Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

Quentin Lemaire; Marie Duhamel; Antonella Raffo-Romero; Michel Salzet; Christophe Lefebvre

doi:10.3791/60118

Artículo de método

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

DOI:

10.3791/60118

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2 de junio de 2020

Quentin Lemaire¹ , Marie Duhamel¹ , Antonella Raffo-Romero¹ , Michel Salzet¹ , Christophe Lefebvre¹

¹U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

En este artículo

Resumen

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El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores inmunes en microambientes específicos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estado neuroinflamatorio del sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel clave en las condiciones fisiológicas y patológicas. La microglia, las células inmunitarias residentes en el cerebro, y a veces los macrófagos derivados de la médula ósea infiltrantes (BMDM), regulan el perfil inflamatorio de su microambiente en el SNC. Ahora se acepta que las poblaciones de vesícula extracelular (EV) de las células inmunitarias actúan como mediadores inmunes. Por lo tanto, su recolección y aislamiento son importantes para identificar su contenido, pero también evaluar sus efectos biológicos en las células receptoras. Los presentes datos destacan los requisitos cronológicos para el aislamiento EV de las células de microglia o de los macrófagos sanguíneos, incluidos los pasos de la ultracentrifugación y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Un análisis proteómico no dirigido permitió la validación de firmas de proteínas como marcadores EV y caracterizó el contenido de EV biológicamente activo. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también se utilizaron funcionalmente en el cultivo primario de las neuronas para evaluar su importancia como mediadores inmunes en el crecimiento de la neurita. Los resultados mostraron que los vehículos eléctricos derivados de la microglia contribuyen a facilitar el crecimiento de la neurita in vitro. Paralelamente, los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en sangre se utilizaron funcionalmente como mediadores inmunes en cultivos esferoides de células de glioma C6, los resultados que muestran que estos vehículos eléctricos controlan la invasión de células de glioma in vitro. Este informe destaca la posibilidad de evaluar las funciones de las células inmunitarias mediadas por EV, pero también comprender las bases moleculares de dicha comunicación. Este desciframiento podría promover el uso de vesículas naturales y/o la preparación in vitro de vesículas terapéuticas con el fin de imitar las propiedades inmunitarias en el microambiente de las patologías del SNC.

Introducción

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Muchas neuropatologías están relacionadas con el estado neuroinflamatorio que es un mecanismo complejo que se considera cada vez más, pero todavía mal entendido porque los procesos inmunológicos son diversos y dependen del entorno celular. De hecho, los trastornos del SNC no implican sistemáticamente las mismas señales de activación y las poblaciones de células inmunitarias y, por lo tanto, las respuestas pro o antiinflamatorias son difíciles de evaluar como causas o consecuencias de las patologías. Los macrófagos residentes en el cerebro llamados "microglia" parecen estar en la interfaz entre los sistemas nervioso e inmune¹. Las microglia tienen un origen mieloide y se derivan del saco de yema durante la hematopoyesis primitiva para colonizar el cerebro, mientras que los macrófagos periféricos se derivan del hígado fetal durante la hematopoyesis definitiva para convertirse en macrófagos periféricos^2. Las células de microglia se comunican con las neuronas y las células gliales derivadas de las neuronas, como los astrocitos y los oligodendrocitos^3. Varios estudios recientes han demostrado que la microglia está implicada en la plasticidad neuronal durante el desarrollo del SNC y la homeostasis de tejido adulto, y también en el estado inflamatorio asociado con enfermedades neurodegenerativas^4,^,⁵. De lo contrario, la integridad de la barrera hematoencefálica puede verse comprometida en otras patologías del SNC. Las respuestas inmunitarias, especialmente en el cáncer de glioblastoma multiforme, no son apoyadas sólo por células de microglia, ya que la barrera hematoencefálica se reorganiza a través de procesos angiogénicos y la presencia de vasos linfáticos^6,^,⁷. Por lo tanto, una infiltración grande de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) ocurre en el tumor cerebral a través de los mecanismos de angiogénesis dependientes del tumor⁸. Las células cancerosas ejercen una influencia significativa en los DMO infiltrados que conducen a propiedades inmunosupresoras y crecimiento tumoral⁹. Por lo tanto, la comunicación entre las células inmunitarias y su microambiente cerebral es difícil de entender ya que el origen celular y las señales de activación son diversas^10,^,¹¹. Por lo tanto, es interesante aprehender las funciones de las firmas moleculares asociadas a células inmunes en condiciones fisiológicas. En este sentido, la comunicación célula-célula entre las células inmunitarias y el microambiente celular se puede estudiar mediante la liberación de vesículas extracelulares (EV).

