Artículo de método

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

DOI:

10.3791/60113

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11 de marzo de 2020

 , 
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las sinapsis son unidades funcionales altamente compartimentadas que funcionan de forma independiente entre sí. En la enfermedad de Huntington (EH) y otros trastornos neurodegenerativos, esta independencia podría verse comprometida debido a la falta de aclaramiento de glutamato y los efectos resultantes de derrame y derrame. La cobertura astrocítica alterada de los terminales presinápticos y/o espinas dendríticas, así como un tamaño reducido de grupos transportadores de glutamato en los sitios de liberación de glutamato se han implicado en la patogénesis de enfermedades que resultan en síntomas de dis-/hipercinesia. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la disfunción de las sinapsis glutamatérgicas en la EH no se entienden bien. Mejorando y aplicando imágenes de sinapsis hemos obtenido datos arrojando nueva luz sobre los mecanismos que impiden el inicio de movimientos. Aquí, describimos los elementos principales de un enfoque relativamente barato para lograr una resolución de sinapsis única mediante el uso del nuevo sensor de glutamato ultrarrápido codificado genéticamente iGluu, óptica de campo ancho, una cámara científica CMOS (sCMOS), un láser de 473 nm y un sistema de posicionamiento láser para evaluar el estado de las sinapsis corticostriatales en rodajas agudas de ratones sanos o enfermos apropiados para la edad. Los transitorios de glutamato se construyeron a partir de píxeles individuales o múltiples para obtener estimaciones de i) liberación de glutamato basada en la elevación máxima de la concentración de glutamato [Glu] junto a la zona activa y ii) la aceptación de glutamato como se refleja en la constante de tiempo de descomposición (TauD) del [Glu] perisyáptico. Las diferencias en el tamaño del bouton en reposo y los patrones contrastantes de la plasticidad a corto plazo sirvieron como criterios para la identificación de terminales corticostriatales como pertenecientes a la vía intratefel (IT) o al tracto piramidal (PT). Usando estos métodos, descubrimos que en ratones sintomáticos de la EH el 40% de las sinapsis corticostriatales de tipo PT presentaban un aclaramiento insuficiente del glutamato, lo que sugiere que estas sinapsis podrían estar en riesgo de sufrir daño excitotóxico. Los resultados subrayan la utilidad de TauD como biomarcador de sinapsis disfuncionales en ratones Huntington con un fenotipo hipocético.

Introducción

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El impacto relativo de cada terminal sináptico perteneciente a una "conexión unitaria" (es decir, la conexión entre 2 células nerviosas) se evalúa típicamente por su influencia en el segmento inicial de la neurona postsináptica1,,2. Las grabaciones somáticas y/o dendríticas de las neuronas postsinápticas representan las más comunes y, hasta ahora, también los medios más productivos para aclarar el procesamiento de la información bajo una perspectiva descendente o vertical3,4,5. Sin embargo, la presencia de astrocitos con sus territorios discretos y (en roedores) no superpuestos puede contribuir a una perspectiva horizontal que se basa en mecanismos locales de intercambio de señales, integración y sincronización en sitios sinápticos6,,7,8,9,10.

Porque se sabe que la astroglia juega, en general, un papel importante en la patogénesis de la enfermedad neurodegenerativa11,12 y, en particular, un papel en el mantenimiento y la plasticidad de las sinapsis glutamatérgicas13,14,15,16, es concebible que las alteraciones en el rendimiento sináptico evolucionan de acuerdo con el estado de los astrocitos en el área de destino compartido de fibras aferentes con diversa sortividad. Para explorar más a fondo los mecanismos reguladores locales derivados de la astroglia en salud y enfermedad, es necesario evaluar las sinapsis individuales. El enfoque actual se elaboró para estimar el rango de indicadores funcionales de liberación y aclaramiento de glutamato y para definir los criterios que pueden utilizarse para identificar sinapsis disfuncionales (o recuperadas) en áreas cerebrales más estrechamente relacionadas con el inicio del movimiento (es decir, en primer lugar en la corteza motora y el estriado dorsal).

