Summary
Burada, çeşitli nörolojik bozukluklar ve hastalıklarda bozulduğu bilinen farelerde yuva kurma davranışını ölçmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol, dört malzemenin yararını inceler ve testin geçerliliğini ve güvenilirliğini artırarak puanlamada rater anlaşmasını ölçme fırsatı sunar.
Abstract
Yuva oluşturma, laboratuvar ortamlarında yetiştirilse bile, erkek ve dişi kemirgenlerde doğuştan gelen bir davranıştır. Bu nedenle, birçok araştırmacı kemirgenler sentetik ve / veya doğal malzemeler (ip, doku, pamuk, kağıt ve saman gibi) genel refahı bir göstergesi olarak ve yardımcı değerlendirme olarak biliş olası düşüş tahmin etmek için sağlar. Genellikle, yuva oluşturmama gibi iç içe geçme davranışlarındaki değişiklikler, sağlık veya refahta bir değişikliğe işaret eder. Buna ek olarak, yuvalama davranışı birçok çevresel ve fizyolojik zorlukların yanı sıra patolojik hastalık durumları altında yatan birçok genetik mutasyonlar duyarlıdır. Aşağıdaki protokol, dört tür iç içe malzemenin kullanımını inceleyen bir iç içe geçme davranışı paradigmasını açıklar. Buna ek olarak, protokol, yuvalar pamuk kareler, kağıt bükümleri ve yumuşak cob gibi diğer yaygın yuvalama malzemeleri ile karşılaştırıldığında parçalanmış kağıttan inşa edildiğinde, oranlar arası güvenilirliğin daha yüksek olduğunu göstermek için sınıf içi korelasyonlar kullanır Yatak. Bu değerlendirme için seçilen metodoloji ve istatistiksel hususlar (örn. sınıf içi korelasyon) farelerin yaşam kalitesini değerlendiren deneyler yapanların ilgisini çekebilir.
Introduction
Yuva inşası kuşlar, balıklar, kemirgenler ve büyük maymunlar gibi birçok hayvanda doğuştan gelen bir davranıştır ve azalmış esenlik ve engellilik ile karakterize nörolojik hastalıklar ve bozukluklar çalışmalarında potansiyel yararı için daha fazla dikkat çekiyor günlük yaşam aktiviteleri1. Fareler, hem erkek hem de dişi, üreme amaçlı benzer büyüklükte yuvalar inşa, ısı koruma, ve barınak; daha da önemlisi, laboratuvarayarlarında2 yükseltilmiş bile bunu yapmaya devam . Hess, Petrovich ve Goodwin3 biyolojik olarak uygun uyaranların yuvalama gibi biyolojik olarak uygun davranışları teşvik etmek için çok önemli olduğunu savunuyorlar; ancak, saman, kenevir, pamuk ipi, kağıt şeritler, pamuk diş topları ve preslenmiş pamuk kareler gibi doğal ve yapay malzemelerin çeşitli, yuva bina davranışı değerlendirmek için kullanılmıştır2. Bu iç içe geçme davranışlarındaki değişiklikler (örneğin, sağlanan malzemeden yuva oluşturulamaz) genellikle sağlık veya refahtaki bir değişimi gösterir. Çoğu durumda, yuva bina eksikliği olumsuz refahı etkileyen çeşitli faktörlere atfedilir. Farelerde yuva oluşturma kalitesini etkili bir şekilde düşüren bu tür örnekler arasında aşırı sıcaklık; ağrılı stimülasyon; indüklenen hastalık ve enfeksiyon; genetik mutasyonlar; ve medial preoptik alanlarda beyin lezyonları, septum, ve hipokampus4,5,6.
Alzheimer hastalığı beyin dokusu kaybı ile karakterize ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır, ekstrasellüler amiloid-β plakbirikimi, ve hücre içi nörofibrillary tangles oluşan hiperfosforile mikrotübül ilişkili protein, tau7. Ayrıca, Alzheimer hastalığı ile karakterizedir, en önemlisi, öğrenme ve hafıza ve günlük yaşam faaliyetlerinin bozuklukları açıkları. Farelerde, günlük yaşam faaliyetleri yaygın sirkadiyen tekerlek çalışan üzerinden incelenir8,9,10,11, yuvalama gibi yeni alternatifler rağmen, popülaritesi artmaktadır. Yuvalamanın, alzheimer hastalığının risk faktörleri ve/veya nedenleri olarak tanımlanan manipülasyonlara (örn. genetik mutasyonlar, çevresel stres faktörleri) karşı hassas olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, iç içe alzheimer hastalığının bu özelliklerini model birçok fare suşları ek veya tamamlayıcı bir tsay olarak kullanılabilir. Örneğin, Deacon ve meslektaşları12 İsveç amiloid öncüprotein (APPswe) ve presenilin 1 (PS1) genetik mutasyonlar ile Tg2576 farelerin yuva bina ölçülür. Grup bünyesinde ki Tg2576 fareler tarafından yapılan yuvaların kalitesi, hem 3 hem de 12 aylıkken yabani tip kontrollerinden önemli ölçüde daha kötüydü. Bu bulgularla uyuşan Filali ve ark.13, tek başına barındırılan APPswe/PS1 erkek farelere 5 x 5 cm pamuktan iki parça verilen 1 - 5 (1 = nestlet dokunmadı, 5 = mükemmele yakın bir yuva) olarak derecelendirilen önemli ölçüde daha fakir yuvalar yapıldığını bildirmiş. Transgenik fareler, vahşi tip benzerlerine kıyasla 6, 9 ve 12 aylıkken sürekli olarak daha kötü yuvalar inşa ettiler ve bazı durumlarda Appswe/PS1 fareler sağlanan pamuktan yuva yapmayı tamamen başaramadılar.
