Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Resumen

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

Introducción

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus¹. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros². El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral³. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia⁴. El método utiliza material cerebral fresco o fresco congelado, una impresión táctil en una diapositiva, fijación en acetona, tinción utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (mAbs/pAbs) de isotiocianato fluorescente (FITC) disponibles comercialmente y leídos por la microscopía de fluorescencia⁵. La prueba DFA es rápida, sensible y específica para la detección de antígenos de rabia en tejido cerebral fresco. Recientemente, se demostró que una prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT), técnica de inmunohistoquímica modificada (IHC), exhibe una sensibilidad similar a la DFA, pero ofrece la ventaja de la microscopía de luz para la visualización⁶. Si bien el método de detección utilizado en DRIT es similar al IHC, el paso inicial utiliza tejidos frescos o congelados para generar impresiones táctiles de la muestra seguidas de fijación en formalina.

IHC es una técnica ampliamente utilizada para determinar cambios histológicos y la detección de proteínas utilizando anticuerpos específicos en tejidos fijos con formalina incrustados en bloques de parafina. IHC es una prueba alternativa establecida para la detección del antígeno de la rabia en las secciones de tejido⁷. La IHC se ha utilizado particularmente para el diagnóstico de casos retrospectivos que exhibieron enfermedades neurológicas para determinar la carga de la rabia⁸. Los tejidos fijados en formalina incrustados en parafina preservan las proteínas para la detección incluso después de varios años cuando se almacenan a temperatura ambiente⁹. El tratamiento con formalina modifica las proteínas mediante la reticulación y alteración de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que podría hacer que los epítopos ya no sean reactivos contra los anticuerpos¹⁰. Si bien la prueba IHC para la detección de antígenos de rabia involucra mAbs o pAbs, este último es ventajoso ya que se pueden detectar múltiples epítopos y lissavirus divergentes¹¹.

Los pasos estándar involucrados en la IHC son la fijación de formalina de los tejidos, la incrustación en bloques de parafina, la seccionamiento de los tejidos, la desparafinación y la hidratación, la recuperación del epítopo, la reactividad contra los anticuerpos primarios y secundarios, y el desarrollo utilizando sustratos cromogénicos. Este manuscrito describe una descripción detallada del protocolo para el diagnóstico de la rabia. Para la detección de antígenos de la rabia, se utiliza suero de ratón inmunizado con RABV (pAbs) generado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos en Atlanta, Georgia, en combinación con anticuerpos secundarios biotinilados contra ratones. Los abs biotinilados se detectan mediante la adición del complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) seguido del desarrollo del color con sustrato de amino-etilcarbazol.

Protocolo

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe¹². Además, se debe seguir la contención y el manejo adecuados de productos químicos peligrosos (como formalina, AEC y xileno) (por ejemplo, campanas extractoras).

1. Fijación de formalina de los tejidos

1. Coloque los tejidos cerebrales de 3-5 mm recolectados después de la necropsia¹³ en una solución de formalina tamponada con fosfato al 10% (proporción de 1:20 a 1:50 tejido/formalina) durante 24-72 h.
   PRECAUCIÓN: La formalina es un fijador tóxico.
2. Registre el peso aproximado del tejido (tamaño), el tipo de tejido (áreas del cerebro) y el volumen de formalina. Es importante que los laboratorios documenten y mantengan registros sobre los tiempos de fijación.
3. Para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento, coloque el tejido en etanol al 70%.

2. Procesamiento de tejidos

1. Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, por ejemplo, secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo (3 lóbulos) o el hipocampo (ambos hipocampos) cada uno cortado de 3 a 5 mm de grosor y colocado en casetes de procesamiento.
2. Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina, incrustados en bloques de parafina y seccionados (3 a 6 μm) en un microtomo.

3. Preparación de Materiales / Platos de tinción

1. Configure el plato de tinción¹⁴ (Tabla de materiales)como se muestra en la Figura 1. Llene cada plato con 250 ml de la solución.
2. Preparación de la solución de sustrato de 3-Amino-9-etilcarbizol (AEC)
   1. Disuelva una tableta de 20 mg de 3-amino 9-etilcarbazol (AEC) en 5 ml de N,N, dimetilformamida usando una pipeta de vidrio.
      PRECAUCIÓN: AEC es un carcinógeno.
3. Preparación de la solución madre de proteasa (por ejemplo, Pronasa) para la recuperación de antígenos
   1. Disolver 7 mg de la proteasa en 200 ml de PBS.
4. Preparación del tampón de enjuague PBS-T
   1. Agregue 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Mézclalo bien para formar una solución homogénea.