El estriado carece de neuronas glutamatérgicas intrínsecas. Por lo tanto, es relativamente fácil identificar aferentes glutamatérgicos de origen extratriatal. Estos últimos se originan principalmente en el tálamo medial y en la corteza cerebral (ver17,18,19,20 para más). Las sinapsis corticostriatales están formadas por los axónicos de las neuronas piramidales localizadas en las capas corticales 2/3 y 5. Los axones respectivos forman conexiones bilaterales intratelencéfalas (IT) o conexiones ipsilaterales a través de un sistema de fibra que constituye más caudalmente el tracto piramidal (PT). Además, se ha sugerido que los terminales de tipo IT y PT difieren en sus características de liberación y tamaño21,,22. En vista de estos datos, también se podrían esperar algunas diferencias en el manejo del glutamato.

El estriado es el área cerebral más afectada en la enfermedad de Huntington (EH)5. La EH humana es un trastorno neurodegenerativo hereditario genético grave. El modelo de ratón Q175 ofrece la oportunidad de investigar la base celular de la forma hipocinética-rígida de la EH, un estado que tiene mucho en común con el parkinsonismo. A partir de una edad de aproximadamente 1 año, los ratones homocigotos Q175 (HOM) presentan signos de hipocinesia, como se revela midiendo el tiempo pasado sin movimiento en un campo abierto23. Los actuales experimentos con ratones heterocigoto Q175 (HET) confirmaron los déficits motores anteriores observados en HOM y, además, mostraron que los déficits motores observados estaban acompañados por un nivel reducido de la proteína 2 del transportador de aminoácidos astrocíticos excitatorios (EAAT2) en las inmediaciones de los terminales sinápticos corticostria24. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que un déficit en la aceptación astrocítica de glutamato podría conducir a la disfunción o incluso la pérdida de las respectivas sinapsis25,26.

Aquí, describimos un nuevo enfoque que permite evaluar el aclaramiento de glutamato de sinapsis única en relación con la cantidad del neurotransmisor liberado. El nuevo sensor de glutamato iGluu se expresó en neuronas piramidales corticostriatales. Fue desarrollado por Katalin T'r-k27 y representa una modificación del sensor de glutamato de alta afinidad pero lento iGluSnFR28introducido anteriormente. Ambos sensores son derivados de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP). Para las características espectrales y cinéticas, véase Helassa et al.27. En resumen, iGluu es un sensor de baja afinidad con cinética de desactivación rápida y por lo tanto particularmente adecuado para estudiar el aclaramiento de glutamato en terminales sinápticos que liberan glutamato. La constante de tiempo de disociación de iGluu se determinó en un dispositivo de flujo detenido, que hacía un valor de Tauapagado de 2,1 ms a 20 oC, pero 0,68 ms cuando se extrapolaba a una temperatura de 34 oC27. Los terminales colaterales Single Schaffer sondeados a 34 oC con escaneo láser en espiral en la región CA1 de cultivos de hipocampo organotípicos bajo un microscopio de 2 fotóns exhibieron una constante de tiempo medio de descomposición de 2,7 ms.

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Protocolo

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Todos los trabajos se han llevado a cabo de conformidad con la Directiva 2010/63/UE de la UE para experimentos con animales y se han registrado en la Oficina de Protección Sanitaria y Seguridad Técnica de Berlín (G0233/14 y G0218/17).

NOTA: Las grabaciones de Q175 de tipo salvaje (WT) y heterocigotos (HET) se pueden realizar a cualquier edad y sexo. Aquí estudiamos machos y hembras a una edad de 51 a 76 semanas.