Bizim laboratuvar önceki araştırma wildtype C57BL / 6J fareler CRND8 ve CRND8/E4 fareler9ile karşılaştırıldığında pamuk kareler dışında önemli ölçüde daha iyi yuvalar inşa göstermiştir . Ancak, preslenmiş pamuk kareler kullanarak deneylerin çoğunluğu değişken gibi görünüyor, wildtype fareler yuvalama çok düşük puanlar göstermesi bekleniyor transgenik fareler e göre beklenen yüksek puanları göstermek için başarısız2, kısmen yol açabilir tahmini parametreler (yani, ortalama farklılıklar) ve istatistiksel anlamlılık farklılıklarının eksikliği. Farklılıkların eksikliği kısmen farelerin yetersiz yaşlanmaveya yuvalama için ayrılan zaman nedeniyle olabilir. Alternatif olarak, iç içe malzeme ek bir sorun olabilir, hatta fare zorlanma ile etkileşime olabilir malzeme nin miktarı ve türü, araştırmacıların metodolojik tercihleri nedeniyle daha fazla değişkenlik ile sonuçlanan. Örneğin, Robinson-Junker ve iş arkadaşları14 farklı boyutlarda işlenmiş veya işlenmemiş yatak malzemesi (örneğin, küçük veya büyük pullar) C3H/HeNCrl farelere ve balb/cAnNCrl farelere, sırasıyla kötü ve güçlü olarak gözlenen yuva inşaatçılar. İşlenmemiş yatak lar sağlandığında, C3H fareleri BALB/c farelerine kıyasla daha az karmaşık, ancak kaliteli yuvalarda benzer bir yapı inşa ettiler. Aynı şekilde, Martin ve meslektaşları15 geyik fareler, farklı evrimsel farklılıklar (yani, ağaçlarda yuva olasılığı daha yüksektir mus musculus türlerinin uzak bir akrabası verilen farklı yuva malzemeleri yuva karmaşıklığı karşılaştırıldı ve underbrush ve esaret daha aktif), ama ortak laboratuvar fareleri olarak benzer hayvancılık bakım almak ve herhangi bir mevcut yumuşak, lifli malzeme16,17,18yuva inşa . Ev kafesinde yavrulu dişiler ve yetiştiriciler erkeklere göre daha karmaşık yuvalar inşa etti ve yazarlar bu davranış farklılıklarıgeyik farelerde progesteron konsantrasyonlarında ilişkili değişiklikler nedeniyle olabileceğini düşündürmektedir15. Daha da önemlisi, fareler kahverengi kağıttan ve ardından pamuklu karelerden oluşan daha karmaşık yuvalar inşa etmişler ve en az karmaşık yuvalar beyaz kağıt ve dağınık mini-pamuk karelerden yapılmıştır.
Yuvalamanın artan popülaritesine rağmen, bilimsel olarak geçerli, uygun maliyetli ve zamana duyarlı uygulamalarla ilgili hususlar asgari düzeyde tartışılmaktadır. Söz konusu metodolojik ve ekonomik zorluklar göz önüne alındığında, bu protokol farklı yuvalama malzemelerinin yarar araştırır - pamuk kareler, kağıt katlanmış, parçalanmış kağıt, ve işlenmiş yatak - yuvalama davranışı. Özellikle, hem yaşlı C57BL/6J wildtype kontrolleri ve Alzheimer hastalığı APOE e4 fareler için yuvalama kalitesi malzeme etkileşimleri ile herhangi bir potansiyel genotip araştırmak için tüm yuvalama malzemeleri sağladı. Ayrıca, deney farklı malzemelerden inşa yuvaların kurlar arası güvenilirliğini değerlendirmek için çalıştı. Birlikte ele alındığında, bu protokol, yuva kalitesi ve skorer anlaşma açısından, iç içe geçen testin geçerliliğini ve güvenilirliğini artırmak amacıyla, bu örnekteki bir iç içe malzemenin -parçalanmış kağıt- üstünlüğünü göstermektedir.
Protocol
Tüm prosedürler George Mason Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon tarafından belirlenen kurallara uygun olarak.
1. Değerlendirme den önce hayvanlar ve dikkat edilecek hususlar
- Bu protokol için, yetişkin kullanın, 9 - 12 aylık C57BL/6J(n = 10) (stok # 000664) wildtype fareler ve APOE e4 fareler(n = 11) bir hemizygous J20 (stok #006293) x homozigot APOE e4 (stok #012307) çapraz.
- Barınma odasında, uygun zenginleştirme ile aynı cinsten çöp ile grup ev fareler (örneğin, bu protokol için, fareler bir çalışan tekerlek, igloo ve küçük bir naylon çiğneme oyuncak sağlanmıştır). Grup evi 4 - 6 dişi fare ve 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H ev kafesinde 4 erkek.
