la figura 2B).

1. Cuando se pasa por pasivacon PLL-PEG, almacene los micropatrones en PBS (3 ml por pozo) a 4 oC durante un máximo de 3 días.
2. Si el plato de cultivo se pasó con PEG-SVA, se pueden almacenar micropatrones durante un máximo de 1 mes. Para ello, enjuague los micropatrones de forma intensiva con agua desionizada doble destilada y séquelos con una pistola de aire estéril de argón o nitrógeno, aunque también se puede utilizar aire normal. Después del secado, los micropatrones se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes (equipo de soporte del sistema PRIMO, comunicación personal).

11. Células de chapado

NOTA: Durante los siguientes pasos, las células se enchaparán en los platos de cultivo micro-patrón preparados. En estos estudios, se utiliza una línea celular neuronal (células CAD)³¹. Sin embargo, este protocolo se puede ajustar para estudiar otros tipos de actividad celular (ajustar el protocolo de chapado de celdas según sea necesario).

1. Diferenciar las células CAD durante 48 horas utilizando un medio de diferenciación (DMEM complementado con 1% de glutamina, sin suero, y con 1% Pluma/Estreptococo, ver Tabla de Materiales).
2. Placa 1 mL de medio con células en el pozo de vidrio interior, cubriendo todos los micro-pozos y colocar el plato de cultivo en una incubadora de 37oC, 5%_CO2.

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior resulta en superficies micro-patrón, recubiertas con proteínas ECM de interés. Estamos usando estos patrones para rastrear la búsqueda neuronal.

Los patrones generados deben ser una representación precisa de la plantilla. Un ejemplo se muestra en la Figura 6, donde una plantilla de patrón digital(Figura 6A) que representa una unidad de diseño(Figura 5B), dio como resultado micropatrones definidos, que van de 20 a 2 m de ancho, recubiertos con Fibrinógeno(Figura 6B). Usando ImageJ, las mediciones de intensidad de fluorescencia se obtuvieron tanto verticalmente(Figura 6C)como horizontalmente(Figura 6E)a lo largo de la franja y desde una región de fondo correspondiente 15 m por encima de cada raya. Las medidas de fondo se restaban de las medidas de patrón para cada anchura de banda.

Una limitación del sistema es que se puede observar un efecto de borde(Figura 6B, franja superior) cuando las características de impresión de 20 m, con una señal de mayor intensidad en los bordes del patrón en comparación con el centro(Figura 6D, primer pico de intensidad fluorescente). En nuestros experimentos, el límite de resolución era de aproximadamente 2 m; a este ancho observamos una disminución significativa (en aproximadamente un 50%) en intensidad de fluorescencia fibrinógeno en comparación con la intensidad de las rayas más anchas(Figura 6F, G). El patrón utilizando el sistema PRIMO y el protocolo descrito aquí produjo patrones reproducibles, con la desviación estándar más alta de la intensidad fluorescente media medida para la anchura de 2 m de cuatro unidades de diseño replicadas individuales(Figura 6 G). La variación dentro de las rayas estampadas también se encontró que era baja; el coeficiente de variación osciló entre el 3 y el 10 %, con las franjas de 20 y 2 m que tenían la mayor variación interna. Esto es probable que sea el resultado del efecto de borde y el límite de resolución del sistema, respectivamente. Tenga en cuenta que para estas mediciones sólo medimos la intensidad en el centro de las rayas, para evitar la iluminación desigual resultante del objetivo utilizado para adquirir estas imágenes (viñeta, Figura 6E).

Ciertos experimentos pueden implicar preguntas que requieren concentraciones de proteínas definidas, que se pueden lograr de dos maneras: 1) variar la concentración de proteínas(Figura 7A,B). La incubación con diferentes concentraciones de laminina, da lugar a intensidades de fluorescencia significativamente diferentes, aumentando con mayores concentraciones de proteínas(Figura 7B). 2) La dosis láser que se utiliza para cleave la película antiadhesiva (PEG) puede ser variada. Las dosis láser más altas eliminarán la película antifouling en mayor medida, generando más sitios de unión para las proteínas de interés(Figura 7C,D) lo que resulta en intensidades de fluorescencia significativamente diferentes, aumentando con mayor láser dosis(Figura 7D).

La variación de la dosis láser permite la generación de gradientes proteicos dentro del mismo patrón. Esto se muestra en la Figura 8A,donde se diseñó una plantilla de degradado utilizando diferentes niveles de escala de grises, desde negro (sin potencia láser) hasta blanco (potencia láser máxima).

