Artículo de método

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

DOI:

10.3791/60118

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2 de junio de 2020

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1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

En este artículo

Resumen

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El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores inmunes en microambientes específicos.

Resumen

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El estado neuroinflamatorio del sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel clave en las condiciones fisiológicas y patológicas. La microglia, las células inmunitarias residentes en el cerebro, y a veces los macrófagos derivados de la médula ósea infiltrantes (BMDM), regulan el perfil inflamatorio de su microambiente en el SNC. Ahora se acepta que las poblaciones de vesícula extracelular (EV) de las células inmunitarias actúan como mediadores inmunes. Por lo tanto, su recolección y aislamiento son importantes para identificar su contenido, pero también evaluar sus efectos biológicos en las células receptoras. Los presentes datos destacan los requisitos cronológicos para el aislamiento EV de las células de microglia o de los macrófagos sanguíneos, incluidos los pasos de la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Un análisis proteómico no dirigido permitió la validación de firmas de proteínas como marcadores EV y caracterizó el contenido de EV biológicamente activo. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también se utilizaron funcionalmente en el cultivo primario de las neuronas para evaluar su importancia como mediadores inmunes en el crecimiento de la neurita. Los resultados mostraron que los vehículos eléctricos derivados de la microglia contribuyen a facilitar el crecimiento de la neurita in vitro. Paralelamente, los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en sangre se utilizaron funcionalmente como mediadores inmunes en cultivos esferoides de células de glioma C6, los resultados que muestran que estos vehículos eléctricos controlan la invasión de células de glioma in vitro. Este informe destaca la posibilidad de evaluar las funciones de las células inmunitarias mediadas por EV, pero también comprender las bases moleculares de dicha comunicación. Este desciframiento podría promover el uso de vesículas naturales y/o la preparación in vitro de vesículas terapéuticas con el fin de imitar las propiedades inmunitarias en el microambiente de las patologías del SNC.

Introducción

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Muchas neuropatologías están relacionadas con el estado neuroinflamatorio que es un mecanismo complejo que se considera cada vez más, pero todavía mal entendido porque los procesos inmunológicos son diversos y dependen del entorno celular. De hecho, los trastornos del SNC no implican sistemáticamente las mismas señales de activación y las poblaciones de células inmunitarias y, por lo tanto, las respuestas pro o antiinflamatorias son difíciles de evaluar como causas o consecuencias de las patologías. Los macrófagos residentes en el cerebro llamados "microglia" parecen estar en la interfaz entre los sistemas nervioso e inmune1. Las microglia tien....

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Protocolo

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1. Cultura primaria de microglia/macrofagos

  1. Cultivo primario de microglia
    1. Cultivo de microglia primaria de rata comercial (2 x 106 células) (ver la tabla de materiales) en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero libre de exosomas, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, y 9,0 g/L de glucosa a 37 oC y 5% deCOC.
    2. Recoger el medio acondicionado después de una cultura de 48 h y proceder al aislamiento de los vehículos eléctricos.
  2. Cultivo primario de macrófagos
    1. Cultivo de macrófagos primar....

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Resultados

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Uno de los principales desafíos para atribuir efectos biológicos a las vesículas extracelulares (EV) es la capacidad de aislar los vehículos eléctricos de todo el medio de cultivo. En este informe, presentamos un método que utiliza la ultracentrifugación (UC) y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) que se acopla al análisis a gran escala de firmas de proteínas para validar marcadores EV e identificar compuestos bioactivos. Los vehículos eléctricos derivados de macrófagos o microglia fueron aislados del medio acon.......

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Discusión

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El sistema nervioso central (SNC) es un tejido complejo en el que la comunicación de célula a célula regula las funciones neuronales normales necesarias para la homeostasis30. Los vehículos eléctricos ahora son ampliamente estudiados y descritos como cargas moleculares importantes para la comunicación de célula a célula31. Entregan específicamente un cóctel de mediadores a las células receptoras, afectando así a sus funciones en condiciones sanas y patológicas