1. Inyección del sensor de glutamato iGluu para expresión en axones corticostriatales

  1. Utilice el tirador de pipetas (modo de un paso) para preparar pipetas de vidrio borosilicato para la inyección del virus. Después de tirar, romper la pipeta manualmente para obtener un diámetro de punta de 30-50 m. Autoclave la pipeta y los instrumentos quirúrgicos, incluyendo el taladro para abrir el cráneo.
  2. Almacenar el virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 oC en alícuotas de 10 oC. Si las inyecciones se realizan poco después de la producción de virus (dentro de 6 meses), manténgase a 5 oC. Antes de la cirugía, saque el vial y manténgalo a temperatura ambiente.
  3. Llene la pipeta de vidrio y retire las burbujas.
  4. Anestetizar al animal con una inyección intraperitoneal de una solución que contenga 87,5 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina. Inyección por vía subcutánea 0,25% de bupivacaína (8 mg/kg) para un alivio adicional del dolor. Compruebe la profundidad de la anestesia monitoreando el tono muscular y observando la ausencia de reflejos inducidos por el dolor.
  5. Afeitar la piel de la cabeza y esterilizarla con 70% de alcohol. Coloque el ratón en el marco estereotaxico.
  6. Utilice un bisturí para eliminar la piel y un taladro de alta velocidad (38.000 rpm) para hacer un agujero de 1,2 mm en el hueso por encima de la corteza motora.
  7. Monte la jeringa con la pipeta de inyección conectada en el soporte de un manipulador de precisión. Inserte la pipeta orientada verticalmente en la corteza en 4 sitios diferentes. Las coordenadas de inyección son, con respecto a bregma (en mm): anterior 1.5, lateral 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. La profundidad con respecto a la dura mater es (en mm): 1.5–1.7.
  8. Usando el sistema de inyección, inyectar 0,3 l por sitio de la solución de virus sin diluir con una velocidad de 0,05 l/min. Después de cada inyección, deje la pipeta en su lugar durante 1 min antes de retirarla lentamente (1 mm/min).
  9. Terminar cerrando la herida quirúrgica con una sutura de nylon.
  10. Deje el ratón de 0,5 a 1 h en una almohadilla de calentamiento en una jaula limpia antes de devolverlo a su jaula original.
  11. Mantener el ratón en un ciclo de 12 h día-noche durante 6 a 8 semanas antes de la preparación de rodajas de cerebro agudo.
    NOTA: Para evitar reacciones inmunitarias que resulten en daño celular y pérdida de sinapsis, la inyección de múltiples construcciones virales debe realizarse simultáneamente o dentro de 2-3 horas después de la inyección primaria. Las coordenadas para la inyección de iGluu fueron seleccionadas de acuerdo con el atlas cerebral Paxinos y Franklin29. Corresponden a la corteza motora M1. La inmunomancha de cerebros inyectados visualizaba numerosos axones y varicosidades de axón bien aislados en el estriado ipsi- y contralateral y en los corticios contralaterales M1 y S1.