La intensidad del láser es proporcional al nivel de escala de grises de la plantilla (que oscila entre 0 y 255 en una imagen de 8 bits), generando gradientes de iluminación UV. La medición del perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo de la franja de degradado es lineal en la plantilla de patrón(Figura 8B)y en el patrón de degradado generado(Figura 8C,D). Esto se puede reproducir entre todas las franjas de degradado dentro de la misma plantilla y patrón de degradado(Figura 8B,D). La generación de estos gradientes es extremadamente útil y ayuda a imitar ambientes in vivo donde las células a menudo responden a gradientes de proteínas bioactivas^34,35,36,37.

Las células detectan entornos extracelulares cambiantes, pero los ensayos que permiten el estudio del comportamiento celular cuando las células encuentran tales cambios son limitados. LIMAP se puede utilizar para micro-patrón con múltiples proteínas en el mismo micro-pozo. Los ejemplos se muestran en la Figura 9, donde se generaron patrones cruzados con rayas de fibronectina (horizontal) y laminina (vertical). Al crear patrones con múltiples proteínas, es crucial utilizar un paso de bloqueo entre la primera y la segunda incubación de proteínas, para evitar la unión cruzada de proteínas (ver paso 7). La eficiencia de bloqueo puede variar dependiendo de las características bioquímicas de las proteínas que se utilizan para el recubrimiento y aconsejamos probar varios tampones de bloqueo, incluyendo PLL-PEG (0,1 mg/ml) y BSA (1%). Para evaluar este efecto de unión cruzada, realizamos mediciones de intensidad de fluorescencia utilizando ImageJ (Figura 9) y mostramos que la unión cruzada se puede reducir drásticamente, utilizando el tampón PLL-PEG (0,1 mg/ml) para la fibronectina y la minina patrones cruzados(Figura 9D,H).

Los patrones cruzados generados se utilizaron para ensayos celulares con células CAD(Figura 10A,B)o neuronas de ganglio de raíz dorsal de rata (DRG)(Figura 10C). Sus neuritas (CAD) y axons (DRG) crecen a lo largo de diferentes líneas. Las células CAD se utilizan como modelo neuronal ya que muestran un perfil de expresión de integrina similar en comparación con las neuronas primarias y todavía muestran conos de crecimiento ricos en actina después de 48 h en cultivo(Figura 10B),por lo que son adecuados para la búsqueda de rutas Estudios.

Con el fin de investigar los posibles efectos citotóxicos de los micropatrones generados hacia las neuronas primarias, las neuronas DRG fueron aisladas y cultivadas en micropatrones siguiendo un protocolo publicado previamente³⁸. Los resultados demuestran que las neuronas primarias toleran el entorno de micropatrones(Figura 10C). Actualmente estamos estudiando cómo una variedad de proteínas ECM influyen en la búsqueda de caminos axonales (neurita). La prueba preliminar de los conceptos encontrados en las células CAD se investigará más a fondo utilizando neuronas DRG. Con el fin de validar la calidad de los micropatrones generados, es deseable crear imágenes por microscopía de fluorescencia para asegurarse de que los bordes del patrón están bien definidos antes de proceder al revestimiento celular. Durante el proceso de toma de imágenes, es importante asegurar el ajuste óptico entre el microscopio y la cámara para evitar el efecto de oscurecimiento periférico (viñeta) que afecta al análisis posterior y la interpretación de los datos. Además, adquiera una imagen de una región sin patrones utilizando los mismos tiempos de exposición que se utilizarán para crear imágenes de los patrones y restar esta imagen de la imagen de patrón.

En resumen, para la generación de micropatrones de buena calidad, es aconsejable evaluar la concentración de proteínas(Figura 7A,B),dosis láser(Figura 7C,D),niveles de fondo proteico(Figura 6E,F,H) y un paso de bloqueo eficiente(Figura 9) cuando se utilizan múltiples proteínas. De manera concluyente, la calidad de los micropatrones generados con LIMAP es esencial para obtener datos fiables y reproducibles de ensayos celulares.