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El trabajo presentado contó con el apoyo del Ministerio de Educación Nacional, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos al BICeL- Campus Scientific City Facility por el acceso a instrumentos y consejos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier por la asistencia de espectrometría de masas. Agradecemos a Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli y Pierre-Eric Sautiére por su fuerte contribución a los avances científicos y técnicos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
12% Mini-PROTEAN  Geles de proteínas prefabricados TGXBio-rad4561045EDU 
AcetonitriloFisher ChemicalsA955-1 
Filtro centrífugo Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
Bicarbonato de amonioSigma-Aldrich9830 
HSP90 &alfa;/β anticuerpo (RRID: AB_675659)Santa-cruzsc-13119 
Suplemento B27 PlusGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Mezclador de vórticeBenchmark ScientificBV1003 
Concentrado de reactivo de colorante de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bradford)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
Célula de glioma de rata C6ATCCATCC CCL-107 
Tubos canónicosSarstedt62.554.002 
CentrífugaEppendorf5804000010 
Incubadora CO2 ThermoFisher  
Microscopio confocal LSM880Carl ZeissLSM880 
CubreobjetosMarienfeld111580 
Plato de cultivo (60 mm)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 Cromatógrafo de líquidosThermoFisher  
Microscopio electrónico JEM-2100JEOL  
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacéticoSigma-Aldrich03777-10G 
Ácido etilendiaminotetraacéticoSigma-AldrichED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Base de datos FBS ExoCarta agotada por exosomas
(100 proteínas principales de Evs)  http://www.exocarta.org/
Suero Fetal BovinoGibco16140071 
Suero Fetal de CaballoBiowest S0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand  Q500 Sonicator con sondaFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
Medio de montaje de fluorescenciaAgilentS3023 
Ácido fórmicoSigma-Aldrich695076 
Rejillas de cobre recubiertas de carbono Agarscientific LtdAGS162-3 
GlucosaSigma-AldrichG8769 
GlutaraldehídoSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
IdoacetamidaSigma-AldrichI1149 
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
Microscopio óptico invertido CKX53Olympus  
L-glutaminaGibco25030-024 
LabTek II 8 pozos  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
Software MaxQuant (software de identificación de proteínas)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT EspigaPolaco Brucker8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
MetilcelulosaSigma-AldrichM6385-100G 
Agua MiliQMerck Millipore  
LecheRegilaitREGILAIT300 
Mini célula de electroforesis vertical PROTEANBio-Rad1658000FC 
Columna MonoP FPLCGE Healthcare ya no está disponible
Nanosight NS300Malvern AnalíticoNS300 
Software NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
Bomba de jeringa NanoSightMalvern Panalytical  
GibcoNeurobasal21103-049 
Membrana de nitrocelulosaGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741 
Nunc multiplato 24 pocillosThermoFisher82.1473 
Electromicroscopíade paraformaldehído15713 
Línea celular PC-12ATCCATCC CRL-1721 
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122 
Mezcla de calibración de péptidosLaserBio LabsC101 
Peroxidasa AffiniCabra pura Anti-Mouse IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch115-035-003 
Software Perseus (Procesamiento de proteínas identificadas)  https://maxquant.net/perseus/
Conjugado faloidina-tetrametilrodaminaSanta-cruzsc-362065 
Fluoruro de fenilmetanosulfoniloSigma-Aldrich78830 
Tampón de fosfato solución salinaInvitrogen14190094sin calcio, sin magnesio
pluriStrainer M/ 60 µ mpluriSelect43-50060 
Poly-D-lisinaSigma-AldrichP6407 
Tubos de centrífuga de policarbonatoBeckman Coulter355651 
Inhibidor de la proteasaSigma-AldrichS8830-20TAB 
Sistemas de celdasPureCol5005 
Q-Exactive espectrómetro de masasThermoFisher  
espectrómetro de masas rapifleXBrucker  
Neuronas corticales de rataAplicaciones celularesR882N-20Origen de la célula : Derivado de las cortezas cerebrales del día 18 cerebros de rata embrionarios de Sprague Dawley
Macrófago de rata & Medio de cultivo de microglíaAplicaciones celularesR620K-100Cell orgin : Médula ósea de rata saludable
Macrófagos primarios de rataAplicaciones celularesR8818-10a 
Microglía primaria de rataLonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare 17014001 
Tripsina modificada de grado de secuenciaciónPromegaV5111 
Deslizadorpolvo100204 
Cloruro de sodioScharlauSO0227 
Dodecil sulfato de sodioSigma-AldrichL3771 
Fluoruro de sodioSigma-AldrichS7920-100G 
Hidróxido desodio ScharlabSO0420005P 
Pirofosfato de sodioSigma-AldrichS6422-100G 
Concentrador de vacío SpeedVacThermoFisher  
Software de cadenas (redes de asociación de proteínas funcionales)  https://string-db.org/
Sustrato de duración extendida SuperSignal West DuraThermoFisher34075 
Jeringa 1.0 mLTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD Célula de transferencia semisecaBio-Rad1703940 
Ácido trifluoroacéticoSigma-AldrichT6508 
TrisInterchimUP031657 
Tris-GlycineEuromedexEU0550 
Tween 20Sigma-AldrichP2287 
UltracentrífugaBeckman CoulterA95765 
rotor ultracentrífugo 70.1 TiBeckman Coulter342184 
Acetato de uraniloAgar Scientific LtdAGR1260A 
Papel de filtro WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
&alfa;-Ácido ciano-4-hidroxicinámicoSigma-AldrichC2020-25G 
Ciencia normal de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

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