NOT: Araştırmacılar, fareler yuvalama denemelerinden sonra tekrar piyasaya sürüldüğünde kafes arkadaşı saldırganlığını önlemek için yuvalamadan önce ve/veya sonra stratejiler uygulamayı düşünebilirler. Bu tür stratejiler içerebilir, ancak bunlarla sınırlı değildir, davranışsal testler sırasında daha iyi uyum fareler için davranışsal test öncesinde günlük kullanım, araştırmacılar, ve hayvancılık personeli19, ayıran ve bireysel olarak konut agresif fareler, veya kafes teki fare sayısını azaltmak20, kafes içi dövüşlerin şiddetine bağlı olarak, gözlenen yaralar21, vb.
2. Oda ve yuvalama kurulumu
- Her farenin dört denemeyi (deneme başına 1 malzeme) tamamladığından emin olun. Sipariş efektini önlemek için her fare için iç içe geçme malzemesinin sırasını rasgele leştirin.
- Kafesleri ayrı bir test odasında hazırlayın. Çevresel koşulları (örn. 22,2 – 22,3°C, %45-47 nem, 09:00 - 21:00 arası ışıklar) denemeler arasında tutarlı ve barınma odasıyla aynı şekilde kaydedin. Gıda ve su reklam libitumsağlayın.
- Her fareye rastgele bir kimlik (kimlik) numarası veya harf atayın. Rastgele tanımlayıcı kartını 29,2 x 18,4 cm'lik bir kafese takın.
- Asistanların ve hayvancılık personelinin koşullara karşı kör kalmasını sağlamak için orijinal hayvan kimliğini/etiketini ve diğer gerekli kimlik bilgilerini koloni kayıtlarına kaydedin.
- Test odasında, yabani tip ve transgenik farelerin uygunsuz bir şekilde ayrılmaması için (örneğin, odanın zıt taraflarında, ayrı raflarda vb.) rastgele kafes yerleştirmeemri verilir.
- Kafesin altını yeterince kaplayarak yuvalama malzemelerini hazırlayın. Kare, büküm ve rendelenmiş kağıt denemeleri için yaklaşık 100 g kuru mısır koçağı yatak takımı ve yumuşak koçan denemesi için yaklaşık 100 g yumuşak koçan yatak ları kullanın.
- Yuvalama malzemedağıtmak için bir beher kullanıyorsanız, o zaman mısır koçan yatak veya yumuşak koçan yatak ile en fazla 100 mL beher doldurun.
- Fareyi kafese sokmadan önce ilk iç içe geçme malzemesini sırayla yerleştirin. Bu protokolde (1) tek bir preslenmiş pamuk kare, (2) tek bir kağıt büküm, (3) 100g yumuşak koçan yatak sadece (yani, ek yatak veya yuvalama malzemesi eklendi) ve (4) temiz 2,5 g temiz (mürekkep yok), parçalanmış beyaz yazıcı kağıt 5 - 7cm şeritler halinde kesilmiş. Şekil 1'de (taban çizgisi) gösterildiği gibi iç içe geçme malzemelerini dağıtın.
Şekil 1: Her malzeme için kafes kurulumu. Tüm fareler toplam dört deneme için her malzeme türüyle bir deneme tamamladı. Corncob yatak bir kağıt büküm, preslenmiş pamuk kare ve rendelenmiş kağıt içeren kafeslerin tüm alt astarlı. Yumuşak koçan yatak eşit mısır koçan küçük pamuk kareler ayırmak için fareler teşvik etmek için kafes boyunca dağıtıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Yuvalama denemesi
- İlk iç içe geçme denemesini ışık döngüsünün başlangıcında günün aynı saatinde başlatın (örn. 9:00).
- Farelerin bulunduğu kafesi test odasına getirin. Her fareyi ev kafesinden çıkarın ve kafese yerleştirilen malzemeyle birlikte kendisine verilen yuvalama kafesine yerleştirin. Ev kafeslerini barınma odasına geri getirin.
- Farelerin 24 saat rahatsız edilmeden 1 denemeyi tamamlamasına izin verin.
- İlk denemenin başlamasından 24 saat sonra, test odasına geri dönün.
- Kafesin kapağını dikkatlice çıkarın ve her farenin yuvasını fotoğraflayın, fotoğrafta atanan kimliği yakalayın ve kafes in dışındaki herhangi bir malzemenin görünümünü en aza indirin.
NOT: Fareyi kafesten çıkarmaya çalışmadan önce yuvadan hareket etmesini bekleyin. Fare kafeste yken yuvanın fotoğrafını çekmen şiddetle tavsiye edilir. Fotoğraf çekmeden önce fareyi kafesten kaldırmaya çalışmak, farenin ürktülmesine neden olabilir, böylece iç içe geçme malzemelerinin üzerine çıkabilir ve dağıtır. - Fareyi yuvalama kafesinden yavaşça çıkarın ve geçici bir tutma kafesinde yerleştirin. Yatak takımlarını ve yuvalama malzemelerini atın, yatak takımlarını değiştirin ve sıradaki sonraki yuvalama malzemesini sağlayın ve fareyi yuvalama kafesine geri döndürün.