Figura 1: Esquema de técnicas de micropatrones: impresión por microcontacto y patrón asistido por láser. (A) La impresión de microcontacto utiliza un maestro litografiado con microfunciones definidas para generar un sello PDMS que se incuba con la proteína de interés. Esta proteína se transfiere (estampada) a una superficie de vidrio, generando micropatrones de proteínas. (B) Las técnicas de patrón asistidas por láser incluyen fotopatrón y patrón láser directo. (C) La mayoría de los enfoques de fotopatrón utilizan una fuente de luz UV y una fotomáscara (ya sea en contacto con la superficie del sustrato o en el plano focal del objetivo) con las geometrías deseadas para cleave la superficie antifouling PEG en posiciones específicas, creando un patrón definido. Un paso posterior de incubación de proteínas da como resultado la adsorción de proteínas sólo a las regiones con la serducha. (D) LIMAP es una técnica de fotopatrón que no requiere una fotomáscara en contacto con el sustrato (es decir, un enfoque sin máscara y sin contacto). LIMAP utiliza un fotoiniciador, que se activa por dosis bajas de un láser, acortar las regiones expuestas a la luz de PEG. Esto crea sitios de datos adjuntos para la adsorción secuencial de proteínas. (E) El patrón láser directo utiliza luz de alta energía para grabar directamente la película PEG, permitiendo la unión a proteínas en esas regiones grabadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Esquema que muestra un resumen de los pasos en el protocolo de micro-patrón. (A) El micropatrón con una proteína implica sólo una ronda de micro-patrones (fotopatrón e incubación de proteínas) y se puede realizar en menos de 8 h. (B) El micropatrón con múltiples proteínas requiere dos rondas secuenciales de micropatrones y se puede completar en 1-2 días, dependiendo del número de micropatrones que se están preparando. Es posible pasar por la versión B del protocolo en 1 día de trabajo. Las flechas continuas indican el flujo directo de pasos en el protocolo. Las flechas discontinuas indican que hay un intervalo de tiempo significativo entre un paso y el otro (consulte los pasos 6.6 y 9.3). (C) Vista esquemática de patrones de ejemplo obtenidos después de una ronda de micropatrones (rayas rojas) o dos rondas secuenciales de micropatrón (rayas rojas y verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La generación de plantillas de patrón es versátil con LIMAP. (A,B) Ejemplos de plantillas de patrones diseñadas con ImageJ (a ballestas, letras B). Las formas dibujadas en blanco se proyectaron con la máxima potencia láser y las formas dibujadas en negro no se proyectaron. (C,D) Micropatrones obtenidos con LIMAP a partir de plantillas después de la incubación con 10 g/ml de fibrinógeno (verde). (C) Las ballestas tienen una anchura de 50 m y una altura de 50 m espaciadas en 75 m horizontalmente y 50 m verticalmente. (D) Las letras tienen una anchura de 80 m y una altura de 85 m. Las barras de escala en C y D representan 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Materiales esenciales para el protocolo LIMAP. (A) Las plantillas utilizadas en este protocolo son piezas PDMS delgadas de forma circular de 20 mm de diámetro (250 m de espesor) que contienen 4 micropozos (4 mm de diámetro cada uno). Los volúmenes utilizados en los micropozos oscilan entre 5 y 20 l, lo que reduce considerablemente la cantidad de reactivos y proteínas necesarias para cada experimento. (B) 6 bien plato inferior de vidrio donde las plantillas ya se han colocado en cada pozo. Los micropozos contienen 20 s de PBS para hacerlos visibles. (C) Plato de calibración en el que el pozo de vidrio interior se ha marcado con un resaltador verde, que se utilizará para calibrar el enfoque láser. (D) Vista esquemática de la parte superior izquierda bien desde el plato inferior de vidrio de 6 pozos en B (esbozado con círculo rojo discontinuo). El fondo interior del vidrio está representado en blanco y la plantilla se muestra en gris. La plantilla contiene 4 micropozos (numerados 1-4), para el ensayo de 4 condiciones experimentales diferentes (por ejemplo, diferentes concentraciones de proteínas, geometrías de patrones, combinaciones de proteínas, etc.). El asterisco representa el micropozo que contiene el patrón de referencia. (E) Vista esquemática del micropozo donde se ha generado un patrón de referencia en la parte superior (flecha con punta de flecha rellena). Este patrón de referencia es necesario para obtener el enfoque láser óptimo para el patrón (ver paso 4). La flecha con punta de flecha vacía indica el área central del micropozo, que se utilizará para el patrón posterior después de la calibración del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Configuración de software para micropatrones. (A) Plantilla de patrón con rayas paralelas diseñadas con ImageJ y guardadas como un archivo Tiff de 8 bits. (B-D) Vista esquemática de los ROC digitales (regiones de interés) que se solaparán con los micropozos actuales donde se generarán micropatrones. (B) La plantilla de patrón que se va a utilizar (longitud 1824 píxeles-415 ám, anchura 1140 píxeles-260 ám) se selecciona en Leonardo y se proyecta en el ROI como una unidad de diseño (rayas rojas en el rectángulo negro discontinuo), que cubrirá aproximadamente 0,1 mm² de la micro-pozo. La unidad de diseño se replica en 4 columnas y 4 líneas en el menú Replicación (configuración de plantilla), creando un patrón en el micropozo. NOTA el espacio entre las columnas. (C) Para el patrón de franjas continuas, el espaciado entre columnas debe ajustarse. En este caso, para lograr una superposición entre las unidades de diseño, el espaciado entre columnas se establece en el menú de replicación como Espaciado negativo, -20 m. (D) Con el fin de crear un patrón de varias proteínas en el mismo micropozo, una alineación precisa de los patrones es Obligatorio. Durante el paso de configuración del software (paso 5), cargue todas las plantillas de patrón deseadas simultáneamente. En la lista Acciones, seleccione solo las acciones específicas que se deben patrones durante cada ronda de patrones y anule la selección del resto de las acciones (paso 5.12, 5.13 y 8.2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis de la variabilidad del patrón utilizando LIMAP. (A) Plantilla de patrón diseñada con ImageJ utilizada para micro-patrón cuatro franjas de ancho variable (20, 10, 