2. Busque Terminales Glutamatérgicos Expresando el Sensor de Glutamato iGluu

  1. Modo de calibración
    1. Prepare la cámara sCMOS y el software de control de la cámara con los siguientes ajustes. En la página de lectura establecida Tasa de lectura de píxeles:560 MHz (lectura más rápida), Sensibilidad/Rango dinámico: bit, Filtro de ruido espurio: Sí, Lectura de superposición: Sí. En la página Binning/ROI, seleccione Pantalla completa.
    2. Prepare un portaobjetos de vidrio que contenga una gota de 5 mg/ml de lucifer amarillo (LY) debajo de un resbalón de la cubierta.
    3. Coloque la diapositiva LY debajo de un objetivo de 63x, abra el obturador láser y realice una adquisición en serie utilizando los siguientes ajustes: Pixel Binning: 1x1, Modo de disparo: Interno, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
    4. Ajustar la potencia del láser para producir un punto de fluorescencia de 4 m de diámetro (la imagen no debe contener píxeles saturados).
    5. Para realizar una calibración del sistema de posicionamiento láser, seleccione los siguientes ajustes en el software de posicionamiento láser: Diámetro del tamaño de punto:10, Velocidad de escaneo:43.200 kHz. Haga clic en el botón Iniciar adquisición de imagen en el panel derecho. Establecer ejecuciones: 0, Retardo de ejecución: 0, y seleccione la opción Ejecutar en TTL en la página Secuencia. Haga clic en el botón Calibrar de la página Calibración y calibre el software de control láser de acuerdo con las instrucciones que se muestran en la esquina superior izquierda de la pantalla de adquisición.
    6. Si la configuración utiliza software independiente para el control de la cámara y el láser, adquiera capturas de pantalla de la ventana de adquisición de la cámara y envíelas al software de control láser para un nuevo cálculo de las coordenadas XY. Si el software está instalado en diferentes ordenadores, utilice un captador de vídeo para importar la imagen en el software de control láser. El software de control láser necesitará la información sobre los factores de escala XY y los desplazamientos. Para ello, determine las coordenadas de las esquinas superior izquierda, inferior izquierda e inferior derecha de la imagen dentro de la ventana de adquisición del programa de control láser. Calcule los factores de escala de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Factor X (X inferior-derecha – X abajo-izquierda)/2048, Desplazamiento X - X inferior-izquierda, Factor Y (Y arriba-izquierda – Y abajo-izquierda)/2048, Y offset > Y abajo-izquierda.
    7. Al final del procedimiento de calibración, cree una región rectangular de interés (ROI) de 267x460 píxeles, muévala al centro de la pantalla y haga clic en el botón Iniciar secuencia.
    8. Vuelva a los siguientes ajustes del software de control de la cámara: Binning:2x2, Modo de disparo: Exposición externa, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
  2. Modo de corrección de autofluorescencia
    NOTA: El nivel de reposo de [Glu] en el entorno de terminales sinápticos activos suele estar por debajo de 100 nM14,30,31,32,33,34. En consecuencia, cualquier sensor de glutamato, especialmente un sensor de baja afinidad como iGluu será bastante tenue en ausencia de liberación de glutamato sináptico. Sin embargo, algunas fluorescencias iGluu incluso se pueden detectar en reposo, pero deben distinguirse de la autofluorescencia tisular. La iluminación de 473 nm provoca fluorescencia y autofluorescencia de iGluu (Figura 1A–C). Este último ocupa una amplia gama de longitudes de onda, mientras que la fluorescencia iGluu está limitada a 480–580 nm (con un máximo de 510 nm). La corrección de la autofluorescencia se basa en la adquisición de dos imágenes con diferentes filtros de paso alto.
    1. Preparar las rebanadas de cerebro por adelantado como se describe en otros lugares35. Mantenga las rodajas de salvado listas.
    2. Transfiera las rodajas a la cámara de registro, sumergiéndolas en cerebrospinalfluid artificial oxigenado (ACSF) que contiene 125 mM de NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de glucosa (pH 7,3, 303 mOsm/L), complementado con 0,5 mM de piruvato sódico, 2,8 mM de ascorbato sódico y 0,005 mM de glutatión. Utilice un caudal de 1–2 ml/min. Mantenga la temperatura del baño a 28–30 oC.
    3. Localice el estriado dorsal bajo un objetivo de inmersión en agua 20x. Fije las rodajas con una rejilla de nylon en un arpa de platino para minimizar el movimiento del tejido. Cambie al objetivo de inmersión en agua 63x /NA 1.0. Seleccione filtros que reflejen la luz a 473 nm (espejo dicroico) y luz que pasa con longitudes de onda >510 nm (filtro de emisión).