- 4 denemenin tümündeki puanları almak için gerektiği kadar tekrarlayın. Araştırmacılar bu protokolde tartışılan alternatif materyalleri kullanmak la ilgilenseler de, parçalanmış kağıt ve buna eşlik eden puanlama kriterlerinin kullanılması tavsiye edilir.
- Tüm denemeler tamamlandığında, fareleri ev kafeslerine geri getirin. Herhangi bir potansiyel agresif davranış için fareler gözlemleyin. Saldırganlık yaşlı wildtype erkeklerde oluşabilir.
NOT: Bu protokol açısından fareler yaklaşık 9 -12 aylıkken bir kez test edildi. Yuvalama, zaman içinde yuvalama kapasitesindeki düşüşü belgelemek ve nörodejenerasyonun olası nedensel rolünü göstermek için çeşitli yaşlarda (örneğin, daha erken yaşlarda, seçilmiş zorlanmaya bağlı olarak, phenotipik özelliklerin başlangıcından önce) yapılmalıdır.
4. Kurlar arası güvenirliliği puanlama ve değerlendirme
- Her iç içe geçmiş malzeme için, çalışmaya kör olan en az 2 kişi için temel görüntüler sağlayın. Gerekli olmasa da, golcülerin yuvalama kavramına aşina olduğundan emin olun. Golcüleri eğitirken, her malzeme türü (varsa) ve puanlama kriterleri ile ilgili olarak golcüleri tanımak için bir dizi örnek yuva (örneğin, parçalanmış kağıt için Şekil 2) sağlayın.
- Aşağıdaki ölçek bilgilerini kullanarak her yuvayı 1 - 5 arasında bir ölçekte değerlendirin (Deacon, 2006'dan uyarlanmıştır)2. Şekil 2'yi parçalanmış kağıt kullanarak örnek puanlama olarak görün.
- Parçalanmış kağıt veya küçük kareler kafes boyunca dağınık kaldı, ya da pamuk kare veya büküm dokunulmamış kaldı 1 puan atayın;
- Malzemenin bir kısmı yuvaya inşa edildiğinde 2 puan atayın, ancak malzemenin %50'den fazlası yuva yapımında kullanılmadı (yani dağınık kaldı veya orijinal malzemenin çoğuna dokunulmadı);
- Fark edilir bir yuva inşa edildiğinde 3 puan atayın, ancak birkaç parça hala dağınıktı;
- Yuva için hemen hemen tüm malzeme kullanıldığında 4 puan atayın, ancak birkaç malzeme parçası dağınık kaldı veya yuvanın yakınındaydı;
- Tüm malzeme tanımlanabilir bir yuva yapmak için kullanıldığında 5 puan atayın.
NOT: Skorerler, puanlama işlemi sırasında yorgunluk ve önyargıyı önlemek için mola vermeli ve temel fotoğrafları tekrar ziyaret etmelidir. Golcüler önyargıdan kaçınmak için skorları birbirleriyle tartışmamalıdır. Skorerler, puanlama tamamlandıktan sonra veya sınıf içi korelasyonlarla (ICC) sorunları çözebilecek puanları değiştirmek için daha fazla tartışmaya ihtiyaç duyulduğunda puanları tartışmalıdır. Sınıf içi korelasyonlar bölüm 4.2'de listelenen adımlar kullanılarak gerçekleştirilecektir.
Şekil 2: Parçalanmış kağıt kriterleri kullanılarak puanlama örneği, tercih edilen malzeme. Soldan sağa: 1 - parçalanmış kağıt el değmemiş kaldı; 2 - bazı kağıt bir yuva içine inşa edilmiş ama parçaların çoğu dağınık kaldı; 3 - fark edilir bir yuva inşa edildi, ama birkaç parça hala dağınık; 4 - çoğu parçalar yuva için kullanıldı, ancak bazı parçalar yuvanın yakınına dağıldı; 5 - tüm parçalar yuva yapmak için kullanılmıştır. Fotoğraflarda, hayvanın atanan numarasının kör edilmeden kaçınmak için gösterildiğine dikkat edin. Kartın rengi rasgele. Araştırmacılar, yuvayı dağıtabilecek fareyi ürkmemek için farenin kafeste kalmasına izin vermelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Puanları toplayın ve girdi edin ve her malzeme için her bir skorerin puanları ayrı sütunlarda olacak şekilde veri dosyasını biçimlendirin.
NOT: Ek Dosya 1kullanıyorsanız, bu analiz için kodlama komut dosyası ücretsiz, açık kaynak yazılımlar (örneğin, RStudio irr paketi)22,23gerektirir unutmayın. Komut dosyası, sınıf içi korelasyon (ICC) yapmak için üstbilgi ve özneler değişkenlerini (örn. üst satır ve hayvan iD'leri) kaldırır. Kodun çizilmiş bölümünü vurgulayarak ve Ctrl+Enter veya Command+Enter'a basarak komut dosyasını iki yönlü, anlaşmalı bir şekilde çalıştırın, iCC ölçülerini ortalamalar. - ICC'yi mevcut ölçütlerlekarşılaştırın 24,25,26. Tipik olarak, 0,80'in üzerindeki ICC değerleri, belirli bir zaman noktasında ortalamasını alan puanları haklı çıkaran güçlü kurlar arası güvenirliğe karşılık gelir(Ek Dosya 2).