5, 2 m, de arriba a abajo). (B) Micropatrón obtenido después de la incubación con 10 g/ml de fibrinógeno marcado fluorescentemente (verde). (C) Mediciones de intensidad a lo largo de una línea vertical que cruza las rayas del micropatrón. (D) Perfil de intensidad de fluorescencia vertical obtenido a partir de la medición en (C). NOTA que a anchuras más grandes (20 m) hay una variación en el perfil vertical causada por la acumulación de proteína en los bordes de la franja, lo que resulta en dos picos de intensidad de fluorescencia distintos (efecto de borde). Este efecto sólo se ve en anchuras de rayas de 20 m. (E) Mediciones de intensidad a lo largo de las líneas horizontales representadas (fluorescencia y fondo). (F) Perfiles horizontales de intensidad de fluorescencia obtenidos a partir de mediciones en (E). (G) Gráfico que muestra la intensidad media de cada anchura de franja, medida a partir de cuatro unidades de diseño replicadas individuales (variación entre patrones). NOTA la reducción de la adsorción de proteínas a patrones de ancho de banda de 2 m. (H) La variación dentro de las franjas estampadas (coeficiente de variación) fue baja para todos los anchos de franja, que van del 3 al 10%. Los datos en G y H se muestran como medias - SD. El análisis estadístico en G y H se realizó utilizando una prueba unidireccional ANOVA (Kruskal-Wallis) no paramétrica con múltiples comparaciones. El valor P es <0.001 para ** significancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: El efecto de las variaciones en la potencia del láser y la concentración de proteínas para la eficiencia de adsorción de proteínas. (A) La superficie PLL-PEG se dejó con láser con una dosis láser constante (1390 mJ/mm²) e incubada con las concentraciones indicadas de laminina con etiqueta fluorescente (magenta). (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de las rayas lamininosas en (A). (C) Se aplicaron las diferentes dosis láser indicadas seguidas de la incubación con la misma concentración (10 g/ml) de fibronectina etiquetada fluorescentemente (verde). (D) Cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de las rayas de fibronectina en (C) mostrando que las dosis láser más altas se correlacionan con niveles más altos de proteína adsorbida. Todas las medidas se restan fondo. Los números de muestra se indican en la parte inferior de las columnas; los datos se muestran como medias - SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba no paramétrica De Mann-Whitney con cálculo de dos colas. El valor P es <0.0001 para la significancia ****. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Generación de un gradiente de concentración de proteínas dentro de un micropatrón. (A) Plantilla de patrón de degradado en escala de grises. (B) Perfil de intensidad de fluorescencia medido a partir de (A). (C) Patrón obtenido con LIMAP a partir de la plantilla de patrón en (A) después de la incubación con 10 g/ml de fibronectina etiquetada fluorescentemente (verde). (D) Perfil de intensidad de fluorescencia de n a 3 rayas y fondo representado como media - SEM, mostrando el aumento lineal en la intensidad del gradiente de proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: El efecto de unión cruzada al patrones de varias proteínas secuencialmente. (A-C, E-G) Patrones cruzados con rayas de 10 m de fibronectina etiquetada fluorescentemente (cian, horizontal) y laminina etiquetada fluorescentemente (magenta, vertical). (A-C) Muestras tratadas con tampón de bloqueo BSA. (E-F) Muestras tratadas con PLL-PEG para bloquear sitios de enlace inespecíficos (paso 7). (A,E) Canales de fluorescencia fusionados que muestran fibronectina y laminina. (B,F) Imagen que muestra sólo fibronectina. (C, G) Imagen que muestra solo laminina. Para C, tenga en cuenta la presencia de laminin también en franjas positivas de fibronectina horizontal que se debe al bloqueo ineficaz de sitios de unión desocupados con BSA. Para G, tenga en cuenta que el bloqueo con PLL-PEG evita la unión eficiente de laminina a las rayas de fibronectina. (D,H) Perfiles de intensidad de fluorescencia obtenidos a partir de mediciones indicadas (línea amarilla diagonal) en A y E, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Patrones cruzados para investigar la búsqueda de ruta de neurita/axón. (A-C) Patrones cruzados con rayas de 10 m de fibronectina etiquetada fluorescentemente (cian, horizontal) y laminina etiquetada fluorescentemente (magenta, vertical). (A,B) Imágenes fluorescentes de células CAD con neurótesis que crecen a lo largo de los micropatrones. Para visualizar los neurótesis, las células se cultivaron durante 48 h, se fijaron con 4% de PFA y se teñiron para tubulina (A) o tubulina y actina (B). (C) Neuronas de ganglio de raíz dorsal de rata (DRG) con axones que crecen a lo largo de los micropatrones. Para visualizar los axón, las neuronas DRG se cultivaron durante 72 h, fijadas con 4% de PFA y teñidas para la tubulina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Ejemplos de resultados negativos comunes obtenidos al generar micropatrones con LIMAP. (A-C) Rayas con patrón subóptimo de 10 g/ml de fibrinógeno (verde) marcados fluorescentemente bajo diferentes circunstancias. (A) El micropozo se secó durante la generación del patrón. Observe los altos niveles de fluorescencia en el fondo (flecha) y la presencia de cristales PBS (asteriscos). (B) La costura entre las rayas no se ajustó correctamente durante la configuración del software, lo que dio como resultado franjas discontinuas con huecos (flecha) entre las unidades de diseño (véase el paso 3.4.7). (C) El enfoque láser era subóptimo causando rayas difusas (flechas) que no representan los anchos de franja reales de la plantilla de patrón, que deben ser 20, 10, 5, 2 m de arriba a abajo, como en (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Ventajas de micropatrones LIMAP (PRIMO) y comparación con la impresión de microcontactos
Si bien la impresión de microcontactos es posiblemente la técnica de micropatrones más utilizada en el campo biológico³⁹, parece haber un número creciente de investigadores que utilizan la tecnología LIMAP^{40,41,42 ,43,44}. Aquí, presentamos un protocolo usando PRIMO, un sistema disponible comercialmente para LIMAP. A continuación analizamos brevemente las posibles ventajas y limitaciones de la impresión de microcontactos y el patrón fotográfico LIMAP.