4. Desparafinación y rehidratación tisular

1. Haga una sección de parafina de 5 μm con un microtomo, flote en un baño de agua a 38 ° C y recójala en portaobjetos de vidrio. Etiquete las diapositivas con un bolígrafo/marcador resistente a los reactivos.
2. Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno de 55-60 °C durante 1 h. No eleve la temperatura por encima de 60 ° C, ya que puede destruir el antígeno viral.
3. Retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafina en 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 min cada uno en los platos 1, 2 y 3.
4. Rehidratar las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en la dilución decreciente de etanol a agua desionizada: (4 a 11 es un enjuague por inmersión) plato 4: xileno / 100% etanol (1: 1); plato 5: 100% etanol; plato 6: 100% etanol; plato 7: 95% etanol; plato 8: 95% etanol; plato 9: 80% etanol; plato 10: 70% etanol; plato 11: agua desionizada (Figura 1. Configuración del plato).
   PRECAUCIÓN: El xileno es un producto químico peligroso y el trabajo debe realizarse en una campana extractora de humos.

5. Recuperación de antígenos proteolíticos

1. Tratar los portaobjetos con la proteasa (2,5 μg/ml de PBS) durante 30 min para la recuperación de antígenos proteolíticos en el plato 12.
2. Luego enjuague en PBS-T durante 10 minutos (plato 13).
3. Tratar con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 14).
4. De nuevo, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 15).

6. Procedimiento de tinción

1. Maneje las diapositivas de una en una manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en el búfer (no retire todo el soporte de la diapositiva, mantenga las diapositivas húmedas). Retire un portaobjetos y elimine el exceso de tampón (con una toalla de papel) de alrededor de la sección de pañuelos de papel teniendo cuidado de no perturbar la sección de pañuelos. Incubar diapositivas en una cámara de humedad, hecha colocando toallas de papel humedecidas, en el banco de laboratorio¹⁴ a temperatura ambiente con suero de cabra normal (bloqueo) durante 15 min.
2. Incubar con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo (dilución 1:250 del suero antirrábico de ratón, no publicado) (control positivo) y anticuerpos de control negativos a temperatura ambiente igual que el anterior (paso 6.1.) durante 60 min sin lavados intermedios.
3. Después de 60 min, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
4. Incubar con el anticuerpo biotinilado (específico de la especie) en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual que el paso 6.1.).
5. Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
6. Incubar con el complejo Streptavidin-HRP en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual a 6.1.).
7. Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).
8. Incubar con sustrato de peroxidasa, amino-etilcarbazol (AEC), en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 min. Haga AEC justo antes de su uso. Para hacerlo, agregue 1 ml de solución de stock AEC a 14 ml de tampón de acetato 0.1M, pH 5.2. Añadir 0,15 mL de 3% H₂O₂. Filtrar la mezcla justo antes de su uso (filtro de 0,45 μm).
   NOTA: La solución de trabajo de AEC solo es estable durante 2-3 h. La solución de stock AEC se puede almacenar en el refrigerador durante períodos más largos.
9. Lavar en agua desionizada 10 min (plato 17)
10. Contrateñido con hematoxilina de Gill diluida 1:2 con agua desionizada durante 2 min (plato 18).
11. Enjuague el exceso de hematoxilina con enjuague por inmersión con agua desionizada (platos 19 y 20).
12. Enjuague en Scott's Tap water 30 s (solución de azulado) plato 21.
13. Lavar en agua desionizada 10 min (plato 22)
14. Retire las diapositivas de una en una: monte con un medio de montaje soluble en agua.
15. Lea diapositivas en un microscopio de luz.

Resultados

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden al...

Discusión

Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del antígeno RABV....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3% peróxido de hidrógeno Marcas		Pharamacy	Listo para usar 3% H2O2
3-amino-9-etilcarbazol (AEC)	Millipore Sigma	A6926
Tampón de acetato pH 5.2	Poly Scientific R& D Corp.	s140
Formalina tamponada 10% Fosfato tamponado	Fisher Scientific	SF100-4	Certified
Cubreobjetos Corning	Fisher Scientific	12-553-471	24 X 50 mm
Etanol 190 Proof	Pharmco-AAPER	111000190
Etanol 200 Proof	Pharmco-AAPER	111000200
Formulación de hematoxilina de Gill #2	Fisher Scientific	CS401-1D
HistoMark Biotina-Estreptavidina Peroxidasa Kit	seracare	71-00-18	Anticuerpo primario de ratón
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	Medios
de montaje N,N, Dimetilformamida GR	Fisher Scientific	D119
Solución salina tamponada con fosfato	HyClone	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo	Múltiples proveedores
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo	Múltiples proveedores
Pronase	Millipore Sigma	53702	Proteasa, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water	Investigación y análisis de Poly Scientific D Corp.	s1887
Tissue-Tek Juego de tinciones Slide	Fisher Scientific	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
Xileno	Fisher Scientific	X3S-4	Grado histológico
Zeiss Axioplan 2 imágenes - microscopio	Múltiples proveedores