    4. Sincronice la iluminación, la estimulación y la adquisición de imágenes utilizando una placa AD/DA con el software de control respectivo. Configure el programa de disparo para controlar la adquisición con un tiempo de exposición láser de 180 ms y un tiempo de adquisición de imagen de 160 ms. Utilice el dispositivo de posicionamiento láser para enviar el rayo láser a un número predeterminado de puntos y definir los ajustes para velocidad de escaneo y tamaño de punto.
    5. Adquiere una imagen de estructuras autofluorescencia e iGluu-positivas usando un filtro de paso alto a 510 nm ("imagen amarilla").
    6. Adquiera una imagen con autofluorescencia sola usando un filtro de paso alto a 600 nm ("imagen roja").
    7. Escala las imágenes rojas y amarillas, utilizando las intensidades medias de los 10 píxeles más brillantes y los 10 píxeles más oscuros para definir el rango. Realice una resta "amarillo menos la imagen roja" y redimensione la imagen restado para generar un archivo tif estándar de 8 bits para una visualización conveniente del bouton de interés (Figura 1D). Contiene los píxeles brillantesude las estructuras iGlu u-positivas, píxeles grises del fondo y píxeles oscuros de estructuras con autofluorescencia.
      NOTA: Con el equipo dado, la fluorescencia media en reposo (F) será inferior a 700 U.U.
  3. Modo de búsqueda Bouton
    NOTA: los píxeles iGluu-positivos pueden pertenecer a elementos funcionalmente diferentes del árbol axonal, como ramas de axón de diferente orden, sitios de bifurcación, varicosidades después del agotamiento de la vesícula o varicosidades totalmente activas. Sin embargo, es casi imposible identificar terminales sinápticos funcionales sólo por inspección visual. Por lo tanto, cada terminal sináptico glutamatérgico necesita identificación por su capacidad de respuesta a la despolarización eléctrica. Los sitios que no responden a la estimulación tienen que ser desechados. El medio fisiológico para inducir la liberación de glutamato de los axones corticostriatales es provocar un potencial de acción. Esto se puede lograr mediante el uso de un canal de rodonina de características espectrales adecuadas o mediante la estimulación eléctrica de un axón visualizado por iGluu sí mismo. Para evitar la activación accidental de opsin, preferimos el último apropaso
    1. Utilice el tirador de micropipetas (en modo de cuatro pasos) para producir pipetas de estimulación a partir de capilares de vidrio borosilicato. El diámetro de la punta interna debe ser de aproximadamente 1 m. Cuando se llena con ACSF, la resistencia del electrodo debe ser de unos 10 M.
    2. Para inducir la liberación de glutamato potencial de acción a partir de un conjunto de boutones sinápticos unidos al mismo axón, utilice el aumento 63x, el filtro de emisión de 510 nm y la imagen restada para colocar un electrodo de estimulación de vidrio junto a una varicosidad fluorescente . Evite la proximidad de axónes adicionales.
    3. Encienda el estimulador para entregar pulsos de corriente despolarizantes a la pipeta de estimulación. Utilice intensidades de corriente alrededor de 2 oA (no más de 10 oA).
    4. Encienda el sistema de aplicación de baño multicanal donde un canal ofrece la solución de baño estándar y los otros canales ofrecen los bloqueadores necesarios de canales iónicos, transportadores o receptores de membrana. Controle el flujo en el lugar de grabación y luego cambie al canal de tetrodotoxina (TTX) (solución de baño más 1 M TTX). Después de 2-3 min, estimular el bouton de interés de nuevo, pero ahora en ausencia de acción generación potencial. La liberación se debe directamente a la afluencia de calcio a través de canales de calcio dependientes del voltaje.
    5. Al girar la tecla de intensidad en el estimulador, ajustar la corriente de estimulación para obtener respuestas similares a las obtenidas a través de potenciales de acción. Típicamente, la corriente de estimulación sería alrededor de 6 A para una despolarización de 0,5 ms.
    6. Para las pruebas básicas de la preparación, aplicar 0,5 mM CdCl2. La presencia de esta liberación de glutamato del bloqueador de los canales de calcio previene completamente la liberación de glutamato sináptico validando así la dependencia del calcio de la señal de glutamato evocada directamente.
      NOTA: La siguiente recomendación general puede ayudar a aumentar la tasa de éxito de los experimentos de sinapsis única en el estriado. Para seleccionar terminales sinápticos glutamatérgicos con maquinaria de liberación intacta, una varicosidad debe: (i) Tener una forma suave similar al husillo; (ii) No estar asociado con una bifurcación de axón; (iii) Ser más brillante que otras estructuras en la "imagen amarilla"; (iv) Residir en el neuropil estriado en lugar de en las vías de fibra; (v) Residir en una rama de axón muy delgada; (vi) No residir dentro de las partes más profundas de la rebanada.