La impresión de microcontacto requiere maestros litografiados producidos por el recubrimiento de espín de una foto-máscara (generalmente SU-8) en una oblea de vidrio o silicio, que luego se graba con láser con las microcaracterísticas deseadas. Estos maestros se utilizan como plantillas para crear un sello PDMS^45. El sello se incuba con una proteína elegida que se adsorbe a él, y luego se transfiere (estampada) en el plato de cultivo celular. El proceso de adsorción de la proteína al sello PDMS depende de la concentración de proteínas, el tampón y el tiempo de incubación. Estos parámetros deben probarse previamente para obtener resultados óptimos⁴⁶.

Los maestros se pueden utilizar en un número sustancial de experimentos, que duran meses o incluso años, si se conservan correctamente. Sin embargo, un factor limitante de esta tecnología es la necesidad de rediseñar nuevos maestros litografíados para cada modificación deseada. Los cambios en los diseños experimentales pueden dar lugar a la producción lenta de nuevos maestros (hasta varias semanas) retrasando así los experimentos. En comparación, el fotopatrón LIMAP no requiere un maestro físico; utiliza plantillas de patrones generadas por software que se pueden utilizar para adaptar de forma flexible las geometrías deseadas de los micropatrones a las preguntas de investigación cambiantes. LIMAP también se puede utilizar para generar gradientes proteicos dentro del mismo micropatrón(Figura 8), que es más difícil de obtener de manera reproducible utilizando la impresión de microcontacto^47.

Además, la resolución de micropatrones lograda con LIMAP, en nuestro caso, es de 2 m(Figura 6B).

Al aproximarse a esta resolución se aumentó la variabilidad intra e inter-patrón. La generación de patrones alrededor o por encima de 10 m de ancho era altamente reproducible(Figura 6G,H). Por el contrario, con la impresión de microcontactos es difícil obtener de forma consistente resoluciones inferiores a 10 m y es común encontrar artefactos al estampar pequeñas características (datos no mostrados).