Los vehículos eléctricos se están estudiando cada vez más en la regulación de las funciones inmunitarias en condiciones sanas y patológicas^12,^,¹³. Se pueden tener en cuenta dos poblaciones, exosomas y microvesículas. Presentan diferentes rangos de biogénesis y tamaño. Los exosomas son vesículas de 30-150 nm de diámetro y se generan a partir del sistema endosomal y se secretan durante la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática. Las microvesículas miden unos 100–1.000 nm de diámetro y son generadas por un árbol externo de la membrana plasmática celular¹⁴. Debido a que la discriminación de exosoma versus microvesículas todavía es difícil de realizar de acuerdo con el tamaño y los patrones moleculares, sólo utilizaremos el término EV en el presente informe. La comunicación asociada a los vehículos ves por el VEHÍCULO en el SNC representa un mecanismo ancestral ya que los estudios mostraron su participación en especies de invertebrados, incluidos nematodos, insectos o anélidos^15,^,¹⁶. Además, los resultados que muestran que los vehículos eléctricos pueden comunicarse con células de diferentes especies demuestran que este mecanismo es un sistema de bloqueo de teclas, basado primero en el reconocimiento de moléculas de superficie entre vesículas y células receptoras y luego permitiendo la absorción de mediadores^16,^,¹⁷. De hecho, los vehículos eléctricos contienen muchas moléculas como proteínas (por ejemplo, enzimas, transducción de señales, factor de biogénesis), lípidos (por ejemplo, ceramida, colesterol) o ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARNm o miRNAs) que actúan como reguladores directos o indirectos de las actividades celulares receptoras¹⁴. Es por eso que también se realizaron estudios metodológicos en células inmunitarias para aislar los vehículos eléctricos y caracterizar completamente sus firmas proteicas^18,^,¹⁹.

Los primeros estudios demostraron la liberación de exosomas de la microglia de rata cultivada primaria como un mecanismo inducible después de una activación dependiente de Wnt3a o serotonina²⁰^,²¹. Funcionalmente en el SNC, los vehículos eléctricos derivados de la microglia regulan la liberación de vesículas sinápticas por terminales presinápticos en las neuronas que contribuyen al control de la excitabilidad neuronal^22,^,²³. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia también podrían propagar la respuesta inflamatoria mediada por citoquinas en regiones cerebrales grandes^24,^,²⁵. Es importante destacar que los diversos ligandos para la familia de receptores similares a peajes podrían activar producciones específicas de vehículos eléctricos en la microglia²⁶. Por ejemplo, los estudios in vitro muestran que las líneas celulares BV2 de microglia activada por LPS producen contenidos diferenciales de EV, incluidas las citoquinas proinflamatorias^27. Por lo tanto, la diversidad funcional de las subpoblaciones de células inmunitarias en el SNC, la microglia y la infiltración de DMO, podría evaluarse a través de sus propias poblaciones de EV, incluido el impacto EV en las células receptoras y la identificación del contenido de EV.

