Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Anton Dvorzhak; Rosemarie Grantyn

doi:10.3791/60113

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Artículo de método

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

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DOI:

10.3791/60113

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11 de marzo de 2020

Anton Dvorzhak¹ , Rosemarie Grantyn¹

¹Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGlu_u para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Resumen

Las sinapsis son unidades funcionales altamente compartimentadas que funcionan de forma independiente entre sí. En la enfermedad de Huntington (EH) y otros trastornos neurodegenerativos, esta independencia podría verse comprometida debido a la falta de aclaramiento de glutamato y los efectos resultantes de derrame y derrame. La cobertura astrocítica alterada de los terminales presinápticos y/o espinas dendríticas, así como un tamaño reducido de grupos transportadores de glutamato en los sitios de liberación de glutamato se han implicado en la patogénesis de enfermedades que resultan en síntomas de dis-/hipercinesia. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la disfunción de las sinapsis glutamatérgicas en la EH no se entienden bien. Mejorando y aplicando imágenes de sinapsis hemos obtenido datos arrojando nueva luz sobre los mecanismos que impiden el inicio de movimientos. Aquí, describimos los elementos principales de un enfoque relativamente barato para lograr una resolución de sinapsis única mediante el uso del nuevo sensor de glutamato ultrarrápido codificado genéticamente iGlu_u, óptica de campo ancho, una cámara científica CMOS (sCMOS), un láser de 473 nm y un sistema de posicionamiento láser para evaluar el estado de las sinapsis corticostriatales en rodajas agudas de ratones sanos o enfermos apropiados para la edad. Los transitorios de glutamato se construyeron a partir de píxeles individuales o múltiples para obtener estimaciones de i) liberación de glutamato basada en la elevación máxima de la concentración de glutamato [Glu] junto a la zona activa y ii) la aceptación de glutamato como se refleja en la constante de tiempo de descomposición (TauD) del [Glu] perisyáptico. Las diferencias en el tamaño del bouton en reposo y los patrones contrastantes de la plasticidad a corto plazo sirvieron como criterios para la identificación de terminales corticostriatales como pertenecientes a la vía intratefel (IT) o al tracto piramidal (PT). Usando estos métodos, descubrimos que en ratones sintomáticos de la EH el 40% de las sinapsis corticostriatales de tipo PT presentaban un aclaramiento insuficiente del glutamato, lo que sugiere que estas sinapsis podrían estar en riesgo de sufrir daño excitotóxico. Los resultados subrayan la utilidad de TauD como biomarcador de sinapsis disfuncionales en ratones Huntington con un fenotipo hipocético.

Introducción

El impacto relativo de cada terminal sináptico perteneciente a una "conexión unitaria" (es decir, la conexión entre 2 células nerviosas) se evalúa típicamente por su influencia en el segmento inicial de la neurona postsináptica^1,^,². Las grabaciones somáticas y/o dendríticas de las neuronas postsinápticas representan las más comunes y, hasta ahora, también los medios más productivos para aclarar el procesamiento de la información bajo una perspectiva descendente o vertical³^,⁴^,⁵. Sin embargo, la presencia de astrocitos ....