Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Resumen

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Resumen

Los macrófagos son células fagocíticas especializadas en la detección de moléculas de origen no propio. Con este fin, están equipados con una gran variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Desafortunadamente, esto también hace que los macrófagos sean particularmente difíciles de transfectar, ya que el reactivo de transfección y los ácidos nucleicos transinfectados a menudo son reconocidos por los PRR como no-yo. Por lo tanto, la transfección a menudo resulta en la activación de macrófagos y la degradación de los ácidos nucleicos transinfectados o incluso en el suicidio de los macrófagos. Aquí, describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios murinos como macrófagos peritoneales (PM) y macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con ARNm en vitro transcrito a partir de plantillas de ADN como plásmidos. Con este sencillo protocolo, se alcanzan tasas de transfección de aproximadamente 50-65% para PM y de aproximadamente 85% para BMDM sin citotoxicidad ni inmunogenicidad observada. Describimos en detalle la generación de ARNm para la transfección a partir de construcciones de ADN como plásmidos y el procedimiento de transfección.

Introducción

Los macrófagos son células fagocíticas que se especializan en la detección, ingesta y degradación de microbios, células apoptóticas y desechos celulares. Además, ayudan a orquestar las respuestas inmunitarias secretando citoquinas y quimioquinas y presentando antígenos a las células T y células B. Los macrófagos también desempeñan un papel importante en numerosos otros procesos, como la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la tumorigenesis y la obesidad.

Para poder detectar moléculas no propias, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) y las moléculas fuera de lugar, como los patrones moleculares asociados al daño ....

Protocolo

El aislamiento de macrófagos de ratones se realizó de conformidad con la Ley de Protección Animal de Alemania en cumplimiento con el Comité de ética de la Universidad de Colonia.

NOTA: Lleve a cabo todos los pasos con guantes. Llevar a cabo todos los pasos de transfección bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las células. Antes de trabajar con ARNm, limpie todos los instrumentos, como pipetas y todas las superficies con un 70% de etanol y/o un tensioactivo degradante de la ANR(Tabla de materiales). Asegúrese de que todos los tubos de reacción estén libres de ARSa y estériles. Uti....

Resultados

Hemos utilizado con éxito este protocolo para generar codificación mRNA para las variantes ETIQUETADAs por FLAG NEMO e IKK para la transfección de macrófagos primarios¹⁶. La codificación de plásmidos para el tipo salvaje con etiqueta FLAG (NEMO^WT) y C54/347A mutante NEMO (NEMO^C54/374A) (véase la Tabla de Materiales) ya contienen un promotor T7 en la orientación correcta(Figura 1A).......

Discusión

Aquí presentamos un protocolo para la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios generalmente difíciles de transfectar con ARNm transcrito in vitro. Es importante destacar que la transfección de los macrófagos utilizando este protocolo no induce la muerte celular ni activa la señalización proinflamatoria, lo que indica que ni el reactivo de transfección ni el ARNm transfectóse se reconocen como no autónomos.

La calidad del ARNm es de vital importancia para el éxito de la transfec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-metil-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	almacenado a -20 ° C
Fosfatasa antártica	New England BioLabs	M0289	almacenada a -20 ° C
Tampón de reacción de fosfatasa antártica (10x)	New England BioLabs	B0289	almacenado a -20 ° C
anti-NEMO/IKKγ anticuerpo	Invitrogen	MA1-41046	almacenado a -20 ° C
, anticuerpo anti-β-actina	Sigma-Aldrich	A2228	almacenado a -20 ° C
Placas de Petri de 92,16 mm con levas	Sarstedt	821.473	almacenadas en RT
CD11b Microbeads ratón y humano	Miltenyi Biotec	130-049-601	almacenadas a 4 & grados; C
Cre recombinasa + T7-Promotor cebador delantero	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, almacenado a -20 ° C
Cre recombinasa + T7-Promotor cebador inverso	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, almacenado a -20 ° Kit
purificación de ADN C: QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28104	almacenado en RT
eGFP + T7-Promotor forward primer	Sigma-Aldrich		5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGGCACCATGGTG AGCAAGG-3´, almacenado a -20 ° C
eGFP + T7-Promotor imprimación inversa	Sigma-Aldrich		5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, almacenado a -20 ° C
Tampón de digestión rápida (10x)	Thermo Scientific	B64	almacenado a -20 & grados; C
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684	almacenado a -20 ° C
Polimerasa de alta fidelidad con corrección: Q5 ADN-polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs Inc	M0491S	almacenada a -20 & grados; C
IKKβ + T7-Promotor imprimación delantera	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, almacenado a -20 ° C
IKKβ + T7-Promotor imprimación inversa	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, almacenado a -20 ° C
In vitro kit de transcripción de ARNm: Kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (con cola de poliA)	New England BioLabs	E2060	almacenado a -20 & grados; C
LS Columnas	Miltenyi Biotec	130-042-401	almacenadas en RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	almacenadas en RT
tampón de transfección de ARNm y reactivo: jetMESSENGER	Polyplus transfection	409-0001DE	almacenado a 4 & grados;
C Mutante IKKβ El plásmido IKK-2S177/181E	Addgene	11105	almacenado a -20 ° Mutante C
NEMOC54/347A plásmido	Addgene	27268	almacenado a -20 ° C
pEGFP-N3 plásmido	Addgene	62043	almacenado a -20 ° C
poly(I:C)	Calbiochem	528906	almacena a -20 °
		pPGK-Cre	F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nuevas variantes de la recombinasa Cre inducible: Un nuevo mutante de la proteína de fusión Cre-PR exhibe una sensibilidad mejorada y un rango ampliado de inducibilidad. Ácidos nucleicos Res. 29, 47e (2001). almacenado a -20 ° C
pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	almacenado a -20 ° C
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976	almacenado en RT
Anticuerpo CD11b anti-ratón, conjugado con APC	BioLegend	101212	almacenado a 4 & grados; C
Anticuerpo F4/80 anti-rata anti-ratón, conjugado con PE	eBioscience	12-4801-82	almacenado a 4 & grados; C
M-CSF recombinante	Peprotech	315-02	almacenado a -20 °
Kit de purificación de ARN C: Kit de limpieza de transcripción MEGAclear	ThermoFisher Scientific	AM1908	almacenado a 4 & grados;
Tensioactivo degradante de ARNasa C: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020	almacenado en RT
LPS ultrapuro de E.coli O111:B4	Invivogen		almacenado a -20 ° C
Tipo salvaje IKKβ plásmido	Addgene	11103	almacenado a -20 ° C
Plásmido NEMO de tipo salvaje	Addgene	27268	almacenado a -20 ° C

de Plásmido C