Anteriormente describimos métodos para evaluar las propiedades funcionales de los vehículos eléctricos derivados de microglia y BMDM después de su aislamiento¹⁶^,¹⁹. En el presente informe, proponemos evaluar de forma independiente el efecto de los vehículos eléctricos derivados de la microglia en el crecimiento de la neurita, y el efecto de los vehículos eléctricos derivados de macrófagos en el control de los agregados celulares del glioma. Este estudio también propone un amplio análisis proteómico de las fracciones EV con el fin de validar el procedimiento de aislamiento EV, así como identificar las firmas de proteínas biológicamente activas. Los efectos beneficiosos y el descifrado molecular de los contenidos de EV podrían ayudar a su posible manipulación y uso como agentes terapéuticos en trastornos cerebrales.

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Protocolo

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1. Cultura primaria de microglia/macrofagos

Cultivo primario de microglia
1. Cultivo de microglia primaria de rata comercial (2 x 10⁶ células) (ver la tabla de materiales) en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero libre de exosomas, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, y 9,0 g/L de glucosa a 37 oC y 5% de_COC.
2. Recoger el medio acondicionado después de una cultura de 48 h y proceder al aislamiento de los vehículos eléctricos.
Cultivo primario de macrófagos
1. Cultivo de macrófagos primarios de ratas comerciales (1 x 10⁶ células) en el medio proporcionado por el fabricante (ver la Tabla de Materiales) a 37oC y 5% CO_2,con suero libre de exosomas.
2. Recoger el medio acondicionado después de un cultivo de 24 horas y proceder al aislamiento de los vehículos eléctricos.

2. Aislamiento de vehículos eléctricos

Preaislado de vehículos eléctricos del medio acondicionado
1. Transfiera el medio de cultivo condicionado de cultivos de microglia o macrófagos (pasos 1.1.2 o 1.2.2) a un tubo cónico.
2. Centrifugar a 1.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para peletizar las células.
3. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico. Centrífuga a 1.200 x g durante 20 min en RT para eliminar los cuerpos apoptóticos.
4. Transfiera el sobrenadante en un tubo de policarbonato de 10,4 ml y transfiera el tubo a un rotor de 70,1 Ti. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 90 min a 4oC para peletizar los vehículos eléctricos.
5. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene EV que contiene EV en 200 l de solución salina tampón de fosfato filtrada (PBS) de 0,20 m.
Aislamiento de vehículos eléctricos
1. Preparación de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño casera (SEC)
  1. Vaciar una columna de cromatografía de vidrio (longitud: 26 cm; diámetro: 0,6 cm) (ver la Tabla de Materiales),lavarla y esterilizarlo.
  2. Coloque un filtro de 60 m en la parte inferior de la columna.
  3. Apilar la columna con una matriz base de filtración de gel de agarosa reticulada para crear una fase estacionaria de 0,6 cm de diámetro y una altura de 20 cm.
  4. Enjuague la fase con 50 ml de PBS filtrado de 0,20 m. Conservar a 4oC para su uso posterior si es necesario.
2. Coloque el pellet EV resuspendido en la parte superior de la fase estacionaria de la columna SEC.
3. Recoja 20 fracciones secuenciales de 250 l mientras continúa agregando PBS filtrado de 0,20 m en la parte superior de la fase estacionaria para evitar el secado de la columna. Almacene las fracciones a -20 oC si es necesario.
  NOTA: Se puede realizar un almacenamiento más largo que una semana a -80 oC para mantener la integridad del EV para el análisis molecular.
Análisis de espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz (MALDI) de las fracciones SEC
1. Proceda al aislamiento EV como se describe en la sección 2.2.
2. Resuspender el pellet EV con 200 l de solución de mezcla de calibración de péptidos (ver tabla de materiales).
3. Proceda a la colección EV como se describe en las secciones 2.2.1 a 2.2.3.
4. Seque completamente la fracción con un concentrador de vacío.
5. Reconstituir las fracciones con 10 l de ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA).
6. Mezclar 1 l de fracción reconstituida con 1 l de matriz de ácido hidroxicinnámico (HCCA) de 1 oC en una placa de destino de acero MALDI pulido.
7. Analice todas las fracciones con un espectrómetro de masas MALDI.
8. Analizar los espectros generados con software dedicado (consulte Tabla de materiales).