- İlk kez puanlama yapanlar için ilgi çekici olabilecek rater içi güvenilirlik için aynı ICC kriterlerini kullanın.
DİkKAT: Golcüler ilk değerlendirmeden sonraki bir hafta içinde aynı fotoğraflanmış yuvaları puanlamalıdır. ICC düşük olduğunda veri ortalaması ile dikkatli olun, bu verileri çarpıtabilir veya null bulgular üretebilir. ICC değerleri düşükse, (1) golcüler için ek eğitim gerekebilir, (2) golcülerin yuva skorları için gerekçelerini tartışmaları gerekebilir, (3) skorlarla ilgili bir karar vermek için başka bir bağımsız hakem gerekebilir veya (4) kur kurusu güvenilirliğin değerlendirilmesi gerekebilir. Kur oranı nın içi güvenilirlik zayıfsa, ek eğitim veya farklı bir skorer gerekebilir.
5. İstatistiksel hususlar
- Uygun olduğu şekilde istatistiksel analizler yap. Normallik varsayımlarını ihlal etmeyen ancak her fare için birden çok malzeme kullanan (yani, özneler arası bir etki) veri için, varyans (ANOVA) karışık bir çözümlemesi kullanın.
- Ek dosya olarak sağlanan kodları kullanıyorsanız, lütfen komutdosyası 27,28,29,30'dabelirtilen ek eklenti paketlerini indirin.
- Sağlanan komut dosyasını kullanarak karışık bir ANOVA yürütüyorsanız, geniş biçimli veri dosyalarını uzun biçimli olarak dönüştürmek için komut dosyasını çalıştırın (örneğin, Sütunlar arasında yinelenen değişkenler yerine hücreleri Satırlar arasında yinelemek üzere dönüştürün). Bir veri dosyasının geniş biçimden uzun biçime nasıl dönüştürüldüğünü göstermek için bu el yazmasına örnek bir veri dosyası eklenir.
- Karışık ANOVA'yı komut dosyasında belirtildiği gibi gerçekleştirin. Sphericity Mauchly testi ihlal edilirse, o zaman Sera-Geisser düzeltme gibi düzeltme faktörleri uygulamak unutmayın.
- Kodlama komut dosyasında belirtildiği gibi, 2'den fazla düzeyi olan faktörler arasındaki farklılıkları incelemek için gerekli posthoc testleri yapın. Bu örnekte, farklı yuvalama malzemesi türlerini karşılaştırmak için Bonferroni posthoc testleri gerçekleştirin.
NOT: Yalnızca bir iç içe geçme malzemesi kullanıyorsanız, özneler içinde bir faktör dahil etmeyin. Ancak, birden çok zaman noktasında veri topluyorsanız, bu tekrarlanan önlemleri, özneler içinde bir faktörün düzeyleri gibi birleştirin.
NOT: Bazı durumlarda, wildtype fareler mükemmel puanları olabilir ve böylece normal olmayan bir dağılım2yol açan, bir tavan etkisi sergileyecek. Verileri analiz ederken uygun istatistiksel testleri (örneğin, merkezi eğilim ve dağılıma yönelik alternatif ölçülerle parametrik olmayan testler), normalleştirme yöntemlerini veya sağlam yaklaşımları (tekrarlanan önlemler için karışık etkiler modellemesi) göz önünde bulundurun.
Representative Results
Yabani tip ve APOE e4 farelere sağlanan dört farklı yuvalama materyalinin sonuçları aşağıdaki gibi açıklanmıştır. Mevcut kriterlere göre, ICC dört iç içe malzeme (parçalanmış kağıt ICC = 0,94; kare ICC = 0,91; yatak ICC = 0,87; büküm ICC = 0,87) için her üç kodlayıcı arasında güçlü bir anlaşma gösterdi; bu nedenle, sağlanan her malzeme için tek bir puan oluşturmak için üç puan birlikte ortalamaedildi. A 2 x 4 karışık ANOVA genotip, F(1, 19) = 31.30, p < 0.01, ηp2 = 0.62 önemli bir ana etkisi ortaya çıkar. Sağlanan dört malzemede yaban tipi fareler yuva kalitesinde (3,18 ± 0,20) APOE e4 farelerine (1,98 ± 0,16) göre daha yüksek puan aldı. Buna ek olarak, karışık ANOVA malzemenin önemli bir ana etkisi, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, ηp2 = 0,75 verdi. Bonferroni düzeltmesi ile yapılan çift eşli karşılaştırmalar, parçalanmış kağıdın (4,11 ± 0,20) kare (1,95 ± 0,21), yatak (2,21 ± 0,21) veya büküm (1,94 ± 0,20) malzemeden önemli ölçüde daha yüksek(p < 0,05) olarak derecelendirilmediğini ve hiçbir malzemenin kare, yatak ve büküm malzemeleri arasındaki farklar (tüm p > 0.99). Genotip ve malzeme arasında anlamlı bir etkileşim yoktu. Veriler Şekil 3'tegösterilmiştir.