Hemos demostrado que LIMAP se puede utilizar para micro-patrón de múltiples proteínas(Figura 9) dentro del mismo micro-pozo, permitiendo que se agreguen más niveles de complejidad a los experimentos. Aunque esto podría lograrse con la impresión de microcontactos, alinear diferentes proteínas con un alto nivel de precisión puede ser técnicamente bastante exigente. Si bien el patrón de múltiples proteínas utilizando LIMAP parece directo, es importante mencionar que la unión cruzada de proteínas a través de procedimientos de recubrimiento secuencial puede reducirse mediante el bloqueo de reactivos, pero no eliminado sin eliminar por completo(Figura 9).

En cuanto al costo de una u otra técnica, LIMAP como se describe aquí requiere la compra de equipos de micro-patrones (PRIMO) que se pueden instalar en diferentes microscopios de fluorescencia y requiere una etapa motorizada. Aunque esta inversión es inicialmente intensiva en costos, no hay compras adicionales que no sean artículos consumibles (plantillas, PEG y PLPP) a largo plazo asociados con LIMAP. Alternativamente, las plantillas PDMS también pueden ser producidas en el laboratorio por el propio experimentador siguiendo los protocolos publicados^18,32. Los mayores costos para la impresión de microcontactos pueden estar asociados con la producción de nuevos maestros, que pueden llegar a ser sustanciales si los experimentos requieren nuevos patrones.

Un inconveniente de LIMAP es el enfoque de rendimiento relativamente bajo de esta técnica. La impresión por microcontacto puede producir un gran número de micropatrones de forma rápida y eficiente en un paso de estampado simultáneo, en comparación con el micropatrón láser secuencial requerido con LIMAP. Por ejemplo, es posible producir 6 cubiertas de vidrio estampadas en aproximadamente 2 h con impresión de microcontacto utilizando sellos PDMS (excluyendo la preparación de sellos); el patrón de un área similar (plato de 6 pozos) con LIMAP tomaría alrededor de 4 h, excluyendo el procedimiento de pasivación de la superficie (considerando la configuración de la plantilla de patrón descrita en el paso 5.12 y vea la Figura 5B).

Otro factor limitante de la velocidad de la tecnología LIMAP es el largo tiempo de iluminación necesario para el patrón de grandes áreas (30 s por unidad de diseño con un láser de 7,5 mW/mm^2). En estos casos, la impresión de microcontactos podría ser una opción preferida. Un fotoiniciador recién disponible (gel PLPP, Tabla de Materiales)debería reducir considerablemente el tiempo necesario para el patrón, permitiendo la generación de cientos de micropatrones en grandes áreas (hasta 8 mm²⁾en pocos minutos.

Otro factor importante a tener en cuenta cuando las superficies de micropatrones para el cultivo celular es la reproducibilidad de los micropatrones entre las diferentes repeticiones experimentales, en comparación con la variabilidad obtenida con la impresión de microcontactos. Por ejemplo, los gráficos que se muestran en la Figura 7B,D son datos representativos de tres repeticiones experimentales independientes con resultados muy similares (datos no mostrados). Basándonos en nuestra experiencia y publicaciones anteriores, este nivel de reproducibilidad es difícil de alcanzar con la impresión de microcontacto^{48,49,50,51,52}.

A diferencia de otras técnicas de foto-patrones que requieren química dedicada para diseñar materiales fotosensibles o el uso de fotosensibilizantes, que generalmente no son muy biocompatibles³, el componente fotosensible de LIMAP (PLPP ) es biocompatible y bien tolerado por las células^21; en nuestras manos no hemos experimentado ninguna citotoxicidad a través de una variedad de células, incluyendo CAD, neuronas DRG (Figura 10), fibroblastos, células epiteliales, y células de melanoma (datos no mostrados). Otra ventaja de LIMAP usando PRIMO en comparación con otras técnicas de foto-patrón es que no se requiere fotomáscara. Al igual que la impresión de microcontactos, las nuevas máscaras de foto serían necesarios para cada patrón deseado.

Todas las limitaciones mencionadas anteriormente para la impresión de microcontactos, consulte el enfoque manual de la técnica. Sin embargo, es posible mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la impresión de microcontacto utilizando un dispositivo automatizado con carga de sellos y control de presión^53.

Pasos clave del protocolo y resolución de problemas para LIMAP utilizando PRIMO
Uno de los problemas más comunes encontrados durante este protocolo es tener altos niveles de fluorescencia de fondo dentro de los micropatrones. Esto puede deberse al secado de micro-pozos que a menudo ocurre debido a su pequeño volumen. Cuando esto ocurre, los cristales PBS a menudo aparecen alrededor de los patrones ECM(Figura 11A).