3. Caracterización de los vehículos eléctricos

Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
NOTA: El análisis NTA se realiza con un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (ver Tabla de materiales)y una bomba de jeringa automatizada.
1. Haga una dilución (rango de 1:50 a 1:500) de cada fracción SEC desde el paso 2.2.3 con 0.20 m de PBS filtrado.
2. Vortex la solución para eliminar agregados EV.
3. Coloque la solución diluida en una jeringa de 1 ml y colóquela en la bomba de jeringa automatizada.
4. Ajuste la configuración de la cámara al nivel de ganancia de pantalla (3) y al nivel de la cámara (13).
5. Haga clic en Ejecutar e inicie el siguiente script.
  1. Cargue la muestra en la cámara de análisis (velocidad de perfusión: 1.000 para 15 s).
  2. Disminuir y estabilizar el flujo de velocidad para la grabación de vídeo (velocidad de perfusión: 25 para 15 s). Captura tres videos consecutivos de 60 s del flujo de partículas.
  3. Ajuste el nivel de la cámara (13) y el umbral de detección (3) antes del análisis de vídeos. Haga clic en Configuración . . . . . . . . . . Ok para iniciar el análisis y haga clic en Exportar cuando se realiza el análisis.
6. Entre cada análisis de fracción, lavar con 1 ml de PBS filtrado de 0,20 m.
Análisis de microscopía electrónica (EM)
1. Aísle los vehículos eléctricos como se describe en la sección 2.
  NOTA: No se requieren condiciones estériles.
2. Repita la sección 3.1 para cuantificar los vehículos eléctricos.
  NOTA: Solo se utilizarán fracciones positivas para el análisis EM.
3. Utilice un filtro centrífugo de 50 kDa (ver Tabla de materiales)para concentrar fracciones SEC que contienen EV.
4. Resuspend EVs concentrados en 30 l de 2% de paraformaldehído (PFA).
5. Cargue 10 l de la muestra sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono.
6. Incubar durante 20 min en un ambiente húmedo.
7. Repita los pasos 3.2.5 y 3.2.6 para una buena absorción de la muestra en la rejilla.
8. Transfiera la rejilla a una caída de 1% de glutaraldehído en PBS durante 5 min en RT.
9. Lave la muestra con agua ultrapura varias veces.
10. Contraste la muestra durante 10 minutos sobre hielo con una mezcla de acetato de uranilo al 4% y 2% de metilcelulosa (1:9, v/v). Retire el exceso de la mezcla con un papel de filtro.
11. Seque la muestra y observándola bajo un microscopio electrónico de transmisión a 200 kV (ver tabla de materiales).
Análisis de western blot
1. Extracción de proteínas
  1. Repita los pasos 3.2.1 a 3.2.3 para aislar y concentrar los vehículos eléctricos.
  2. Mezclar 50 l de tampón RIPA (150 mM de cloruro sódico [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM de etilenglicol-bis(2-aminoétilemás)-N,N,N-,ácido tetraacético [EGTA], ácido etilendiamina-tetraacético de 2 mM [EDTA], Fluoruro de sodio de 100 mM [NaF], 10 mM de pirofosfato sódico, 1% No 40, 1 mM fluoruro de fenimetanofonil [PMSF], inhibidor de 1x proteasa) con la muestra EV (25 l resultante de la concentración de EV en el filtro) durante 5 minutos en hielo para extraer proteínas.
  3. Sonicar para 5 s (amplitud: 500 W; frecuencia: 20 kHz), 3 veces en hielo.
  4. Retire los residuos vesiculares por centrifugación a 20.000 x g durante 10 min, a 4oC.
  5. Recoger el sobrenadante y medir la concentración de proteínas con el método de ensayo de proteína Bradford.
2. Electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato de sodio (SDS-PAGE) e hinchazón occidental
  1. Mezclar extractos proteicos (30 g) con tampón de muestra de 5c Laemmli (v/v).
  2. Cargue la mezcla de proteínas en un gel de poliacrilamida al 12%.
  3. Migre las proteínas en el gel con tampón TGS (25 mM Tris pH 8.5, 192 mM de glicina y 0,1% sdS), a 70 V durante 15 min y 120 V durante 45 min.
  4. Transfiera las proteínas a la membrana de nitrocelulosa con sistema semi-seco a 230 V durante 30 min.
  5. Saturar la membrana durante 1 h en RT con tampón de bloqueo (0,05% Tween 20 p/v, 5% leche en polvo w/v en 0,1 M PBS, pH 7.4).