Laboratuvarımızdan yapılan diğer deneyler alzheimer hastalığının erken başlangıçlı modellerinde de benzer sonuçlar vermiştir. Örneğin, Şekil 4'tegösterildiği gibi, 5,5 aylık P301L rTg4510 (htau) fareler, yaşla eşleşen yabani tip benzerlerine göre parçalanmış kağıttan önemli ölçüde daha kötü yuvalar inşa ettiler31. Aynı şekilde, çift J20 (hAPP)/htau ve tek htau fareler, yabani tipi ve CAMKIIa-organizatörü sadece muadilleri ile karşılaştırıldığında parçalanmış kağıt tan daha yoksul yuvalar inşa, hem de 3.5- ve 7-aylıkyaş 32 (veri gösterilmedi).
Şekil 3: Yabani tip ve APOE e4 farelere sağlanan farklı malzemelerden yapılmış yuvaların nominal kalitesi. Genotipin (*p < 0.01) ana etkisi, yabani farelerin apoe e4 farelere kıyasla parçalanmış kağıt, preslenmiş pamuk kareler, kağıt büküm ve yumuşak cob yatak takımlarından yapılan daha iyi yuvalar inşa ettiğini göstermiştir. Malzemenin ana etkisi (**p < 0.01) ayrıca parçalanmış kağıttan inşa edilen yuvaların diğer üç malzemeye göre daha yüksek kalitede olduğunu göstermiştir. Parçalanmış kağıt, ICC tarafından değerlendirilen en yüksek oranlar arası güvenilirlik ölçütüne sahipti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yabani tip ve htau fareler tarafından, çinko su üzerinde veya dışında inşa edilmiş parçalanmış kağıt yuvaları. (A) 5,5 aylık yabani tip ve htau fareler tarafından inşa edilen temsili yuvalar, kontrol (musluk) su veya su milyonda 10 parça ile takviye çinko (Alzheimer hastalığına karışmış bir biyometal). Yuvalar belirtilen kriterler kullanılarak 1 - 5 ölçeğinde puanlandırıldı. Soldan sağa: wildtype + çinko su (4.54±0.52); wildtype + kontrol suyu (4.15±0.80); htau + kontrol suyu (3.08 ± 0.64); htau + çinko su (2.46±0.97). (B) Bir genotip*su etkileşimi, çinko su üzerindeki htau farelerinin diğer gruplara göre önemli ölçüde daha kötü yuvalar inşa ettiğini göstermiştir (*); buna ek olarak, basit etkileri çinko su htau fareler kontrol su üzerinde htau fareler daha kötü yuvalar inşa gösterdi. Kontrol su ve çinko su inşa yuvaları üzerinde Wildtype fareler yüksek ve benzer kalitede, htau meslektaşları ile karşılaştırıldığında. Journal of Alzheimer hastalığı, Vol 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, Çinko Şiddetlendirir Tau Patoloji bir Tau Mouse Modeli, 671-630, Telif Hakkı (2018), IOS Press31izni ile reprinted . Yayın, http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151 aracılığıyla IOS Press'te yayına mevcuttur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Ek Kodlama Dosyası – iç içe. R Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Dosya 2: AD Study nesting scores.csv Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Discussion
Yuvalama evrimsel açıdan önemli bir kemirgen davranışıdır ve farelerde günlük yaşam ve genel esenlik aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır2. Testi yürütme kolaylığı, güvenilirliği ve yüz geçerliliği yuvalama, sirkadiyen ritim ve tımar gibi birçok davranışsal testin pratik bir tamamlayıcısı haline gelir. Ancak, iç içe geçme laboratuvarda daha yaygın olarak kullanılmaya devam ettikçe, iç içe geçme artışını gerçekleştirmek, ölçmek ve yorumlamak için çeşitli kombinasyonlar kullanılır. Bu nedenle, daha fazla araştırma yuvalama için en iyi metodolojik ve pratik olarak sağlam prosedürleri keşfetmek için gereklidir, bu nedenle, test geçerliliği ve güvenilirliği maliyetler, test zamanı ve test yükünü azaltan diğer prosedürler için feda edilmez .
Yuva oluşturma kalitesi, sağlanan yatak tipine ve genotiplere karşı gerçekten hassastır. Genel olarak, yabani fareler yuvalama malzemesi ne olursa olsun APOE e4 farelere göre önemli ölçüde daha iyi yuvalar inşa; ancak, hem wildtype hem de APOE e4 fareler diğer üç yuvalama malzeme ile karşılaştırıldığında parçalanmış kağıt tan önemli ölçüde daha kaliteli yuvalar inşa. Diğer çalışmalar parçalanmış kağıt ile ilgili doğrulayıcı kanıt sağlar: fareler preslenmiş pamuk kareler, doku ve aspen yatak33ile daha parçalanmış kağıt şeritler dışında daha karmaşık yuvalar inşa . Ayrıca, parçalanmış kağıt şeritleri dışında inşa yuvaları nitel olarak daha "natüralist" bu yuva kendisi şekli ve yuva boşluğu çevresindeki duvarların yüksekliği ile karakterize diğer malzemelerden yapılmış daha olarak değerlendirilmiştir bir kubbe oluşturmak için sipariş6,33. Bu nedenle, bu test için uygun malzeme seçimi daha iyi nispeten kontrollü bir ortamda doğal davranış gözlemlemek için önemlidir, yani, laboratuvar ayarı. Daha da önemlisi, bu protokol 9 -12 aylıkken yuvalamayı bir kez değerlendirmiş olsa da, yuvalamanın birkaç yaşta yapılması gerektiğini vurguluyoruz. Bu protokolün basitliği, ideal olarak nörodejenerasyona eşlik eden açıkların başlangıcından önce birkaç kez yapılmasına izin verir. Tekrarlanan ölçümler, azalmış yuvalama yeteneğinde nörodejenerasyonun olası nedensel rolünü belgeleme fırsatı nı karşılar.
