El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.
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Artículo de método
Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Definir el modelo ideal para un estudio in vitro es esencial, principalmente si se estudian procesos fisiológicos como la diferenciación de células. En el estroma tumoral, los fibroblastos del huésped son estimulados por las células cancerosas para diferenciarse. Por lo tanto, adquieren un fenotipo que contribuye al microambiente tumoral y apoya la progresión tumoral. Mediante el uso del modelo de esferoides, hemos configurado un sistema de modelo 3D in vitro, en el que analizamos el papel de laminina-332 y su receptor integrador n.o 3-1 en este proceso de diferenciación. Este sistema modelo esferoide no sólo reproduce las condiciones tumorales de microambiente de una manera más precisa, sino que también es un modelo muy versátil ya que permite diferentes estudios aguas abajo, como la tinción inmunofluorescente tanto intra- como extracelular marcadores, así como proteínas de matriz extracelular depositadas. Además, los análisis transcripcionales por qPCR, citometría de flujo e invasión celular se pueden estudiar con este modelo. Aquí, describimos un protocolo de un modelo esferoide para evaluar el papel de la integrina de los CAFs n.o 3-1 y su ligando depositado ectopáticamente, laminina-332, en la diferenciación y en el apoyo a la invasión de células cancerosas de páncreas.
Introducción
El microambiente tumoral es un nicho muy complejo y extremadamenteimportante para el mantenimiento y la progresión de las células tumorales 1. Se forma no sólo por las células cancerosas, sino también por los fibroblastos estromales. Las células tumorales están rodeadas por un estroma quees específico y diferente del estroma de los tejidos normales 2. Laminin-332 es una proteína de matriz extracelular expresada ectópicamente en el estroma de diferentes tumores, como el adenocarcinoma pancreático3. Además, la composición bioquímica del ECM y también sus propiedades biofísicas, como
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Protocolo
1. Esferoides 3D como modelo in vitro para la diferenciación de fibroblastos/CAF utilizando diferentes compuestos de inhibición de TGF-1 de interacción célula-matriz
- Mezclar 1 parte de la solución de metilcelulosa de 6 mg/ml y 3 partes de los medios de cultivo celular, MEM complementado con 1% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina para obtener la solución de formación de esferoides.
- Resuspender los fibroblastos normales inmortalizados recién desconectados (iNF), CAF inmortalizado (iCOF) o integrin a 3o KO iCAF (paso hasta 25) en la solución de formación de esferoides. Si prepara una placa de 96 pozos, prepa....
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Resultados
Los resultados de este diseño experimental se publican en Martins Cavaco et al.13, que se recomienda para una lectura posterior sobre las conclusiones que se extrajeron de estos experimentos.
Figura 1, una imagen representativa de un esferoide inmunofluorescente, muestra la inmunomancha de la subunidad integrina n.o 3 tanto de los fibroblastos normales inmortalizados como de .......
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Discusión
Desarrollar un modelo in vitro adecuado para estudiar la diferenciación CAF es una tarea difícil. Después de emplear diferentes enfoques, llegamos a la conclusión de que un modelo de esferoides 3D es el modelo más práctico, fisiológico y clínicamente relevante, en el que se puede estudiar la interacción entre células de carcinoma pancreático con CAF inmortalizados. Este modelo previno la diferenciación espontánea de fibroblastos, debido a factores de estrés artefactosfásicos como la rigidez del plástico de cultivo celula.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses. Este material refleja únicamente las opiniones del autor y la Unión Europea no se hace responsable de ningún uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo.
Agradecimientos
Reconocemos la ayuda de Barbara Schedding en la preparación del BM2 y el lebein-1. Reconocemos a Gnes Noel por compartir su experiencia en ensayos esferoides. Agradecemos a Sonja Schelhaas y Michael Sch-fers por su ayuda en el manejo de la transfección lentiviral bajo condiciones S2. Reconocemos la asistencia de Sabine von R-den en la preparación de los CAF a partir del tejido de cáncer de páncreas.
La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Programa de Personas (Marie Curie Actions) del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Unión Europea/ en virtud del acuerdo de subvención rea (316610) a J.A.E. Ad....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminina y beta; 3 subunidades Ratón (monoclonal) | Casero | ||
| A3IIF5 Anti-y alfa; 3 subunidad de integrina Ratón (monoclonal) | Amablemente proporcionado por el Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetona | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Fracción V de Albúmina - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-Ratón | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Conejo | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminina y gamma; 2 subunidades Ratón (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Conejo (policlonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Ratón (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 línea celular | ATCC | Amablemente dado por el prof. Jörg Haier's Lab | |
| Centrífuga de banco | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminina y alfa; 3 subunidades de ratón (monoclonal) | Amablemente proporcionado por la Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Centrífuga Fluka | 21074 | |
| Thermo | Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Corning | 430290 | |
| Colagenasa B | Roche 11088831001 | ||
| Colágeno-I, cola de rata | Gibco | A10483-01 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 700 y 800 | |
| DMEM (Alta glucosa 4,5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Matriz gelificante | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Cabra IgG, isotipo | DAKO | X 0907 | |
| Suero de caballo | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Fibroblastos pancreáticos primarios humanos | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubadora | Heraeus | B6060 | |
| Laminina-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplaca, 96 pocillos, fondo en U | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotipo | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Mezclador giratorio multieje | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Amablemente dado por el Prof. Jorg | |
| Paraformaldehído de laboratorio de | , Riedel-de Haë n | 16005 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Kit de transcripción inversa | Qiagen | 205310 | |
| IgG para ratas, isotipo | Invitrogen | 10700 | |
| Tubos de reacción, 1,5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Ciclantador de PCR en tiempo real | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Verde Kit PCR | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Añadir glucosa a 4,5 g (filtro de 0,2 mmm) y piruvato de sodio al 1% |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vó rtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, sin recubrimiento | Ibidi | 81501 |
Referencias
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High inters....
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Reimpresiones y permisos