  6. Incubar la membrana durante la noche a 4oC con anticuerpos monoclonales anti-humanos de proteína de choque térmico 90 (HSP90) de ratón diluidos en tampón de bloqueo (1:100).
  7. Lave la membrana tres veces con PBS-Tween (PBS, 0.05% Tween 20 w/v) durante 15 min.
  8. Incubar la membrana durante 1 h en RT con anticuerpos secundarios IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante de cabra diluidos en tampón de bloqueo (1:10.000).
    NOTA: Se realiza un control negativo utilizando anticuerpos secundarios solos.
  9. Repita el paso de lavado (paso 3.3.2.7).
  10. Revelar la membrana con kit de sustrato de hinchazón occidental de quimiminiscencia (ECL) mejorado (ver Tabla de materiales).
Análisis proteómico
1. Extracción de proteínas y digestión en gel
  1. Repita los pasos 3.2.1 a 3.2.3 para aislar y concentrar los vehículos eléctricos. Repita el paso 3.3.1 para la extracción de proteína EV.
  2. Realizar la migración de proteínas en el gel de apilamiento de un 12% de gel de poliacrilamida.
  3. Fijar las proteínas en el gel con coomassie azul durante 20 min en RT.
  4. Ex impuestos cada pieza de gel de color y cortarlo en trozos pequeños de 1 mm³.
  5. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 l de cada una de las soluciones: agua ultrapura durante 15 min, 100% acetonitrilo (ACN) para bicarbonato de amonio de 15 min, 100 mM (NH₄HCO₃) durante 15 min, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN para 5 min con agitación continua.
  6. Seque completamente las piezas de gel con concentrador de vacío.
  7. Realizar la reducción de proteínas con 100 l de 100 mM NH₄HCO₃ que contiene 10 mM de ditiothreitol durante 1 h a 56oC.
  8. Realizar alquilación proteica con 100 ml de 100 mM NH₄HCO₃ que contenga 50 mM de yodoacetamida durante 45 minutos en la oscuridad en RT.
  9. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 ml de cada solución: 100 mM de NH₄HCO₃ durante 15 min, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN durante 5 min con una agitación continua.
  10. Seque completamente las piezas de gel con un concentrador de vacío.
  11. Realizar la digestión proteica con 50 ml de tripsina (12,5 g/ml) en 20 mM NH₄HCO₃ durante la noche a 37 oC.
  12. Extraiga las proteínas digeridas del gel con 50 l de 100% ACN durante 30 min a 37oC y luego 15 min a RT con agitación continua.
  13. Repita los siguientes procedimientos de extracción dos veces: 50 ml de 5% de TFA en 20 mM de solución NH₄HCO₃ durante 20 min con agitación continua.
  14. Añadir 100 l de 100% ACN durante 10 min con agitación continua.
  15. Proteínas digeridas en seco con un concentrador de vacío y resuspend en 20 l de 0,1% de AFC.
  16. Desalir la muestra utilizando una punta de pipeta de 10 l con medios de fase inversa C18 para desalar y concentrar péptidos (ver tabla de materiales)y péptidos elute con ácido fórmico ACN:0,1% (FA) (80:20, v/v).
  17. Seque completamente la muestra con un concentrador de vacío y resuspend en 20 ml de ACN:0.1% FA (2:98, v/v) para espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS).
2. Análisis LC-MS/MS
  1. Cargue el péptido digerido en el instrumento LC-MS/MS y realice análisis de muestras y datos según los parámetros descritos en detalle en otro lugar⁴².
3. Análisis de datos sin procesar
  1. Procesar datos de espectrometría de masas para identificar proteínas y comparar proteínas identificadas de cada muestra con un paquete de software proteómico cuantitativo utilizando parámetros estándar.
  2. Exportar, utilizando parámetros estándar, la lista de proteínas exclusivas y sobre-representadas a partir de muestras positivas EV en un software que predice redes de proteínas y procesos biológicos.
  3. Compare la lista de proteínas identificadas en las fracciones con los 100 marcadores EV principales de la base de datos de acceso abierto exocarta (consulte la Tabla de materiales).