Los pasos de lavado insuficientes o ineficientes después de la incubación de proteínas también pueden resultar en altos niveles de fluorescencia de fondo. Esto se puede observar particularmente al utilizar concentraciones proteicas de 10 g/ml(Figura 11B)o superiores. El exceso de proteína en el fondo se puede reducir incluyendo pasos de lavado adicionales con PBS.

La presencia de fondo proteico debe medirse y caracterizarse en cada experimento, calculando la intensidad de la fluorescencia de fondo(Figura 6E)y restándola de la intensidad de los micropatrones(Figura 6F-H y Figura 7B,D). El fondo de proteína alta puede tener un impacto en la fijación y la brotación de células CAD, comprometiendo la interpretación de los resultados.

Tener espacios entre unidades de diseño es un problema común cuando los usuarios tienen una experiencia limitada(Figura 11B),que se produce como resultado de una superposición insuficiente entre patrones. Dos parámetros en el software Leonardo se pueden ajustar para superar esto: 1) puede ser necesario un espaciado negativo entre columnas, dependiendo del diseño del patrón (paso 5.7 y ver figura 5B,C). Alternativamente, 2) utilice la opción de degradado en el menú Experto para coser las columnas. Una prueba rápida para determinar los parámetros de espaciado óptimos se puede realizar utilizando adhesivo UV(Tabla de materiales). Una pequeña gota de este adhesivo se aplica a un portaobjetos de vidrio, que luego se cubre con un cubreobjetos de vidrio, haciendo una película. El adhesivo UV incrustado está fotopatrónizado con la plantilla de patrón de interés utilizando una dosis láser baja (30 mJ/mm^2). Las regiones expuestas a los rayos UV del adhesivo incrustado se curarán, haciéndose visibles bajo microscopía de campo brillante. Los resultados de la prueba se visualizan para evaluar el espaciado obtenido dentro del patrón. En nuestros experimentos neuronales, una brecha entre las rayas puede afectar negativamente el comportamiento celular, produciendo variaciones en la dinámica de crecimiento (ya sea velocidad reducida o abandono del camino).

En la última actualización del software Leonardo (en el momento de la publicación, Leonardo 4.11), es posible cargar plantillas de patrones más grandes previamente diseñadas que cubren un área mucho más grande (hasta 8 mm² usando el objetivo 20X) de la superficie de micro-pozos en comparación con la actual 0,1 mm² por unidad de diseño, eliminando la necesidad de unir las unidades de diseño más pequeñas. Los bordes indefinidos pueden resultar de la falta de ajuste del enfoque láser durante la generación del patrón(Figura 11C). Por lo tanto, es fundamental calibrar el láser y realizar pasos de patrón de referencia (véase el paso 4) antes del patrón. Las franjas mal definidas dan lugar a variaciones en el ancho de las rayas, lo que dificulta la correlación entre la dinámica de crecimiento del axón y el ancho de la franja. Los axones también tienden a abandonar rayas que tienen bordes difusos. Además, la variabilidad en los bordes también se puede encontrar al imprimir franjas de 10-20 ám de ancho o superior, lo que resulta en un mayor contenido de proteínas en los bordes en comparación con las regiones centrales del patrón(Figura 6B,D). Este efecto de borde se produce mediante una difusión no homogénea del fotoiniciador durante el proceso de fotopatrón. La reacción de fotocissión depende del oxígeno, que se difunde más en los bordes. Este efecto de borde se puede minimizar homogeneizando el fotoiniciador con una pipeta en el micropozo durante el proceso de fotopatrón. Además, un nuevo fotoiniciador comercializado (gel PLPP), también puede reducir el efecto de borde (equipo de soporte del sistema PRIMO, comunicación personal).

La microimpresión de más de una proteína puede dar lugar a la unión cruzada(Figura 9A-D). Esto se puede minimizar aumentando la eficiencia de bloqueo que se utiliza para ocupar sitios de unión inespecíficos entre los pasos de incubación para las dos proteínas diferentes. La unión cruzada de proteínas puede perturbar la reproducibilidad de los resultados experimentales y puede conducir a una interpretación errónea de los datos, ya que es difícil determinar la contribución de cada proteína a la dinámica de crecimiento del axón y a otros comportamientos celulares.