Doğal yuva oluşturma farklı arka plan suşları fareler arasında farklı olduğu gösterilmiştir34, ve bu nedenle, genel kalite ve yuva şekli ilgi transgeni nedeniyle farklı olabilir, ama arka plan zorlanma nedeniyle. Örneğin, C57BL/6 farelerinin ataları "delik" nesters olarak kabul edilirken, BALB/C farelerinin ataları "yüzey" nesters35olarak kabul edildi. C3H arka plan üzerinde fareler veya bu tür ile haçlar, graybeal ve ark kullanılan E4 ile hibrid C3H/He-C57BL/6 gibi9 da kötü nesters olarak kabul edilir; bu nedenle, araştırmacılar kuvvetle transgenik fareler ile aynı arka plan üzerinde kontrol fareleri kullanarak düşünmelisiniz, hangi genel transgen doğrudan artıracak(lar), arka plan yerine, nörodejenerasyon ve yuva sonraki açıkları davranış oluşturma.
Bazı deneyler genellikle yuvanın karmaşıklığını niteliksel olarak yargılamak için tek bir golcü kullanır; ancak, daha fazla golcü ler ve daha da önemlisi, golcüler deneysel koşullara kör dahil etmek için argüman olun. Bu yaklaşım la, üç bağımsız, kör golcü ve temel eğitim ile, yüksek sınıflar arası güvenilirlik göstergesi olan yüksek sınıf içi korelasyon lar elde golcüler arasındaki anlaşmayı değerlendirmek için bir sınıf içi korelasyon kullandık. ve yuva kalitesi ile ilgili güçlü bir anlaşma. Ayrıca, rendelenmiş kağıt ve pamuk karelerden oluşan yuvaların puanları en yüksek sınıf içi korelasyona sahipti, bu da daha güçlü bir anlaşmanın ve golcüler arasında daha fazla tutarlılığın göstergesidir. Güçlü anlaşma aynı zamanda birden fazla puanın birlikte ortalamasını almak için de gerekçe sağlar, davranışsal araştırmalarda gelişigüzel uygulanan bir strateji. Bu strateji daha fazla birey ve muhtemelen yuva ları puanlamak için daha fazla zaman gerektirmesine rağmen, yuvalama gibi nitel değerlendirmelerde önyargıyı etkili bir şekilde azaltır.
Bu testte kullanılan yuvalama malzemeleri yumuşak cob yatak dışında fiyat olarak yaklaşık eşitti. Yuvalama için ticari yataklar bazı deneyciler için ekonomik açıdan becerikli olabilir; ancak, Martin ve ark.15 not pamuk kareler, buruşuk kağıt gibi diğer malzemelerle karşılaştırıldığında, satın almak için mevcut en pahalı malzemelerden biri. Bu kolay kullanılabilirlik, depolama ve yönetim nedeniyle olabilir, ancak diğer araştırmacılar benzer geçerli ve güvenilir malzemeler için tercih edebilir, özellikle bir tesiste hayvanların çok sayıda meydan, yuvalama denemeleri sayısı, zaman kısıtlamaları puanlama yuvaları ve yüksek kafes maliyetleri. Böylece, parçalanmış kağıt daha uygun ve uygun bir seçenek olabilir. Buna ek olarak, yöntemimiz için veri yakalama hemen yapılabilir (yani, bizzat puanlama), fotoğraflar kayıt için yüksek düşünülmelidir rağmen, kaydetmek ve yuvaları yeniden ölçmek için, inter-ve intra-rater değerlendirmek amacıyla istenirse daha sonraki zamanlarda güvenilirlik. Belirtildiği gibi, bu metodolojik olarak sağlam prosedürler genellikle göz ardı edilir gibi, anlaşma için değerlendirmek için "test, yeniden test" uygulamaları için birden fazla golcü dahil vurgulamak.
Sonuç olarak, bu değerlendirmeiçin metodoloji ve istatistiksel hususların (örn. sınıf içi korelasyon) farelerde yaşam kalitesini, genel refahı nı ve günlük yaşam faaliyetlerini değerlendiren deneyleriçin ilgi çekici olabileceğine inanıyoruz.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz Kevin Quant, Mario Martinez ve Edwin Portillo yuvaları puanlama için teşekkür etmek istiyorum, Rachel Barkey filme hazırlık yardımcı olmak için, ve Stephen Lippi ve Deborah Neely bu el yazması redreading için. Ayrıca bu deney için kafeslerin maliyetlerini karşılamak için Psikoloji Bölümü teşekkür etmek istiyorum, ve Krasnow Enstitüsü Hayvan Tesisi bekçileri destek için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
| Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
| Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
| Mouse - APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
| Mouse - C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
| Mouse - J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
| Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) -- "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
| Soft Cob | Envigo | 7087C |
References
- Torres-Lista, V., Gimenez-Llorta, L. Impairment of nesting behavior in 3cTg-AD mice. Behavioural Brain Research. 247, 153-157 (2013).