4. Ensayo de efectos de vehículos eléctricos funcionales

Ensayo de crecimiento de neurita en la línea celular PC-12
1. Cultivo de línea celular PC12 en medio DMEM completo (2 mM L-glutamina, 10% suero de caballo fetal (FHS), 5% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/ml de penicilina, 100 g/mL estreptomicina).
  NOTA: Los sueros son libres de exosomas en todo el procedimiento.
2. Añadir un vidrio de cubierta (todos los pozos) a una placa de 24 pozos; cubrir la placa con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y semilla 260.000 células/pozo.
3. Incubar las células a 37oC por debajo del 5% de CO₂.
4. Después de 24 horas de incubación, cambie el medio a medio de diferenciación DMEM (DMEM con 2 mM de L-glutamina, 0,1% FHS, 100 UI/ml de penicilina, estreptomicina de 100 g/ml) con 1 x 10⁶ microgliaVS (desde el paso 1.1.2).
  NOTA: La condición de control se realiza sin microglia EVs en el medio de diferenciación.
5. En el día 4 después de la siembra, cargue todos los potes con 100 l de medio DMEM completo.
6. En el día 7 después de la siembra, fijar las células con 4% de PFA durante 20 minutos en RT y enjuagar tres veces (10 min cada uno) con PBS.
7. Manchar las células con falhalloidina conjugada con rodamina durante 30 min a 4 oC y enjuagar 3 veces (10 min cada una) con PBS.
8. Manchar las células con Hoechst diluido 33342 (1:10.000) durante 30 min a RT y enjuagar 3 veces (10 min cada uno) con PBS.
9. Monte el cristal de la cubierta en un portaobjetos con medio de montaje fluorescente (consulte Tabla de materiales).
10. Analizar la diapositiva con un microscopio confocal, tomar 5 imágenes aleatorias de cada diapositiva.
11. Mida el crecimiento de la neurita utilizando un software automatizado de cuantificación (longitud total de la neurita) como se describe en detalle en otros^{lugares 43}.
Neurita supera el crecimiento de las neuronas primarias de rata
1. Recubrir un portaobjetos de vidrio de 8 pocín con poli-D-lisina (0,1 mg/ml) y laminina (20 g/ml).
2. Neuronas primarias comerciales de ratas de cultivo en medio de cultivo adecuado (ver Tabla de Materiales) mediante el enchapado de 50.000 células por pozo e incubando las células a 37 oC por debajo del 5% de CO₂ durante 48 h.
  NOTA: Los sueros están libres de exosomas en todo el procedimiento.
3. Añadir 1 x 10⁶ microglia EV al medio de cultivo de neuronas e incubar a 37 oC por debajo del 5% de_CO2 durante 48 h más.
  NOTA: La condición de control se realiza sin microglia EVs en el medio de cultivo de neuronas.
4. Siga los pasos 4.1.6 a 4.1.9 para fijar y manchar las células.
5. Siga los pasos 4.1.10 y 4.1.11 para analizar la diapositiva.
Invasión de células de Glioma
1. Células de glioma de rata resuspendidas C6 en medio DMEM completo (DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x antibióticos) que contienen 5% de colágeno a una concentración final de 8.000 células en 20 l.