3. Visualización de la liberación y eliminación de glutamato

  1. Modo de grabación
    NOTA: Después de la resta de la autofluorescencia (paso 2.2) y algunas pruebas iniciales para la capacidad de respuesta del bouton de interés (Paso 2.3), la adquisición de datos puede comenzar. Las respuestas a la activación eléctrica de la liberación de glutamato desde terminales de axón individuales se pueden observar directamente en la imagen(Figura 2), sin aplicar más herramientas de análisis. Sin embargo, resultó ser muy conveniente extraer inmediatamente algunos indicadores básicos del rendimiento de la sinapsis(Figura 3). Esta información es necesaria para tomar decisiones sobre el curso posterior del experimento, como la selección de determinados tipos de terminales, la evaluación rápida de las alteraciones relacionadas con la EH, el número y la frecuencia de los ensayos o fármacos que se aplicarán con el sistema de superfusión. También podría ser necesario lidiar con artefactos que aparezcan con el tiempo. En primer lugar, se describe n.o de la configuración estándar para la grabación de datos.
    1. Usando las unidades XY del microscopio, coloque el bouton iGluu-positivo probado cerca del centro del campo de visión. Detenga la adquisición de la imagen con el botón Anular adquisición. En la última imagen adquirida, determine la posición XY del centro del bouton en reposo haciendo clic en él con el botón izquierdo del ratón. Las coordenadas XY del cursor establecido se mostrarán en el panel de estado inferior de la ventana de adquisición.
    2. Utilizando los datos de calibración (paso 2.1.6), calcule las coordenadas del sitio donde se debe enviar el rayo láser para la excitación de la fluorescencia iGluu. Utilice las siguientes ecuaciones: Láser X - Cámara X * Factor X + Desplazamiento X, Y láser - Desplazamiento Y – Cámara Y * Factor Y. Al realizar este nuevo cálculo, preste atención a los ajustes de volteo vertical u horizontal de la cámara.
    3. Cree una secuencia de un punto en el software de control láser utilizando las coordenadas calculadas. Para ello, seleccione Punto en el cuadro Agregar a secuencia de la página Secuencia del software de control láser. Seleccione 10 s para que el retardo se active el inicio y 180 ms para el tiempo de pulso láser. Mueva el ratón a las coordenadas calculadas y haga clic en el botón izquierdo.
    4. Seleccione los siguientes ajustes en el software de control láser: Runs: 0, Run delay: 0, Sequence: Run at TTL. A continuación, haga clic en Iniciar secuencia.
    5. En el software de control de la cámara, seleccione los siguientes ajustes: En la página Binning/ROI, establezca El áreade imagen : Personalizado, Pixel Binning: 2x2, Altura: 20, Ancho: 20, Izquierda:Coordenada X del iGluenreposo -punto positivo menos 10 px, Inferior: Coordenada Y del iGluu-positivo de reposo menos 10 px, Modo adquisición: Serie cinética, Longitud de la serie cinética:400, Tiempo de exposición: 0.0003744s (valor mínimo). Con estos ajustes, la tasa de adquisición será de 2,48 kHz.
    6. Seleccione Modo de disparo: Externo. Haga clic en Tomar señal en el software de control de la cámara. Inicie el protocolo experimental establecido para el dispositivo de disparo.
    7. Implementar el protocolo experimental Trial con la siguiente línea de tiempo: 0 ms – start trial, 1 ms – start laser illumination, 20 ms – iniciar la adquisición de imágenes con cámara, 70 ms – iniciar la estimulación eléctrica 1, 120 – iniciar la estimulación eléctrica 2, 181 ms – prueba final (láser y cámara apagada). Así, durante una prueba la cámara adquiere 400 fotogramas con una frecuencia de 2,48 kHz. Consulte los pasos 2.3.3 y 2.3.5. para obtener detalles sobre la estimulación eléctrica.
    8. Para permitir una recuperación suficiente de las piscinas de vesículas presinápticas, aplique el protocolo Trial con una frecuencia de repetición de 0,1 Hz o inferior.
  2. Construcción fuera de línea del glutamato de liberación y aclaramiento del glutamato para la identificación de sinapsis patológicas