Conclusión
Esperamos que el protocolo proporcionado mediante LIMAP facilite la generación de micropatrones proteicos mediante el uso del sistema PRIMO. Mientras que nuestro protocolo se centra en cómo producir de forma fiable micropatrones en superficies de vidrio 2D, otros han demostrado que es posible utilizar LIMAP para micro-patrones de sustratos blandos^54,y superficies microestructuradas para cultivos^{3D 42}. Estos micropatrones pueden ser una herramienta versátil para estudiar las respuestas celulares a los cambios en su microambiente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de etiquetado de proteínas Alexa 488	Invitrogen	A10235	Concentración de trabajo: N.A.
Kit de etiquetado de proteínas Alexa 647	Invitrogen	A20173	Concentración de trabajo: N.A.
Células	CAD ECACC	8100805	Concentración de trabajo: N.A.
Sondas moleculares	de fibrinógeno-488 conjugadas	F13191	Concentración de trabajo: 10 μ g/ml
DMEM medio de cultivo	Gibco 11320033		Concentración de trabajo: N.A.
Microscopio de epifluorescencia**	Nikon	Eclipse Ti invertido Concentración de	trabajo: N.A.
Fibronectina	Sigma	F4759	Concentración de trabajo: 10 μ g/ml (después del etiquetado con el kit de etiquetado de proteínas Alexa 488, ver arriba) (diluido en PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Version 2.0.0-rc-54/1.51f Concentración de	trabajo: N.A.
Iluminador fluorescente	Stabilo	Stabilo Boss Original	Concentración de trabajo: N.A.
HEPES	Gibco	15630080	Concentración de trabajo: 1M
Software Inkscape	Inkscape	Check última actualización	Concentración de trabajo: N.A.
Citoesqueleto de rodamina fluorescente de rojo laminina	, Inc.	LMN01	Concentración de trabajo: 10 μ g/ml (diluido en PBS)
Leonardo software	Alvé ole	versión 4.11	Concentración de trabajo: N.A.
L-Glutamina	Sigma	G7513	Concentración de trabajo: 1%
Software Micro-manager Imágenes	abiertas	Comprobar la última actualización	Concentración de trabajo: N.A.
Etapa x/y motorizada	PRIOR Scientific	Proscan II	Concentración de trabajo: N.A.
Software NIS Elements	Nikon	NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (Con trabajos Nikon)Concentración de	trabajo: N.A.
PBS (sin Ca2+, Mg2+)	Sigma	D8537	Concentración de trabajo: 1X
PDMS Stencils	Alvé ole	visit www.alveolelab.com	Concentración de trabajo: N.A.
PEG-SVA	Laysan bio, Inc.	MPEG-SVA-5000-1g Concentración de	trabajo: 50 mg/ml
Faloidina 405	Abcam	ab176752	Concentración de trabajo: 1:1000
Fotoiniciador (PLPP)	Alvé ole	PLPP clásico	Concentración de trabajo: 14,5 mg/ml
Fotoiniciador (gel PLPP)	Alvé ole	PLPP gel	Concentración de trabajo: 4.76% diluido en etanol
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)Concentración de	trabajo: N.A.
PLL-PEG	SuSoS (también distribuido por Alvé ole)	www.alveolelab.com	Concentración de trabajo: 0,1 mg/ml (diluido en PBS)
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	Concentración de trabajo: 0.01%
Equipo Primo	Alvé ole	www.alveolelab.comConcentración de	trabajo: N.A.
Pluma/Estreptococo	Thermo Fisher	15140122Concentración de	trabajo: 1%
Tubulina anticuerpo anti-alfa	Abcam	DM1A Concentración	trabajo: 1:1000 células CAD
Tubulina anticuerpo anti-beta 3	Sigma	T8660	Concentración de trabajo: 1:500 Neuronas
Adhesivo UV	Norland Products	NOA81	Concentración de trabajo: N.A.
1 plato con fondo de vidrio de pocillo	Cellvis	D35-20-1.5-N Concentración de	trabajo: N.A.
Plato con fondo de vidrio de 6 pocillos	Cellvis	P06-20-1.5-N Concentración de	trabajo: N.A.
Objetivo 20x**	Nikon	(consultar catálogo actualizado)	Concentración de trabajo: N.A. **Microscopio de epifluorescencia: se adquirieron imágenes y se generaron patrones en un microscopio invertido Eclipse Ti (Nikon), acoplado a un equipo de micropatrones PRIMO (Alvé ole), utilizando un objetivo 20x (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Se utilizaron conjuntos de filtros específicos de Nikon para GFP, mCherry y Cy5 y la fuente de luz fluorescente fue LED (Lumencor), aunque se pueden utilizar otras fuentes de fluorescencia y conjuntos de filtros. El microscopio tiene una platina x/y automatizada (PRIOR Scientific) para la impresión de patrones multicampo y Nikon Perfect Focus para evitar la desviación del enfoque. Las imágenes se recogieron con una cámara Retiga R6 (Q-Imaging).