  NOTA: Los sueros están libres de exosomas en todo el procedimiento.
2. Coloque 5 ml de PBS EN la parte inferior de un plato de cultivo de tejido de 60 mm. Invierta la tapa y deposite las gotas de 20 ml (8.000 células) de la suspensión celular en la parte inferior de la tapa.
3. Invierta la tapa en la cámara inferior llena de PBS e incuba la placa a 37oC y 5%_{coc durante} 72 h hasta que se forme esferoides celulares.
4. Añadir 1 x 10⁸ EVs de macrófagos (del paso 1.2.2) a una mezcla de colágeno de 2,2 mg/ml (2 ml de solución de colágeno bovino tipo I [3 mg/ml] con 250 ml de medio esencial mínimo de 10x (MEM) y 500 l de hidróxido de sodio de 0,1 M).
  NOTA: La condición de control se realiza sin vehículos eléctricos macrófagos en la mezcla de colágeno.
5. Distribuir la mezcla de colágeno que contiene EV en una placa de 24 pozos para incrustar esferoides celulares.
6. Implantar los esferoides celulares recién formados en el centro de cada pozo.
7. Incubar la placa durante 30 min a 37oC y 5% de CO₂ para solidificar el gel.
8. A partir de entonces, superponga 400 l de un medio DMEM completo en la matriz de colágeno en cada pocól.
9. Incubar el sistema completo durante un total de 6 días a 37oC y 5% de CO_2.
  NOTA: La invasión celular fuera del esferoide es monitoreada por la fotografía digital usando un microscopio de luz invertido usando un objetivo 4x/0.10 N.A.
10. Adquiere imágenes de cada pozo todos los días.
11. Procesar imágenes y cuantificar la invasión de áreas esferoides celulares utilizando el software como se describió anteriormente en detalle⁴².
  NOTA: Las áreas de invasión y esferoides se normalizaron por cada día a las áreas de invasión y esferoides medidas el día 0.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno de los principales desafíos para atribuir efectos biológicos a las vesículas extracelulares (EV) es la capacidad de aislar los vehículos eléctricos de todo el medio de cultivo. En este informe, presentamos un método que utiliza la ultracentrifugación (UC) y la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) que se acopla al análisis a gran escala de firmas de proteínas para validar marcadores EV e identificar compuestos bioactivos. Los vehículos eléctricos derivados de macrófagos o microglia fueron aislados del medio acon...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sistema nervioso central (SNC) es un tejido complejo en el que la comunicación de célula a célula regula las funciones neuronales normales necesarias para la homeostasis³⁰. Los vehículos eléctricos ahora son ampliamente estudiados y descritos como cargas moleculares importantes para la comunicación de célula a célula³¹. Entregan específicamente un cóctel de mediadores a las células receptoras, afectando así a sus funciones en condiciones sanas y patológicas