    1. Active las rutinas de evaluación. Aquí, utilizamos un software escrito internamente SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dvorzhak). Los siguientes pasos son necesarios para construir un transitorio de F/F a partir de los píxeles con fluorescencia elevada de iGluu como en el vídeo de la Figura 2.
    2. Para determinar el tamaño del bouton, calcule la media y la desviación estándar (SD) de la intensidad de fluorescencia del ROI en reposo (F), antes de la aparición de la estimulación. Determinar y encasillar el área ocupada por píxeles con F>media + 3 SD(Figura 3A). Determinar un diámetro virtual (en m) asumiendo una forma circular del área supraumbral.
    3. Determinar la diferencia de F como la diferencia entre el valor de intensidad máxima y F. Trazar la corriente estimulante y f/F contra el tiempo(Figura 3B). Calcule el SD de F/F en reposo (antes del inicio de la estimulación) y la "amplitud de pico". Utilice píxeles con amplitud de pico superior a 3 SD de F/F para realizar el empalme monoexponencial para la descomposición desde el pico. Determinar la constante de tiempo de descomposición TauD de F/F.
    4. Para estimar la "amplitud máxima" en una sinapsis determinada, seleccione el píxel con el valor más alto de F/F. Por lo general se encuentra dentro o al lado de los límites de la fluorescencia de bouton iGluu en reposo. La "amplitud máxima" sería el mejor indicador de la carga de glutamato presentada a la maquinaria de despeje de una sola sinapsis.
    5. Para estimar la extensión espacial de la señal iGluu, determine el diámetro del área de todos los píxeles de umbral supra combinados para formar un círculo virtual. El diámetro respectivo se llama "Spread". El término "Spread de pico" se refiere entonces al valor máximo del transitorio de propagación promediado(Figura 3C, diferencia entre las líneas rojas punteadas).
  3. Correcciones de posibles artefactos
    NOTA: La despolarización eléctrica se asocia con un flujo externo de la solución intrapipeta. Esto puede resultar en un pequeño desplazamiento de tejido. Para discriminar entre los cambios inducidos por la estimulación de iGluu y los cambios fuera de foco de la imagen, se podría utilizar el siguiente enfoque para identificar y eliminar artefactos de desplazamiento(Figura 4).
    1. Analizar las características espaciales de los píxeles supraumbrales derivados de un ROI con signos de desplazamiento(Figura 4F–H).
    2. Busque píxeles fuera de los límites inicialmente determinados del bouton en reposo(Figura 4F–H,encajonado en rojo).
    3. Identifique los valores de intensidad de píxeles negativos existentes(Figura 4I, J). Cualquier F/F en la dirección negativa con una amplitud mayor que la media de preestimulación - 3 SD debe considerarse como artefacto, y el registro debe ser descartado.
    4. Para evitar artefactos fuera de foco, coloque el electrodo de estimulación en el lado antero-lateral del bouton sináptico, utilice estimulación eléctrica bifásica y minimice la intensidad/duración de la estimulación.
      NOTA: Los artefactos fuera de foco también se pueden derivar de la cámara. Si este último no se fija de forma óptima al microscopio puede producir oscilaciones, probablemente debido a pequeñas vibraciones del sistema de refrigeración de la cámara. Estas vibraciones crean un patrón "yin y yang" en las imágenes de F/F que giran con una frecuencia de 50 Hz. Las vibraciones se pueden restar matemáticamente de la señal de fluorescencia, pero la calidad final de las mediciones dependería críticamente del tiempo de grabación.
    5. Fije la cámara al microscopio de tal forma que las vibraciones estén ausentes. Si este último permanece, coloque una junta de goma entre la cámara y el adaptador del microscopio.