- Deacon, R.
- Hess, E., Petrovich, S., Goodwin, E. Induction of Parental Behavior in Japanese Quail. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 90 (3), 244-251 (1976).
- Deacon, R. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 132, 203-213 (2002).
- Deacon, R. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139, 139-155 (2003).
- Gaskill, B. N., Karas, A. Z., Garner, J. P., Pritchett-Corning, K. R. Nest building as an indicator of health and welfare in laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (82), 51012 (2013).
- Mayeux, R., Stern, Y.
- Boggs, K. N., Kakalec, P. A., Smith, M. L., Howell, S. N., Flinn, J. M. Circadian wheel running behavior is altered in an APP/E4 mouse model of late onset Alzheimer's disease. Physiology and Behavior. 182, 137-142 (2017).
- Graybeal, J. J., et al. Human ApoE ε4 alters circadian rhythm activity, IL-1β, and GFAP in CRND8 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 43 (3), 823-834 (2015).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Zhou, L., Gao, Q., Nie, M., Gu, J. L., Hao, W., Wang, L., Cao, J. M. Degeneration and energy shortage in the suprachiasmatic nucleus underlie the circadian rhythm disturbance in ApoE-/- mice: Implications for Alzheimer's disease. Scientific Reports. 6, 36335 (2016).
- Deacon, R., et al. Age-dependent and -independent behavioral deficits in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 189, 126-138 (2008).
- Filali, M., Lalonde, R., Riverst, S. Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 begenic model of Alzheimer's disease. Genes, Brain and Behavior. 8, 143-148 (2009).
- Robinson-Junker, A., Morin, A., Protchett-Corning, K., Gaskill, B. Sorting it out: Bedding particle size and nesting material processing method affects nest complexity. Laboratory Animals. 51 (2), 170-180 (2017).
- Martin, T., Balser, S., Young, G., Lewis, S. Cost and effectiveness of commercially available nesting substrates for Deer Mice (Peromyscus maniculatus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 412-418 (2016).
- Crossland, J. P., et al. Caring for Peromyscus spp. in research environments. Lab Animal. 43 (5), 162-166 (2014).
- Eisenberg, J. Studies on the Behavior of Peromyscus maniculatus gambelii and Peromyscus californicus parasiticus. Behaviour. 19 (3), 177-207 (1962).
- Joyner, C. P., Myrick, L. C., Crossland, J. P., Dawson, W. D. Deer mice as laboratory animals. ILAR Journal. 39 (4), 322-330 (1998).
- Neely, C., Lane, C., Torres, J., Flinn, J. The Effect of gentle handling on depressive-like behavior in adult male mice: Considerations for human and rodent interactions in the laboratory. Behavioural Neurology. , 2976014 (2018).
- Van Loo, P. L., Mol, J. A., Koolhaas, J. M., Van Zutphen, B. F., Baumans, V. Modulation of aggression in male mice: Influence of group size and cage size. Physiology & Behavior. 72 (5), 675-683 (2001).
- Kappel, S., Hawkins, P., Mendl, M. T. To group or not to group? Good practice for housing male laboratory mice. Animals. 7 (12), 88 (2017).
- Gamer, M., Lemon, J., Fellows, I., Singh, P. Irr: Various coefficients of interrater reliability and agreement. R package version 0.84. , Available from: http://CRAN.R-project.org/package=irr (2012).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Boston, MA. Available from: http://www.rstudio.com/ (2016).
- Cicchetti, D. V. Guidelines, criteria, and rules of thumb for evaluating normed and standardized assessment instruments in psychology. Psychological Assessment. 6 (4), 284-290 (1994).
- Hallgren, K. A. Computing inter-rater reliability for observational data: An overview and tutorial. Tutorials in Quantitative Methods for Psychology. 8 (1), 23-34 (2012).
- McGraw, K. O., Wong, S. P. Forming inferences about some intraclass correlation coefficients. Psychological Methods. 1 (1), 30-46 (1996).
- Ahlmann-Eltze, C. ggsignif: Significance Brackets for 'ggplot2'. R package version 0.5.0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggsignif (2019).
- Lawrence, M. A. ez: Easy Analysis and Visualization of Factorial Experiments. R package version 4.4-0. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ez (2016).
- Lenth, R. V. Least-Squares Means: The R Package lsmeans. Journal of Statistical Software. 69 (1), 1-33 (2016).
- Wickham, H. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
- Craven, K. M., Kochen, W. R., Hernandez, C. M., Flinn, J. M. Zinc exacerbates tau pathology in a tau mouse model. Journal of Alzheimer's Disease. 64, 617-630 (2018).
- Lippi, S. L., Smith, M. L., Flinn, J. M. A novel hAPP/htau mouse model of Alzheimer's Disease: Inclusion of APP with tau exacerbates behavioral deficits and zinc administration heightens tangle pathology. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 382 (2018).
- Hess, S. E., et al. Home improvement: C57BL/6J mice given more naturalistic nesting materials build better nests. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 47 (6), 25-31 (2008).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Van Oortmerssen, G. Biological significance, genetics and evolutionary origin of variability in behaviour within and between strains of mice (Mus musculus). A behavior genetic study. Behaviour. 38 (1), 1-92 (1971).