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo presentado contó con el apoyo del Ministerio de Educación Nacional, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos al BICeL- Campus Scientific City Facility por el acceso a instrumentos y consejos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier por la asistencia de espectrometría de masas. Agradecemos a Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli y Pierre-Eric Sautiére por su fuerte contribución a los avances científicos y técnicos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12% Mini-PROTEAN Geles de proteínas prefabricados TGX	Bio-rad	4561045EDU&	nbsp;
Acetonitrilo	Fisher Chemicals	A955-1
Filtro centrífugo Amicon 50 kDa	Merck	UFC505024
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 &alfa;/β anticuerpo (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
Suplemento B27 Plus	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Mezclador de vórtice	Benchmark Scientific	BV1003
Concentrado de reactivo de colorante de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
Célula de glioma de rata C6	ATCC	ATCC CCL-107
Tubos canónicos	Sarstedt	62.554.002
Centrífuga	Eppendorf	5804000010
Incubadora CO₂ ThermoFisher
Microscopio confocal LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Cubreobjetos	Marienfeld	111580
Plato de cultivo (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 Cromatógrafo de líquidos	ThermoFisher
Microscopio electrónico JEM-2100	JEOL
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Base de datos FBS ExoCarta agotada por exosomas
(100 proteínas principales de Evs)			http://www.exocarta.org/
Suero Fetal Bovino	Gibco	16140071
Suero Fetal de Caballo		Biowest S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Fisherbrand Q500 Sonicator con sonda	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Medio de montaje de fluorescencia	Agilent	S3023
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	695076
Rejillas de cobre recubiertas de carbono Agar	scientific Ltd	AGS162-3
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldehído	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Microscopio óptico invertido CKX53	Olympus
L-glutamina	Gibco	25030-024
LabTek II 8 pozos	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
Software MaxQuant (software de identificación de proteínas)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Espiga	Polaco Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Metilcelulosa	Sigma-Aldrich	M6385-100G
Agua MiliQ	Merck Millipore
Leche	Regilait	REGILAIT300
Mini célula de electroforesis vertical PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC
Columna MonoP FPLC	GE Healthcare		ya no está disponible
Nanosight NS300	Malvern Analítico	NS300
Software NanoSight NTA v3.2	Malvern Panalytical
Bomba de jeringa NanoSight	Malvern Panalytical
Gibco	Neurobasal	21103-049
Membrana de nitrocelulosa	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multiplato 24 pocillos	ThermoFisher	82.1473
Electromicroscopía	de paraformaldehído	15713
Línea celular PC-12	ATCC	ATCC CRL-1721
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122
Mezcla de calibración de péptidos	LaserBio Labs	C101
Peroxidasa AffiniCabra pura Anti-Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Software Perseus (Procesamiento de proteínas identificadas)			https://maxquant.net/perseus/
Conjugado faloidina-tetrametilrodamina	Santa-cruz	sc-362065
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo	Sigma-Aldrich	78830
Tampón de fosfato solución salina	Invitrogen	14190094	sin calcio, sin magnesio
pluriStrainer M/ 60 µ m	pluriSelect	43-50060
Poly-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407
Tubos de centrífuga de policarbonato	Beckman Coulter	355651
Inhibidor de la proteasa	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
Sistemas de celdas	PureCol	5005
Q-Exactive espectrómetro de masas	ThermoFisher
espectrómetro de masas rapifleX	Brucker
Neuronas corticales de rata	Aplicaciones celulares	R882N-20	Origen de la célula : Derivado de las cortezas cerebrales del día 18 cerebros de rata embrionarios de Sprague Dawley
Macrófago de rata & Medio de cultivo de microglía	Aplicaciones celulares	R620K-100	Cell orgin : Médula ósea de rata saludable
Macrófagos primarios de rata	Aplicaciones celulares	R8818-10a
Microglía primaria de rata	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare 17014001
Tripsina modificada de grado de secuenciación	Promega	V5111
Deslizador	polvo	100204
Cloruro de sodio	Scharlau	SO0227
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Hidróxido de	sodio Scharlab	SO0420005P
Pirofosfato de sodio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentrador de vacío SpeedVac	ThermoFisher
Software de cadenas (redes de asociación de proteínas funcionales)			https://string-db.org/
Sustrato de duración extendida SuperSignal West Dura	ThermoFisher	34075
Jeringa 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD Célula de transferencia semiseca	Bio-Rad	1703940
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glycine	Euromedex	EU0550
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A95765
rotor ultracentrífugo 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Acetato de uranilo	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Papel de filtro Whatman	Sigma-Aldrich	WHA10347510
&alfa;-Ácido ciano-4-hidroxicinámico	Sigma-Aldrich	C2020-25G

Ciencia normal de

Referencias

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Immune Cells Ultracentrifugation Size Exclusion Chromatography Nanoparticle Tracking Analysis Western Blot Proteomics Analysis Neurite Outgrowth Glioma Cell Invasion Microglia derived EVs

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