      NOTA: No se puede descuidar la posibilidad de que el neuropil estriado alrededor de la sinapsis de interés contenga varicosidades glutamatérgicas que no expresan iGluu y por lo tanto permanecen invisibles. En el caso de su coactivación (más probable en ausencia de TTX) los transitorios obtenidos de los boutons de interés podrían verse afectados por el derrame. Lo mismo se aplica a los terminales iGluu-expressing que estaban fuera de foco. Un fenómeno característico sería en este caso que los transitorios de fluorescencia se originan en un área mucho más amplia. Como esta respuesta es eliminada por TTX, se puede interpretar como una respuesta inespecífica inducida por la activación multifibra injustificada.
    6. Para corregir esta respuesta multifibra inespecífica, siga el procedimiento descrito en la Figura 5. Utilice la señal de fluorescencia de píxeles en los límites del campo de visión. Para minimizar la respuesta de fondo, minimice la intensidad y duración de la estimulación o utilice TTX.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificación de dos tipos de varicosidades glutamatérgicas corticostriatales
Los aferents de TI y PT se originan en la capa 2/3 y 5, respectivamente, y presentan patrones diferenciales de ramificación y terminación en el estriado ipsilateral y contralateral (solo terminales de TI). Todavía poco se sabe sobre las propiedades de liberación de glutamato y aclaramiento en condiciones de activación repetitiva como se observó durante el inicio de los movimientos, pero está bien documentado que las vaidade...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos se refieren a una cuestión de interés general: la independencia de la sinapsis y su posible pérdida en el curso de la neurodegeneración, y describimos un nuevo enfoque para identificar las sinapsis afectadas en rebanadas cerebrales agudas de ratones envejecidos (>1 año). Aprovechando las características cinéticas mejoradas del sensor de glutamato recientemente introducido iGluu los experimentos iluminan la relación entre la liberación y la absorción del glutamato sináptico de una manera que no...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por CHDI (A-12467), la Fundación Alemana de Investigación (Exc 257/1 y DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) y los Fondos de Investigación Intramuros de la Charité. Agradecemos a K. Társk, St. George's, Universidad de Londres, y N. Helassa, Universidad de Liverpool, por el plásmido iGluu y muchas discusiones útiles. D. Betances y A. Sch-nherr proporcionaron una excelente asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio estereoscópicoWPIPZMIIIMicroscopio binocular de precisión con zoom estéreo
Marco estereotáticoStoelting51500DDigital Lab Nuevo marco estereotático estándar
Equipo de perforación de alta velocidadStoelting514439VForedom K1070 cromoter Kit
Sistema de inyecciónStoelting53311Inyector estereotáxico por excelencia (QSI)
jeringa Hamilton 5 y micro; lHamilton8793075RN Syr (26s/51/2)
Sistema de posicionamiento láserRapp OptoElectronicUGA-40UGA-40
Láser azul para excitación iGluuRapp OptoElectronicDL-473-020-SLáser de 473 nm
Espejo dicroico para 473 nmRapp OptoElectronicROE TB-355-405-473 Microscopiovertical dicroico
1PCarl Zeiss000000-1066-600Axioskop 2 FS Plus
Objetivo 63x/1.0Carl Zeiss421480-9900W Plan-Apochromat
4x objetivoCarl Zeiss44-00-20Achroplan 4x/0,10
Espejo dicroico para iGluuOmega ópticoXF2030
Filtro de emisión para iGluuOmega ópticoXF3086
Espejo dicroicoOmega óptico
Filtro de emisión para autofluorescencia substr.Cámara óptica OmegaQMAX EM600-650
sCMOSAndorZYLA4.2PCL10ZYLA 4.2MP Plus
Software de adquisiciónAndor4.30.30034.0Solis
Convertidor A/DAHEKA Elektronik895035InstruTECH LIH8+8
Software de adquisiciónHEKA Elektronik895153TIDA5.25
Sistema de posicionamiento de electrodosInstrumentoSutter MPC-200Micromanipulador
Estimulador eléctricoTalleresCharite STIM-26
CortadoraLeicaVT1200 SVibrotome
Marrón/Tirador tipo FlameSutter InstrSU-P1000P-1000
Tubos de vidrio para pipetas de inyecciónWPI1B100F3
Tubos de vidrio para estimulación pipetasWPIR100-F3
TetrodotoxinaAbcamab120054TTX
iGluu plásmidoAddgene106122ratones pCI-syn-iGluu
Q175Jackson Lab27410Z-Q175-KI
QMAX_DI580LP

Referencias

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